蝴蝶花中2種異黃酮的含量測(cè)定及其抗腫瘤活性

楊 倩，鄭 茜，魏 靜，張 春*

（1.西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，四川瀘州646000； 2.四川衛(wèi)生康復(fù)職業(yè)學(xué)院藥學(xué)系，四川自貢643000）

蝴蝶花Iris japonica Thunb.為鳶尾科鳶尾屬多年生草本植物.其性味苦、寒，有小毒，具有消腫止痛、清熱解毒的功效[1-2]，蝴蝶花在民間應(yīng)用廣泛，主治肝炎、肝腫大和胃痛等[3].但對(duì)其生藥學(xué)、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及藥效有效成分等研究較少.近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)，蝴蝶花主要含異黃酮類化合物[4-5]和三萜類化合物.其中從乙酸乙酯部位分離得到鳶尾黃素與次野鳶尾黃素為其重要成分[6]，但對(duì)蝴蝶花中鳶尾黃素和次野鳶尾黃素含量的研究未見(jiàn)報(bào)道.鳶尾黃素與次野鳶尾黃素具有多種生物活性，目前，對(duì)其抗腫瘤活性鮮有研究[7-8].因此，本研究試圖建立不同產(chǎn)地蝴蝶花中鳶尾黃素與次野鳶尾黃素HPLC含量測(cè)定方法，并對(duì)蝴蝶花的不同產(chǎn)地和不同部位進(jìn)行兩種成分的含量測(cè)定.同時(shí)，采用幾種腫瘤細(xì)胞株，對(duì)其進(jìn)行活性檢測(cè).該結(jié)果為蝴蝶花質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立，及其資源的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ).

1 材料

Agilent 1260色譜工作儀（安捷倫科技有限公司），MS105DU半微量天平（瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)），Spectra Max M3多功能酶標(biāo)分析儀（美國(guó)Molecular Devices），HERACELL-150i CO2培養(yǎng)箱（Thermo Fisher Scientific），CKX53-SLP 倒置顯微鏡（日本Olympus公司），TG-17多功能高速離心機(jī)（德國(guó) Eppendorf公司），Scientific-80℃冰箱（Thermo Fisher Scientific），Milli-Q 純水儀（美國(guó)Millipore公司），JOYN-10A型超聲波清洗儀（上海喬躍電子科技有限公司）.

標(biāo)準(zhǔn)品鳶尾黃素（批號(hào)：PS161122-01）與次野鳶尾黃素（批號(hào)：PS0681-0020）均購(gòu)自成都普思生物科技股份有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均＞98.0%.蝴蝶花藥材均采自四川省不同產(chǎn)地，經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)稅丕先教授鑒定為鳶尾科鳶尾屬蝴蝶花的全草.流動(dòng)相甲醇、乙酸均為色譜純，其他試劑均為分析純.DMEM高糖培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基（Hyclone），PAN胎牛血清（德國(guó)PAN-Biotech公司），CCK-8試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所），Hela細(xì)胞、Hccc-9810細(xì)胞和H460細(xì)胞均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)（上海）.

2 方法與結(jié)果

2.1 蝴蝶花中鳶尾黃素與次野鳶尾黃素的含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 色譜柱Diamonsil C18（2）（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流速：0.8 mL/min；溫度：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：267 nm；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相 A為甲醇，B為體積分?jǐn)?shù)0.05%乙酸水溶液，梯度洗脫條件為：0～10 min：體積分?jǐn)?shù) 55%A；10～20 min：體積分?jǐn)?shù)55% ～57%A；20 ～30 min：體積分?jǐn)?shù)57%～60%A.

2.1.2 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取減壓干燥至恒重的鳶尾黃素和次野鳶尾黃素對(duì)照品適量，置于棕色量瓶中，甲醇溶解，配制成質(zhì)量濃度0.20 g/L的鳶尾黃素溶液與質(zhì)量濃度0.25 g/L的次野鳶尾黃素溶液.

2.1.3 供試品溶液的配制 蝴蝶花根莖及葉部位放于減壓干燥箱中，60℃減壓干燥2 h.精密稱取1.0 g蝴蝶花根莖、葉粉末（過(guò)100目篩），置于具塞磨口瓶?jī)?nèi)，加入甲醇50 mL，超聲60 min；趁熱過(guò)濾收集濾液，用甲醇定容至50 mL容量瓶中，即得供試品溶液.

2.1.4 系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn) 分別精密吸取“2.1.2”和“2.1.3”項(xiàng)下制備的對(duì)照品和供試品溶液各10 μL，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖1.對(duì)照品鳶尾黃素色譜峰的保留時(shí)間為15.167 min，次野鳶尾黃素色譜峰的保留時(shí)間為27.395 min.確認(rèn)根莖樣品和葉樣品中鳶尾黃素和次野鳶尾黃素的保留時(shí)間與對(duì)照品溶液一致，分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)均不低于10 000，溶劑空白無(wú)干擾.

圖1 對(duì)照品（A）與根莖樣品（B）、葉樣品（C）的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms of authentic standards sample（A），sample of rhizoma（B）and sample of leaf（C）

2.1.5 線性關(guān)系 分別精準(zhǔn)量取鳶尾黃素溶液0.025、0.125、0.25、2.50、5.00 mL，次野鳶尾黃素溶液0.10、0.20、2.00、4.00 mL 置于10 mL 的量瓶中，用甲醇稀釋至刻度線，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定.以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（mg/mL），峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程分別為：鳶尾黃素：y=43 592x+16.611（r=0.999 6），線性范圍為0.5～100 mg/L；次野鳶尾黃素：y=47 574x+40.349（r=0.999 9），線性范圍為2.5～250 mg/L.

2.1.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取瀘州蝴蝶花根莖粉末6份按“2.1.3”項(xiàng)的條件制備供試品，按以上色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算鳶尾黃素、次野鳶尾黃素的RSD%分別為1.15%、0.94%.

2.1.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取供試液，分別在0、2、4、6、8、10、12 h 按以上色譜條件進(jìn)樣檢測(cè).鳶尾黃素、次野鳶尾黃素峰面積的 RSD%分別為0.96%、0.52%.

2.1.8 精密度實(shí)驗(yàn) 取鳶尾黃素與次野鳶尾黃素混合對(duì)照品溶液按以上色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，鳶尾黃素、次野鳶尾黃素峰面積的RSD%分別為1.47%、0.75%.

2.1.9 加樣回收實(shí)驗(yàn) 精密吸取已知鳶尾黃素與次野鳶尾黃素含量的蝴蝶花供試品9份，分別按已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的50%、100%、150%共3個(gè)水平加入對(duì)照品鳶尾黃素與次野鳶尾黃素，按“2.1.3”項(xiàng)方法制備，按以上條件進(jìn)樣10 μL測(cè)定，計(jì)算平均回收率，結(jié)果如表1，鳶尾黃素與次野鳶尾黃素的平均回收率分別為99.96%、100.24%；RSD%分別為2.01%、1.49%.

表1 加樣回收實(shí)驗(yàn)Tab.1 Results of the recovery tests

2.1.10 樣品含量測(cè)定 精密稱取不同產(chǎn)地蝴蝶花藥材根莖與葉部位粉末，按“2.1.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，測(cè)定樣品含量，結(jié)果見(jiàn)表2.

2.2 體外抗腫瘤活性研究

2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人宮頸癌細(xì)胞Hela、人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞H460分別培養(yǎng)于含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI培養(yǎng)液中，人肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞Hccc-9810培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中.3種細(xì)胞均放于37℃體積分?jǐn)?shù)5%的CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng).

2.2.2 CCK-8實(shí)驗(yàn) 精密稱取一定量的鳶尾黃素與次野鳶尾黃素，加入少量二甲基亞砜充分溶解后，再加入適量培養(yǎng)基制備成濃度10 mol/L的母液.取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞懸液密度為5×104個(gè)/mL，以每孔100 μL細(xì)胞懸液接種于96孔板，于37℃體積分?jǐn)?shù)5%的CO2中常規(guī)培養(yǎng)24 h[7].待細(xì)胞貼壁后加入一定濃度的待測(cè)藥物（陽(yáng)性對(duì)照組加入一定濃度的五氟尿嘧啶，陰性對(duì)照組加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的DMSO的培養(yǎng)基）與細(xì)胞共孵育48 h后，吸出培養(yǎng)基，每孔加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的CCK-8 100 μL置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育30 min，酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)定各孔光密度OD值.按下述公式計(jì)算各組抑制率為：

2.2.3 統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)據(jù)資料均用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，用one-way ANOVA進(jìn)行處理，各組數(shù)據(jù)資料用?±s表示，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2.2.4 結(jié)果 不同濃度的鳶尾黃素和次野鳶尾黃素對(duì)Hela細(xì)胞、Hccc-9810細(xì)胞和H460細(xì)胞的生長(zhǎng)均能產(chǎn)生不同程度抑制作用，其抑制作用隨藥物濃度的增加而增加，其中鳶尾黃素對(duì)Hela細(xì)胞的抑制率最大，如圖2和3所示.鳶尾黃素對(duì)Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制的IC50值為（49.24±1.11）μmol/L，與陽(yáng)性對(duì)照五氟尿嘧啶的IC50值（23.72±1.24）比較接近，表明鳶尾黃素對(duì)Hela細(xì)胞具有很好的抗增值抑制作用.鳶尾黃素對(duì)H460細(xì)胞的IC50值為（308.4 ±1.29）μmol/L、對(duì) Hccc-9810 細(xì)胞的IC50＞360 μmol/L，其 IC50值均遠(yuǎn)大于陽(yáng)性對(duì)照的結(jié)果.次野鳶尾黃對(duì)Hela細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的IC50為（146.9 ±1.23）μmol/L，對(duì)其他細(xì)胞的 IC50＞360 μmol/L，見(jiàn)表 3.

圖2 不同濃度的鳶尾黃素對(duì)Hela、Hccc-9810、H460細(xì)胞的抑制率Fig.2 Inhibition rate of different concentrations of tectorigenin on Hela，Hccc-9810 and H460 cells

圖3 不同濃度的次野鳶尾黃素對(duì)Hela、Hccc-9810、H460細(xì)胞的抑制率Fig.3 Inhibition rate of different concentrations of irisflorentin on Hela，Hccc-9810 and H460 cells

表3 不同濃度的五氟尿嘧啶、鳶尾黃素和次野鳶尾黃素對(duì)3種細(xì)胞的IC50Tab.3 IC50values of different concentrations of pentafluorouracil，tectorigenin and irisflorentin on three kinds of cells μmol/L

3 討論

前人采用HPLC法，以乙腈-磷酸水作為流動(dòng)相，對(duì)射干及川射干中鳶尾黃素與次野鳶尾黃素進(jìn)行含量測(cè)定[9-10]，但未見(jiàn)對(duì)蝴蝶花中該成分含量測(cè)定的報(bào)道.張金專等[11]采用乙腈-磷酸水作為流動(dòng)相，建立了中藥蝴蝶花高效液相指紋圖譜，但該法僅分離出3個(gè)峰型較好的峰.本文首次采用HPLC法對(duì)蝴蝶花進(jìn)行鳶尾黃素與次野鳶尾黃素含量測(cè)定，采用甲醇-水作為流動(dòng)相，能分離出6個(gè)峰型較好的峰，分離度遠(yuǎn)好于采用乙腈-磷酸水作為流動(dòng)相的結(jié)果，且從環(huán)境與經(jīng)濟(jì)而言，甲醇優(yōu)于乙腈.從方法學(xué)考察各項(xiàng)指標(biāo)可看出，本文此方法專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，可用于蝴蝶花中這兩種異黃酮成分的含量測(cè)定，為蝴蝶花質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定，奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).由表2可看出，不同產(chǎn)地蝴蝶花中鳶尾黃素和次野鳶尾黃素含量差異較大，次野鳶尾黃素在廣元和達(dá)州分布的材料根中含量甚少（＜2.5 μg）.鳶尾黃素在達(dá)州市蝴蝶花的葉中含量最高，次野鳶尾黃素在瀘州蝴蝶花的葉中含量最高.該結(jié)果說(shuō)明，鳶尾黃素和次野鳶尾黃素在蝴蝶花中含量多少，受其產(chǎn)地、環(huán)境因素影響較大.此外，在同一植株不同部位，二者含量也有較大差異，表明這兩種異黃酮成分存在明顯的組織特異性.

前人已報(bào)道鳶尾黃素對(duì)HepG2、Caski腫瘤細(xì)胞的抗增殖活性[8]，其能上調(diào)人宮頸癌Caski細(xì)胞Bax蛋白、下調(diào)bcl-2蛋白的表達(dá)進(jìn)而誘導(dǎo)Caski細(xì)胞凋亡；次野鳶尾黃素能明顯抑制MDA-MB-231腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[7].本實(shí)驗(yàn)考察鳶尾黃素與次野鳶尾黃素對(duì)Hela、H460、Hccc-9810細(xì)胞株的抗增殖活性.結(jié)果顯示，鳶尾黃素對(duì)Hela細(xì)胞的抗增值效果最好，其 IC50值為49 μmol/L，但對(duì)于 Hccc-9810和H460細(xì)胞株則沒(méi)有明顯的抑制作用.次野鳶尾黃素對(duì)3種腫瘤細(xì)胞株的抑制效果均不理想.因此，結(jié)合前人研究結(jié)果可知，鳶尾黃素和次野鳶尾黃素對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用，僅限于少數(shù)幾種腫瘤細(xì)胞，其確切的抑制作用機(jī)理有待于進(jìn)一步深入研究.