僵蠶抗凝成分仿生提取液的氨基酸序列分析

張琳，李玥，張玉娟

(山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250014)

僵蠶，別名天蟲、姜蠶，又名白僵蠶，為蠶蛾科昆蟲家蠶(BombyxmoriL.)4～5齡的幼蟲感染(或人工接種)白僵菌[Beauveriabassiana(Bals.)Vuill ant]而致死的干燥體。僵蠶具熄風(fēng)解痙、化痰散結(jié)、祛風(fēng)止痛、活血通絡(luò)等多種功效,目前多用于治療癲癇、頑固性頭痛等疾病?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)證實(shí)，其水提取液有較強(qiáng)的抗凝、抗血栓、促纖溶等作用，其主要活性成分可能為草酸銨、蛋白質(zhì)(或多肽)或氨基酸等[1-5]。有文獻(xiàn)報(bào)道[6-7]，白僵蠶水解后含有 17種氨基酸，甘氨酸Gly最高，其次為丙氨酸Ala、絲氨酸Ser和蘇氨酸Tyr，而精氨酸Arg最低；另有報(bào)道稱，僵蠶水解液中共有15種氨基酸殘基，其中谷氨酸Glu殘基最高，其次為精氨酸Arg、丙氨酸Ala和甘氨酸Gly，而蛋氨酸Met含量最低。

20世紀(jì)90年代，仿生提取法既已用于天然藥物以及中藥的輔助提取。在已有的動(dòng)物藥提取工藝研究中，水蛭仿生酶提取法與水提法相比，其提取液的抗凝活性更強(qiáng)；土鱉蟲仿生酶解技術(shù)提取更充分，提取物活性更強(qiáng)；僵蠶粉末仿生胃液中化學(xué)成分的溶出性能優(yōu)于煎液[8-11]。為進(jìn)一步探究僵蠶的抗凝活性成分，本研究以抗凝活性為指標(biāo)，通過試驗(yàn)篩選出提取僵蠶的最佳工藝流程，然后采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)平臺(tái)對(duì)僵蠶仿生提取液的抗凝成分結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步分析，為僵蠶抗凝活性成分的進(jìn)一步研究提供基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥材 僵蠶，市售，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院張學(xué)順教授鑒定為蠶蛾科昆蟲家蠶(BombyxmoriL.)4～5齡的幼蟲感染白僵菌而致死的干燥體。

1.2 儀器 液相質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(美國(guó)Thermo Fisher UltiMate 3000液相色譜系統(tǒng)和Thermo Fisher Q Exactive高分辨率質(zhì)譜)；電子天平(01193-YP601N 型，上海精密科學(xué)儀器有限公司)；高速離心機(jī)(d-37520，Thermo Electron LED GmbH Osterode)；pH計(jì)(PB-10，Sartorius)；磁力加熱攪拌器(78-1型，金壇市杰瑞爾電器有限公司)；水浴恒溫振蕩器(SHZ-82型，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)；電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)。

1.3 試劑 胃蛋白酶(1∶1200，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20130913)；甲酸、乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法

2.1 僵蠶提取方法 精密稱取僵蠶粉末5 g，胃蛋白酶0.667 g ，加水150 mL(加鹽酸調(diào)節(jié)至pH 2.0)，于(47±1)℃水浴提取2 h，濾過、濃縮至生藥量100 mg·mL-1。濃縮后提取液以3 000 rpm轉(zhuǎn)速離心15 min，取上清液用超純水定容至50 mL，即得僵蠶胃蛋白酶提取液。

2.2 HPLC-MS/MS分析測(cè)定

2.2.1 供試品的制備 按照“2.1”項(xiàng)下胃蛋白酶提取法得僵蠶提取液，超濾后得相對(duì)分子量為500～1 000的樣品，0.22 μm濾膜、過濾，即得供試品溶液。

2.2.2 色譜條件 色譜柱Halo C18柱(2.1 mm×100 mm,2.7 μm)；流速0.3 mL·min-1；柱溫45 ℃，進(jìn)樣室：4 ℃；流動(dòng)相(A：0.05%甲酸-水溶液；B：0.05%甲酸-乙腈溶液)。線性梯度洗脫條件：0～25 min：5%B～20%B；25～40 min：20% B～50% B；40～41 min：50%B～99%B；41～45 min：99%B；45～45.01 min：99%B～5%B；45.01～55 min：5%B。

2.2.3 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(electrosprayionization,ESI)正離子模式全掃描檢測(cè)，噴霧電壓：3.0 kV；鞘氣流速：45 arb；輔助氣流速：10 arb；；輔助氣耐熱溫度：30 ℃；離子傳輸管溫度：275 ℃；質(zhì)譜分辨率：70 000 FWHM(m/z 200)；自動(dòng)增益控制AGC：3e6；最大注入時(shí)間IT：200 ms；全掃描質(zhì)量范圍為100～1 200；二級(jí)質(zhì)譜碰撞能為30%。

3 僵蠶胃蛋白酶提取液液相色譜質(zhì)譜分析

圖1A和圖1B分別為僵蠶酶解液的總離子流TIC和蛋白多肽圖，由圖可知，僵蠶提取液的酶解多肽類成分主要分布在42～47 min。

現(xiàn)對(duì)總離子流圖中42.82 min(Ⅰ)、43.22 min(Ⅱ)、44.34 min(Ⅲ)、46.33 min(Ⅳ)4個(gè)色譜峰進(jìn)行氨基酸序列解析。根據(jù)精確質(zhì)量數(shù)掃描結(jié)果，圖2～5一級(jí)質(zhì)譜圖中離子m/z 1 012、m/z 1 155、m/z 969.2、m/z 1 180均為單電荷離子。根據(jù)氮律及氨基酸殘基分子量推斷，多肽Ⅰ為相對(duì)分子質(zhì)量為1 011的九肽，多肽Ⅱ?yàn)橄鄬?duì)分子質(zhì)量為1 154的十肽，多肽Ⅲ為相對(duì)分子質(zhì)量為968.2的八肽，多肽Ⅳ為相對(duì)分子質(zhì)量為1 179的十肽[6～9]。

根據(jù)多肽Ⅰ的一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜疊加圖(見圖2)中的特異性碎片離子m/z 1 012、m/z 638.6、m/z 466.7、m/z 187.9，推斷Ⅰa離子有5種情況：一分子甘氨酸Gly(75 Da)、一分子丙氨酸Ala(89 Da)、兩分子天冬酰胺Asn(132 Da)；一分子甘氨酸Gly(75 Da)、一分子丙氨酸Ala(89 Da)、一分子纈氨酸Val(117 Da)、一分子谷氨酸Glu(147 Da)；一分子甘氨酸Gly(75 Da)、一分子丙氨酸Ala(89 Da)、一分子亮氨酸Leu(131 Da)或異亮氨酸Ile(131 Da)、一分子天冬氨酸Asp(133 Da)；兩分子甘氨酸Gly(75 Da)、一分子亮氨酸Leu(131 Da)或異亮氨酸Ile(131 Da)、一分子谷氨酸Glu(147 Da)；兩分子甘氨酸Gly(75 Da)、一分子賴氨酸Lys(146 Da)或谷氨酰胺Gln(146 Da)、一分子天冬酰胺Asn(132 Da)。Ⅰb離子為一分子脯氨酸Pro(115 Da)、一分子甘氨酸Gly(75 Da)組成。Ⅰc離子有3種情況：一分子丙氨酸Ala(89 Da)、一分子絲氨酸Ser(105 Da)、一分子半胱氨酸Cys(121 Da)；一分子甘氨酸Gly(75 Da)、一分子蘇氨酸Thr(119 Da)、一分子半胱氨酸Cys(121 Da)；三分子絲氨酸Ser(105 Da)。

綜上所述，采用同樣的方法根據(jù)圖3～5對(duì)多肽Ⅱ、多肽Ⅲ、多肽Ⅳ進(jìn)行肽鏈結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果見表1。

4 結(jié)論和討論

4.1 近幾年來，由1～10個(gè)氨基酸組成的寡肽已經(jīng)引起了廣泛的研究和重視，寡肽可直接參與組織蛋白的合成，具有免疫、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等多種藥理作用，而且人體各臟器也可完整的利用寡肽。通過對(duì)僵蠶胃蛋白酶提取液的LC-MS/MS檢測(cè)，根據(jù)所得的質(zhì)譜圖，我們對(duì)僵蠶酶解多肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步的推斷，認(rèn)為僵蠶胃蛋白酶提取液中主要的抗凝活性成分為氨基酸數(shù)低于10的寡肽。

表1 酶解多肽的氨基酸序列分析

4.2 本研究在氨基酸序列推斷中發(fā)現(xiàn)，僵蠶胃蛋白酶提取液中可以確定含有的氨基酸有Gly、His、Asn、Ala、Met、Pro、Ile/Leu、Glu、Cys、Asp、Tyr，這與文獻(xiàn)報(bào)道的僵蠶水提液氨基酸組成存在一定的差異性[6-7]。課題組已通過體內(nèi)外藥理實(shí)驗(yàn)證實(shí)僵蠶仿生酶提取液比水提液具有更高的抗凝活性，其中胃蛋白酶提取法最優(yōu)。因此推測(cè)胃蛋白酶提取液與水提液抗凝活性差異不僅是因?yàn)槿艹鲈龆?，同時(shí)也因?yàn)槊附庾饔卯a(chǎn)生了新的活性多肽。

4.3 目前串聯(lián)質(zhì)譜法已成為多肽類藥物氨基酸序列測(cè)定的主要工具，但高分辨準(zhǔn)確質(zhì)量的碎片離子峰是測(cè)序的關(guān)鍵，多肽樣品的穩(wěn)定是測(cè)序的前提。本研究在采用串聯(lián)質(zhì)譜手動(dòng)分析法進(jìn)行多肽氨基酸的測(cè)序過程中，由于離子信息的不完整，存在無法鑒別的碎片離子峰，同時(shí)也可能由于多肽的不穩(wěn)定性，導(dǎo)致多肽樣品氨基酸序列未能最終確定。隨著相關(guān)測(cè)序軟件的完善及質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展，串聯(lián)質(zhì)譜法在多肽結(jié)構(gòu)分析中將發(fā)揮更大的作用，我們也將采用新的技術(shù)對(duì)活性多肽的結(jié)構(gòu)進(jìn)行更加深入的分析。