田蔥抗氧化活性組分篩選與低極性成分GC/MS分析

孫雪萍 劉振杰 譚小明 柴玲 劉布鳴

[摘要] 目的 篩選廣西特色壯藥田蔥抗氧化活性組分，研究田蔥低極性部位的化學(xué)成分。 方法 田蔥乙醇粗提物浸膏分別用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇對(duì)粗提物進(jìn)行萃取得到相應(yīng)有機(jī)相組分。運(yùn)用酶標(biāo)儀考察田蔥粗浸膏和各個(gè)有機(jī)相浸膏對(duì)ABTS自由基、DPPH自由基、超氧陰離子自由基和羥自由基的清除能力，對(duì)石油醚部位成分進(jìn)行氣相色譜法-質(zhì)譜法聯(lián)用（GC-MS）分析，運(yùn)用峰面積歸-化法計(jì)算各成分的相對(duì)百分含量。 結(jié)果 田蔥各萃取相均有一定的抗氧化活性，其中乙酸乙酯相抗氧化活性較好，清除ABTS、DPPH和超氧陰離子自由基的IC50值分別為697.7、742.2 μg/mL和705.8 μg/mL，與陽性對(duì)照維生素E的IC50值相當(dāng)。GC-MS方法從田蔥石油醚相中分析鑒定了41個(gè)化合物，有機(jī)酸類含量最多（53.59%）。 結(jié)論 田蔥低極性部位主要成分為不飽和脂肪酸、萜類和甾體類，所有化合物均為首次從田蔥中發(fā)現(xiàn)。體外抗氧化活性較好的組分主要集中于乙酸乙酯相，為田蔥作為天然抗氧化劑的應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞] 田蔥;抗氧化;氣相色譜法-質(zhì)譜法聯(lián)用;化學(xué)組成

[中圖分類號(hào)] R284? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2020）05（a）-0045-06

Screening of antioxidant active components and the GC-MS analysis of the low polar components from Philydrum lanuginosum Banks et Sol. ex Gaertner

SUN Xueping1? ?LIU Zhengjie1? ?TAN Xiaoming1? ?CHAI Ling2? ?LIU Buming2

1.College of Pharmacy， Guangxi University of Chinese Medicine， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Nanning? ?530200， China; 2.Guangxi Key Laboratory of Tradtitonal Chinese Medicine Quality Standards，Guangxi Institute of Traditional Medical and Pharmaceutical Sciences， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Nanning? ?530022， China

[Abstract] Objective To screen out the antioxidant components of Guangxi Zhuang medicine Philydrum lanuginosum Banks et Sol. ex Gaertner， and to analyze the chemical composition of the low polar components. Methods The ethanol crude extraction of Philydrum lanuginosum Banks et Sol. ex Gaertner was dispersed in water and extracted by petroleum ether，ethyl acetate and n-butanol to obtain the relative components，respectively. The antioxidant activities of the crude extraction and the organic phase extractions including ABTS，DPPH，superoxide and hydroxyl free radical scavenging ability were investigated by microplate reader. And the gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS） was used to analyze the low polar components. The relative percentage of each component was calculated by peak area normalization. Results All the extracted phases of Philydrum lanuginosum Banks et Sol. ex Gaertner had certain antioxidant activity， among which the ethyl acetate phase had better antioxidant activity， and the IC50 values of ABTS， DPPH and superoxide radical were 697.7， 742.2 μg/mL and 705.8 μg/mL respectively， which were similar to the IC50 values of positive control vitamin E. Forty-one compounds were identified by GC-MS from the petroleum ether phase of the field onion， with the highest organic acid content （53.59%）. Conclusion The main components of the low-polarity parts of Philydrum lanuginosum Banks et Sol. ex Gaertner are unsaturated fatty acids， terpenes and steroids. All compounds are first discovered from scallions. The components with better antioxidant activity in vitro are mainly concentrated in the ethyl acetate phase， which provides a research basis for the application of Philydrum lanuginosum Banks et Sol. ex Gaertner as a natural antioxidant.

[Key words] Philydrum lanuginosum Banks et Sol. ex Gaertner; Antioxidant; Gas chromatography-mass spectrometry; Chemical composition

田蔥科田蔥（Philydrum lanuginosum Banks et Sol. ex Gaertner）屬于單子葉植物，又名中蔥、剪刀鉸、水鉸剪等。我國主要分布在廣西、廣東、福建、臺(tái)灣，生長在濕地、水田、池塘和沼澤地上，是廣西特色壯藥之一[1]。據(jù)《中華本草》《中國壯藥資源明錄》[2]記載，其性味微咸（平），具清熱利濕、解毒、治水腫、熱痹、痔瘡腫毒、腳氣等功效。經(jīng)文獻(xiàn)調(diào)研可知關(guān)于田蔥的相關(guān)報(bào)道極少。目前僅Bruce等[3]對(duì)田蔥化學(xué)成分開展的研究發(fā)現(xiàn)，其含有丁香亭3-0-β-D-吡喃半乳糖甙、山柰酚3-0-二糖甙、異鼠李素3-0-葡萄糖甙、異鼠李素3-0-半乳糖甙、槲皮素3-0-葡萄糖甙、槲皮素3-0半乳糖甙、槲皮素3-0-蕓香糖甙、丁香亭3-0-二糖甙等黃酮苷類成分。未見其他有關(guān)于田蔥的物質(zhì)基礎(chǔ)與藥理活性研究報(bào)道。本研究對(duì)田蔥石油醚、正丁醇、乙酸乙酯萃取相建立以ABTS自由基、DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基清除能力為指標(biāo)的測(cè)定方法，進(jìn)行田蔥體外抗氧化活性研究，并對(duì)其清除能力進(jìn)行分析，進(jìn)而篩選出抗氧化活性較好的組分，對(duì)石油醚部位成分進(jìn)行氣相色譜法-質(zhì)譜法聯(lián)用（GC-MS）分析化學(xué)構(gòu)成，對(duì)開發(fā)和綜合利用田蔥有著重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

田蔥藥材，采自廣西防城港市大坪坡海邊沼澤地，由廣西中醫(yī)藥研究院黃云峰副研究員鑒定為田蔥（Philydrum lanuginosum Banks et Sol. ex Gaertner）。樣品標(biāo)本存放于廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院楊世林科研平臺(tái)。

1.2 試劑

ABTS（1 g/瓶，批號(hào)：619H033）、DPPH（1 g/瓶，批號(hào)：464RB-GE）、維生素E（5 g/瓶，批號(hào)：720E033）、鄰苯三酚（60 mmol/L，100 g/瓶，批號(hào)：712D022）和Tris-HCl緩沖液（50 mmol/L，pH=8.2，500 mL/瓶，批號(hào)：20181211）均由北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 儀器

PL203電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）;WJX-100高速多功能粉碎機(jī)（上海緣沃工貿(mào)有限公司）;HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）;Centrifug-e5810R臺(tái)式離心機(jī)（艾本德中國有限公司）;DLSB-5/20低溫冷卻液循環(huán)泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）;SB-800 DTD超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）;RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州世紀(jì)雙科實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）;Research plus移液槍（艾本德中國有限公司）;SYNERGY/H1酶標(biāo)儀（美國伯騰儀器有限公司）。

1.4 樣品的前處理及提取物的制備

準(zhǔn)確稱取田蔥藥材10 kg，打粉，過2號(hào)篩，加95%乙醇浸泡，超聲波輔助提取3次后進(jìn)行抽濾，過濾，收集上清液及合并，減壓回收乙醇。上清液經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)，濃縮成浸膏狀的粗提物，然后分別用石油醚（60～90℃）、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶劑后得出石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相4個(gè)不同組分的萃取相粗提物。

1.5 樣品液的配置

準(zhǔn)確稱取3份0.03 g的4個(gè)萃取相的粗提物置于燒杯中，水相用蒸餾水超聲溶解并定容至10 mL的容量瓶，石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相用無水乙醇超聲溶解并定容10 mL的容量瓶，搖勻，得到濃度為3200 μg/mL的母液。然后4個(gè)萃取相的母液依次按1600、800、400、200、100 μg/mL的濃度梯度來進(jìn)行稀釋，溶液備用。陽性對(duì)照品維生素E和樣品的濃度一樣，配置同上述樣品母液一樣。

1.6 抗氧化活性的測(cè)試

1.6.1 ABTS自由基能力的測(cè)定（ABTS法）? 參照文獻(xiàn)[4-5]方法并加以修改。用移液槍吸取不同濃度的樣品液10 μL加入到96孔板中，然后再加入190 μL的ABTS儲(chǔ)備液，混勻，避光反應(yīng)15 min后于734 nm波長下測(cè)其吸光度。水相的空白對(duì)照以等量蒸餾水代替樣品液，其他有機(jī)相的空白對(duì)照以等量無水乙醇代替樣品液。每個(gè)樣品平行3次，取平均值。計(jì)算公式如下：總抗氧化清除率（%）=（A0-A）/A0×100%。式中：A0為空白值的吸光度，A為樣品的吸光度。

1.6.2 DPPH自由基清除能力的測(cè)定? 參照文獻(xiàn)[6]方法并加以修改。用移液槍吸取50 μL不同濃度的樣品液加到96孔板中，再加入50 μL的無水乙醇，最后快速加入0.25 mmol/L的DPPH溶液中，37℃恒溫避光反應(yīng)30 min后于517 nm波長處測(cè)定其吸光度。水相的空白對(duì)照以等量蒸餾水代替樣品液，其他有機(jī)相的空白對(duì)照以等量無水乙醇代替樣品液。每個(gè)樣品平行3次，取平均值。計(jì)算公式如下：DPPH自由基清除率（%）=（A0-A）/A0×100%。式中：A0為空白值的吸光值，A為樣品的吸光值。

1.6.3 超氧陰離子自由基清除能力的測(cè)定（鄰苯三酚自氧化法）? 參照文獻(xiàn)[7]方法并加以調(diào)整。用移液槍將1 mL不同濃度的樣液加到96孔板中，再加4.5 mL的Tris-HCI緩沖液（50 mmo/L，pH 8.2），于室溫下反應(yīng)10 min后加入0.3 mL鄰苯三酚溶液（3 mmol/L），避光反應(yīng)5 min，最后加入1mL 8 mol/L的鹽酸溶液來終止反應(yīng)，于299 nm波長處測(cè)定其吸光度。水相的空白對(duì)照以等量蒸餾水代替樣液，其他有機(jī)相的空白對(duì)照以等量無水乙醇代替樣液。每個(gè)樣品平行3次，取平均值。計(jì)算公式如下：超氧陰離子自由基清除率（%）=（A-A0）/A×100%。式中A為樣品的吸光值，A0為空白的吸光值。

1.6.4 羥自由基清除能力的測(cè)定（水楊酸法）? 參照文獻(xiàn)[8]方法加以調(diào)整。用移液槍準(zhǔn)確吸取不同濃度的樣品液50 μL加到96孔板中，然后加入9 mmol/L的FeSO4溶液50 μL、9 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液50 μL，混勻，最后加入8.8 mmol/L H2O2溶液50 μL啟動(dòng)反應(yīng)體系，于37℃水浴下避光恒溫反應(yīng)1 h，在510 nm波長處測(cè)定其吸光值。水相的空白對(duì)照以等量蒸餾水代替樣品液，其他有機(jī)相的空白對(duì)照以等量無水乙醇代替樣品液。每個(gè)樣品平行3次，取平均值。計(jì)算公式如下：羥自由基清除率（%）=[1-（A1-A2）/A0]×100%。式中：A0為蒸餾水（或者無水乙醇）代替樣品的吸光度;A1為樣品吸光度;A2為蒸餾水代替H2O2的吸光度。

1.7 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)采用Excel表格進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和繪圖。以樣品濃度為橫坐標(biāo)，清除率為縱坐標(biāo)作圖，使用回歸分析方法求出清除率為50%時(shí)樣品的濃度（IC50），使用IC50來表示樣品的抗氧化活性結(jié)果。

1.8 甲醋化處理方法

取田蔥石油醚相1 g，置于50 mL具塞燒瓶中，加石油醚（60～90℃）-苯（1∶1） 20 mL使其溶解，加0.4 mol/L KOH-甲醇溶液10 mL，搖勻，置于40℃恒溫水浴1 h;加純凈水20 mL，振搖，靜置待分層清晰后取上清液，經(jīng)無水硫酸鈉脫水，濾過，濾液作為供試品溶液[9]。

1.9 GC-MS分析條件

色譜條件：Agilent HP-5Ms毛細(xì)管色譜柱（30 nm×0.25 nm×0.25 μm）;初始溫度120℃，保持3 min，以1.5 ℃/min升溫至300℃，保持20 min;載氣：He;流速：1 mL/min;進(jìn)樣量：0.2 μL;分流比：20∶1;離子源溫度：230℃;四級(jí)桿溫度：150℃;離子源：EI，電離能量：70 eV;進(jìn)樣口溫度：230℃;離子源溫度：230℃;掃描質(zhì)量范圍：35～450 amu。

2 結(jié)果

2.1 ABTS自由基清除能力的變化

田蔥不同濃度的各萃取相對(duì)ABTS自由基清除率呈現(xiàn)出良好的量-效關(guān)系。使用回歸分析方法得到回歸方程，計(jì)算得到乙酸乙酯相的IC50值為697.7 μg/mL，與陽性對(duì)照維生素E的IC50（549.6 μg/mL）相當(dāng)，正丁醇相、水相、石油醚相的IC50值較大（分別為1043.9、3209.3、7584.0 μg/mL），清除活性均較弱。見圖1。

2.2 DPPH自由基清除能力的變化

田蔥不同濃度的萃取相測(cè)定DPPH自由基清除率為4%～90%。使用回歸分析方法得到回歸方程，計(jì)算得到正丁醇相和乙酸乙酯相的IC50值分別為761.8、742.2 μg/mL，與陽性對(duì)照維生素E的IC50（539.2 μg/mL）相當(dāng)，而水相、石油醚相的IC50值較大（分別為1 004 527.4、6872.2 μg/mL），清除活性均較弱。由此，各萃取相對(duì)DPPH自由基的清除能力從大至小依次為：乙酸乙酯相、正丁醇相、石油醚相、水相。見圖2。

2.3 超氧陰離子自由基清除能力的變化

水相與其他幾個(gè)相對(duì)超氧陰離子自由基比較，清除率最弱。使用回歸分析方法得到回歸方程并計(jì)算得到正丁醇相和乙酸乙酯相的IC50值分別為790.8、705.8 μg/mL，乙酸乙酯相的IC50值比陽性對(duì)照維生素E的IC50（779.3 μg/mL）低，而水相和石油醚相IC50值較大（分別為4652.9、1054.4 μg/mL），清除活性均較弱。因此各相對(duì)超氧自由基的清除能力由大到小依次為：乙酸乙酯相、正丁醇相、石油醚相、水相。見圖3。

2.4 羥自由基清除能力的變化

田蔥不同濃度的萃取相對(duì)羥自由基清除能力大小依次為：石油醚相、水相、正丁醇相、乙酸乙酯相，且呈量-效關(guān)系。使用回歸分析方法得到回歸方程，計(jì)算得到石油醚相的IC50值為4933.5 μg/mL，比陽性對(duì)照維生素E的IC50（3238.4 μg/mL）稍高，水相、正丁醇相和乙酸乙酯相的IC50值較大（分別為1 081 283.9、167 981.6、77 814 578.3 μg/mL），清除活性均較弱。見圖4。

圖4? ?田蔥各萃取相對(duì)羥自由基的清除活性

2.5 田蔥石油醚部位脂溶性成分的GC-MS分析總離子流圖

對(duì)甲酯化處理以后的田蔥石油醚相脂溶性成分進(jìn)行GC-MS分析，各峰的保留時(shí)間和豐度值見圖5。所得的質(zhì)譜圖通過Mass Hunter質(zhì)譜工作站、NIST11標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索，并按峰面積歸一化法計(jì)算揮發(fā)油中各化合物的百分含量見表5。

3 討論

體內(nèi)高活性分子自由基產(chǎn)生過多，大量自由基積累導(dǎo)致氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡[10]?？寡趸瘎┖涂寡趸δ苁称纺軌蛴行б种谱杂苫难趸磻?yīng)，從而有效預(yù)防各種與自由基相關(guān)疾病的發(fā)生[11-15]。研究顯示[16-18]，傳統(tǒng)合成抗氧化劑本身可能具有潛在毒性，在食品添加中要嚴(yán)格控制比例，以防對(duì)人體造成危害，所以開發(fā)安全性高、抗氧化能力強(qiáng)的天然抗氧化劑日益受到關(guān)注。從傳統(tǒng)中藥和民族藥中尋找天然抗氧化劑，并對(duì)抗氧化活性成分及抗氧化機(jī)制進(jìn)行闡釋已成為近年來食品藥品研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)和焦點(diǎn)[19-20]。本研究為系統(tǒng)研究壯藥田蔥體外抗氧化活性，篩選出抗氧化活性較好的組分，選取總抗氧化清除能力、DPPH自由基清除能力、超氧陰離子自由基清除能力、羥自由基清除能力為篩選指標(biāo)。研究結(jié)果顯示，田蔥4個(gè)萃取相均有一定清除自由基的能力，是一種優(yōu)良的天然抗氧化劑。乙酸乙酯相對(duì)ABTS自由基清除率IC50值為697.7 μg/mL，對(duì)DPPH自由基的IC50值為742.2 μg/mL，對(duì)超氧自由基的IC50值為705.8 μg/mL，可見田蔥體外抗氧化活性較好的組分主要集中于乙酸乙酯相。

本研究以壯藥田蔥為研究對(duì)象，所采用4種方法均為中藥在體外抗氧化活性篩選中常見的方法，簡便、快速、準(zhǔn)確。但是這些方法都是在非生理?xiàng)l件下進(jìn)行的，這些結(jié)果不能外推為體內(nèi)的結(jié)果[21-22]。因此，研究下一步將是采用細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法綜合評(píng)價(jià)田蔥的抗氧化活性。

運(yùn)用GC-MS方法，自田蔥石油醚相中鑒定出的化合物百分含量占總峰面積的92.57%以上。分析結(jié)果可見石油醚相中有機(jī)酸類含量最多（53.59%），其中含量最高的為棕櫚酸（23.57%），其次為亞麻酸（13.47%）、亞油酸（9.08%）和硬脂酸（2.99%）。甾體類化合物41含量也非常高（16.845%），其他成分主要為倍半萜類或者烯萜類化合物，τ-muurolol（2.368%）。

國內(nèi)鮮見對(duì)中國傳統(tǒng)壯藥田蔥活性物質(zhì)和抗氧化活性的相關(guān)報(bào)道，所鑒定成分也均未在田蔥中被報(bào)道過，研究結(jié)果豐富了田蔥的化學(xué)成分，為該廣西特色壯藥的開發(fā)利用提供基礎(chǔ)。許多疾病與自由基所引發(fā)的氧化作用有關(guān)，如風(fēng)濕、糖尿病、衰老等癥狀[19-20]。本研究證實(shí)了田蔥具有一定的自由基清除活性，提示壯藥田蔥可作為一種良好的天然抗氧化劑，篩選出乙酸乙酯相的抗氧化活性較好，為從壯藥田蔥開發(fā)新的天然抗氧化劑提供參考數(shù)據(jù)和方法。

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（收稿日期：2019-11-18? 本文編輯：劉永巧）