“細(xì)胞工廠”制備N-乙酰氨基葡萄糖研究進(jìn)展

祁康 陳建華

摘要：N-乙酰氨基葡萄糖（（N-acetylglucosamine，GlcNAc）作為一種功能性糖，能夠發(fā)揮許多重要的生理功能，在醫(yī)藥、食品工業(yè)以及化妝品等行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用。隨著人們環(huán)境保護(hù)意識的日益增強(qiáng)以及合成生物學(xué)的蓬勃發(fā)展，針對GlcNAc制備方法不斷推陳出新，本文對此進(jìn)行總述。

關(guān)鍵詞：N-乙酰氨基葡萄糖;合成生物學(xué);制備

GlcNAc是氨基葡萄糖（glucosamine，GlcN）的衍生物，分子式C8H15NO6，系統(tǒng)命名為2-（乙?；被?2-脫氧-D-葡萄糖。目前，GlcNAc制備方法中比較成熟且大規(guī)模應(yīng)用到工業(yè)上主要是化學(xué)法。由于GlcNAc是多種甲殼類動物（螃蟹和蝦為主）表皮中甲殼素的基本成分，常利用強(qiáng)酸（包括鹽酸和硫酸）水解貝殼獲得不同形式的GlcN。但受限于原材料以及大量強(qiáng)酸使用對環(huán)境的損害，該方法顯然不可持續(xù)。

隨著代謝工程以及合成生物學(xué)技術(shù)的蓬勃發(fā)展，人們可以通過合理的規(guī)劃設(shè)計，利用“細(xì)胞工廠”制備所需化合物。文獻(xiàn)中已經(jīng)大量報道利用不同微生物作為“細(xì)胞工廠”制備GlcNAc，具體指以廉價的葡萄糖作為碳源，通過微生物發(fā)酵制備所得。因其高效、環(huán)保和可持續(xù)，表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。

（1）大腸桿菌制備GlcNAc

生物法制備GlcNAc的研究首先在大腸桿菌中進(jìn)行，大腸桿菌作為一種模式菌株，其遺傳背景是清晰的。Deng等人[1]首先通過過表達(dá)來自大腸桿菌自身氨基葡萄糖合酶基因（glmS）和來自釀酒酵母的N-乙酰氨基葡萄糖合酶基因（gna1），增強(qiáng)GlcNAc合成途徑。接著利用易錯PCR篩選出不受產(chǎn)物GlcN-6-P抑制的Glms突變體。又進(jìn)一步敲除負(fù)責(zé)胞內(nèi)GlcNAc降解途徑的關(guān)鍵基因（nagA/nagB）以及將GlcN/GlcNAc從胞外重新轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)的nagE和manXYZ基因。在1L發(fā)酵罐中產(chǎn)量達(dá)到了110g/L。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，對糖酵解途徑關(guān)鍵酶之一的丙酮酸激酶編碼基因 pykA和pyk F分別敲除，都能夠有利于產(chǎn)量的提高，pyk F效果更明顯。但同時敲除pykA和pyk F，產(chǎn)量下降明顯?？赡苁且?yàn)楸峒っ缸鳛樘墙徒馔緩疥P(guān)鍵調(diào)控之一，完全阻斷會影響菌體生長，從而最終影響產(chǎn)量[2]。

（2）枯草芽孢桿菌制備GlcNAc

因大腸桿菌為非安全菌株，同時易受噬菌體侵染。研究人員又將目光轉(zhuǎn)向了遺傳背景清晰且作為安全菌株的枯草芽孢桿菌。劉龍等[3]首先共過表達(dá)了來源釀酒酵母的gna1基因和枯草芽孢桿菌自身的glmS基因，增強(qiáng)GlcNAc的合成途徑。隨后，同樣敲除nagP基因（編碼GlcNAc特異性的磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)）、nagA基因（編碼GlcNAc-6-P脫乙酰酶）和gamA/nagB基因（編碼GlcN-6-P脫氨酶）。進(jìn)一步采用模塊代謝分析法將相關(guān)代謝通路分成三個模塊，即GlcNAc合成途徑、糖酵解途徑和肽聚糖合成途徑。利用干擾技術(shù)弱化糖酵解途徑和肽聚糖合成途徑的關(guān)鍵基因表達(dá)，使得更多碳源流向GlcNAc合成途徑。[4]此外，利用啟動子工程對glck基因（編碼葡萄糖激酶）和pgi基因（編碼磷酸葡萄糖異構(gòu)酶）進(jìn)行一系列組合優(yōu)化[5];對相關(guān)副產(chǎn)物（包括乳酸、乙酸以及乙偶姻[6]）代謝途徑的阻斷，這些做法都能促進(jìn)GlcNAc產(chǎn)量的提高。

（3）其他微生物制備GlcNAc

除了上述最常用的“細(xì)胞工廠”，還研究了利用工業(yè)上大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸的谷氨酸棒桿菌制備GlcNAc。谷氨酸棒桿菌在食品安全指標(biāo)上更有優(yōu)勢，代謝路徑也比較簡單。劉龍等[7]在谷氨酸棒桿菌S9114中過表達(dá)自身的glms基因和來自秀麗隱桿線蟲的GNA1基因;敲除編碼GlcNAc-6-P脫乙酰酶的nagA基因和編碼GlcN-6-P脫氨酶的gamA基因，以阻斷GlcNAc在胞內(nèi)的代謝;敲除編碼乳酸脫氫酶的ldh基因，以阻斷副產(chǎn)物乳酸合成途徑。最終，GlcNAc的產(chǎn)量達(dá)到了6.9g/L。

展望

N-乙酰氨基葡萄糖作為一種具有重要生理作用的單糖，其在醫(yī)藥和化妝品行業(yè)被廣泛應(yīng)用。受到當(dāng)前人口老齡化日益嚴(yán)重以及對化妝品需求不斷增加的影響，人類對GlcNAc的需求也將不斷增加?；瘜W(xué)法制備GlcNAc雖能大規(guī)模生產(chǎn)，但其對環(huán)境危害嚴(yán)重，與現(xiàn)今可持續(xù)發(fā)展理念背道而馳。顯然，利用“細(xì)胞工廠”制備GlcNAc具有更加高效、更加環(huán)保和更加可持續(xù)等優(yōu)點(diǎn)。在各種“細(xì)胞工廠”中，已被認(rèn)定為安全菌株的枯草芽孢桿菌可能更具應(yīng)用前景。在接下來的研究，應(yīng)將重點(diǎn)放在如何提高產(chǎn)量以期達(dá)到大規(guī)模量產(chǎn)的水平。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Deng M D， Severson D K， Grund A D， et al. Metabolic engineering of Escherichia coli for industrial production of glucosamine and N-acetylglucosamine [J]. Metab Eng， 2005， 7（3）： 201-14.

[2]陳欣. 代謝工程改造大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)氨基葡萄糖及過程優(yōu)化與控制 [D]; 江南大學(xué)， 2012.

[3]Liu Y， Liu L， Shin H-d， et al. Pathway engineering of Bacillus subtilis for microbial production of N-acetylglucosamine [J]. Metabolic Engineering， 2013， 19（107-15）.

[4]Liu Y， Liu L， Shin H D， et al. Pathway engineering of Bacillus subtilis for microbial production of N-acetylglucosamine [J]. Metab Eng， 2013， 19（107-15）.

[5]Ling M， Liu Y， Li J， et al. Combinatorial promoter engineering of glucokinase and phosphoglucoisomerase for improved N -acetylglucosamine production in Bacillus subtilis [J]. Bioresource Technology， 2017， 245.

[6]Ma W， Liu Y， Shin H-D， et al. Metabolic engineering of carbon overflow metabolism of Bacillus subtilis for improved N-acetyl-glucosamine production [J]. Bioresource Technology， 2017， 250.

[7]Deng C， Lv X， Liu Y， et al. Metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum S9114 based on whole-genome sequencing for efficient N-acetylglucosamine synthesis [J]. Synthetic and Systems Biotechnology， 2019， 4（3）： 120-9.

（作者單位：中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210009）