桂花種子油的抗氧化活性和成分測(cè)定

陳曉鳳，劉 剛，2*，李學(xué)理，汪淑芳，2，張曉喻，2，趙甲元

（1.四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川成都610101； 2.四川師范大學(xué)食品功能及加工應(yīng)用研究所，四川成都610101）

我國(guó)桂花種植面積大[1]，桂花果實(shí)沒(méi)有得到合理的利用，導(dǎo)致資源浪費(fèi).桂花種子相關(guān)的產(chǎn)品有一定的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，充分、合理地開(kāi)發(fā)利用桂花種子，是一種既節(jié)約資源又發(fā)展經(jīng)濟(jì)的環(huán)保研究項(xiàng)目.本實(shí)驗(yàn)以桂花種子油為材料，對(duì)其成分含量及抗氧化性進(jìn)行研究.

1 材料、試劑與方法

1.1 材料本實(shí)驗(yàn)材料銀桂Osmanthus fragrans[2]生長(zhǎng)在四川師范大學(xué)成龍校區(qū).經(jīng)過(guò)與文獻(xiàn)[3]中桂花的描述比較，確認(rèn)這些植物的特征符合文獻(xiàn)描述.該桂花9月開(kāi)花，經(jīng)過(guò)6～7個(gè)月的生長(zhǎng)，果實(shí)由小變大，顏色由青變?yōu)榍嘧?，到?lái)年4月再變?yōu)樽虾?、成熟的果?shí).采集該植物的果實(shí)，脫除果皮可得到種子，見(jiàn)圖1.

1.2 試劑和儀器試劑：石油醚（成都市科隆化工試劑廠）、乙醇（成都市科隆化工試劑廠）、乙酸乙酯（成都市科隆化工試劑廠）、過(guò)硫酸鈉（成都市科隆化工試劑廠）、ABTS（成都市科隆化工試劑廠）、DPPH（日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社）、維生素E（vitamin E，VE）（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品（Omega公司）.

圖1 桂花的果實(shí)、種子Fig.1 Fruit and seeds of O.fragrans

儀器：ESJ220-48型烘箱（上海-恒科技有限公司）、800Y型粉碎機(jī)（永康伯歐五金制造有限公司）、RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）、WSL-2型比較測(cè)色儀（上海昕瑞儀器儀表有限公司）、HKC-40A型超聲波儀器（昆山市超聲儀器有限公司）、BioMate 3S型紫外分光光度計(jì)（Thermo公司）、GC-7890A型氣相色譜儀（安捷倫科技有限公司）、JA5003型電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）.

1.3 桂花種子油的提取方法將新鮮采摘的桂花果實(shí)進(jìn)行人工去皮，用清水洗凈外面粘附的果肉，得到白色的桂花種子，再將種子置于50℃烘干，用密封口袋包裝，置于陰涼干燥處保存.采用超聲波輔助提取法[4]，分別以石油醚、乙醇[5-6]為溶劑提取桂花種子油（OFSO）.桂花種子油的收得率[7]為：

1.3.1 石油醚提取法 按文獻(xiàn)[8]的方法進(jìn)行提取，稱取40 g桂花種子，粉碎過(guò)80目，置于錐形瓶中，按固液比1∶5的比例將石油醚加入錐形瓶，封口膜封好，置于陰涼干燥處?kù)o置浸提12 h，再超聲30 min.將錐形瓶中的上清液倒入圓底燒瓶，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收石油醚溶劑.得到桂花果種子油有少量溶劑的殘留，可將提取的油置于培養(yǎng)皿，揮發(fā)30 min，得到桂花種子油.二次提取的油混合，然后6 000 r/min離心4 min，得到澄清的種子油.

1.3.2 體積分?jǐn)?shù)95%乙醇提取法 按文獻(xiàn)[8-9]的方法，稱取40 g桂花種子粉末，過(guò)80目篩，置于錐形瓶.按固液比1∶5加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)95%的乙醇，封口膜封好，至于陰涼干燥處，浸提12 h，超聲30 min.將上清液倒出，離心，上清液轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙醇，得到桂花種子油.二次浸提的油混合，6 000 r/min離心4 min，除去雜質(zhì)，得到種子油.

1.4 抗氧化活性和成分的測(cè)定方法

1.4.1 樣品液的配置 樣品溶度配置：取5只試管，在第一支試管中加1 g種子油，再加入1 mL乙酸乙酯混勻得到質(zhì)量濃度500.000 g/mL的種子油，依次對(duì)等稀釋得到質(zhì)量濃度為 250.000、125.000、62.500、31.250 mg/mL 的種子油用于實(shí)驗(yàn).用 ABTS 法[10-11]和 DPPH 法[12-14]測(cè)定桂花種子油抗氧化活性.

1.4.2 桂花種子油抗氧化活性的測(cè)定（ABTS法）ABTS溶液配置：用天平稱取0.384 g的ABTS定容到10 mL，得到濃度7 mmol/L的溶液，稱取0.013 4 g的過(guò)硫酸鉀，定容至10 mL，得到濃度4.9 mmol/L的溶液，然后將這2種溶液等量混合，置于暗處避光保存12 h，再用無(wú)水乙醇將混合溶液稀釋至在734 nm處，測(cè)得吸光度值為0.7±0.02.分別設(shè)置3種測(cè)定液：

空白組：0.2 mL乙酸乙酯+3.8 mL ABTS；

實(shí)驗(yàn)組：0.2 mL樣品+3.8 mL ABTS；

陽(yáng)性組：0.2 mL VE稀釋液+3.8 mL ABTS.

用0.2 mL乙酸乙酯+3.8 mL乙醇的溶液調(diào)整儀器零點(diǎn)后，分別將4種質(zhì)量濃度的樣品和4種質(zhì)量濃度的陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行測(cè)定.按上述實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備空白對(duì)照、實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照液測(cè)定液，測(cè)定液放置6 min后，在734 nm處測(cè)定吸光度值，吸光度值用A表示.做3次平行測(cè)定，依據(jù)公式計(jì)算清除率[8]為：

1.4.3 桂花種子油抗氧化活性的測(cè)定（DPPH法）DPPH溶液的配置：先稱取7.8 mg左右的DPPH于100 mL的質(zhì)量分?jǐn)?shù)95%的乙醇溶液定容，避光保存.再分別設(shè)置3種測(cè)定液：

空白組：0.2 mL乙酸乙酯+3.8 mL DPPH；

實(shí)驗(yàn)組：0.2 mL樣品+3.8 mL DPPH；

陽(yáng)性組：0.2 mL VE稀釋液+3.8 mL ABTS.

用0.2 mL乙酸乙酯+3.8 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液調(diào)整儀器零點(diǎn)后，分別將4種質(zhì)量濃度的樣品和4種質(zhì)量濃度的陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行測(cè)定.按上述實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備空白對(duì)照、實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性組測(cè)定液，且都避光放置保存2 h，在517 nm處測(cè)定吸光度值，吸光度值用A表示.3次平行測(cè)定，依據(jù)（1）式計(jì)算清除率[8].

1.4.4 桂花果油成分的測(cè)定方法 氣相色譜法是色譜法的一個(gè)重要分支，它的主要特點(diǎn)是靈敏度高，重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確度高，操作簡(jiǎn)便、快速、高效[16-18]，所以本實(shí)驗(yàn)選取這種方法測(cè)定桂花種子油的成分與其在油中的占比.

依據(jù)GB5009.168——2016的方法，具體測(cè)定的條件為：HP-FFAP色譜柱、環(huán)境溫度20℃、大氣濕度39.4%、FID檢測(cè)器、載氣流量2 mL/min、空氣流量 400 mL/min、氫氣流量 40 mL/min、柱溫60～200℃、進(jìn)樣口溫度220℃、檢測(cè)器溫度300℃.

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 用SPSS20軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，回歸分析采用簡(jiǎn)單回歸法.清除質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%抗氧化劑為半數(shù)抑制質(zhì)量分?jǐn)?shù)（IC50）[15]，該數(shù)值越大，抗氧化活性越低.根據(jù)抗氧化劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)-清除率的關(guān)系，應(yīng)用Probit回歸法求出.

2 結(jié)果與分析

2.1 種子油收得率的比較經(jīng)2種方法提取桂花種子，油的收得率根據(jù)1.3計(jì)算，得到石油醚提取的收得率為15.300%，乙醇提取的收得率為11.600%.因此，本實(shí)驗(yàn)采用石油醚提取桂花油的方法.

2.2 種子油的感官描述和色度值經(jīng)石油醚提取法和高質(zhì)量分?jǐn)?shù)乙醇提取法，得到桂花種子油，離心后對(duì)其進(jìn)行感官分析描述、色度儀分析測(cè)定色度值.結(jié)果為石油醚提取的植物油呈黃色，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95%乙醇提取的植物油呈亮黃橙色.

比較2種提取方法，石油醚對(duì)油的溶解度好，提出來(lái)的油清亮，而質(zhì)量分?jǐn)?shù)95%乙醇提取出來(lái)的油比較渾濁.因此浸提后的液體要先進(jìn)行一次離心，最后提出的油才會(huì)比較清亮，如果最后有少量的溶劑殘余，可在陰涼干燥處放置晾干.

由于石油醚提取法具有更大的優(yōu)勢(shì)，本實(shí)驗(yàn)最終采用石油醚作為提取溶劑.

2.3 桂花種子油的抗氧化活性—ABTS法根據(jù)1.4.2的方法，測(cè)定VE和桂花種子油對(duì)ABTS清除率，進(jìn)一步回歸分析，結(jié)果見(jiàn)圖2、3.

圖2 VE對(duì)ABTS自由基的清除效果Fig.2 VE’s scavenging capacity against ABTS

由分析得到線性回歸方程，VE的清除率方程為

用Probit法求出半數(shù)抑制質(zhì)量濃度為0.250 mg/mL.桂花種子油的清除率方程為

進(jìn)而計(jì)算出桂花果油對(duì)ABTS的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度為271.963 mg/mL.由此看出桂花種子油相比于VE的抗氧化性較弱，但仍具有一定的抗氧化活性.

圖3 OFSO對(duì)ABTS自由基的清除效果Fig.3 OFSO’s scavenging capacity against ABTS

2.4 桂花種子油的抗氧化活性（DPPH法）根據(jù)1.4.3的方法，測(cè)定VE與桂花種子油對(duì)DPPH法自由基清除效果，進(jìn)一步回歸分析，結(jié)果見(jiàn)圖4、5.

圖4 VE對(duì)DPPH自由基清除效果Fig.4 VE’s scavenging capacity against DPPH

圖5 OFSO油對(duì)DPPH自由基清除效果Fig.5 OFSO’s scavenging capacity against DPPH

由統(tǒng)計(jì)分析得到質(zhì)量濃度-抑制率線性回歸方程，VE的清除率方程為

用Probit法算出半數(shù)抑制質(zhì)量濃度為0.257 mg/mL.桂花種子油的抑制方程為

進(jìn)而計(jì)算出桂花果油對(duì)DPPH的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度為286.347 mg/mL.由此看出桂花種子油相比于VE的抗氧化性較弱，但仍具有一定的抗氧化活性.

綜上所述，在質(zhì)量濃度為62.500～500.000 mg/mL，ABTS自由基的清除率為 38.460% ～89.840%，半數(shù)抑制質(zhì)量濃度為271.963 mg/mL，DPPH的自由基清除率為42.370% ～87.390%，半數(shù)抑制質(zhì)量濃度為286.347 mg/mL.桂花種子油對(duì)DPPH自由基的清除和ABTS自由基的清除都有較為相似的結(jié)果.因此，證明桂花種子油具有抗氧化活性.

抗氧化劑用途廣泛，可用于功能食品的開(kāi)發(fā)，減緩油脂等食物的氧化，延長(zhǎng)產(chǎn)品的貯存期.天然抗氧化劑具有安全、營(yíng)養(yǎng)的功能，而一些合成的抗氧化劑，如BHA、BHTD等，對(duì)人體是具有一些毒副作用.由于人們對(duì)健康更高的追求，推動(dòng)了天然抗氧化劑代替合成抗氧化劑的研究.我國(guó)桂花資源豐富，但是，其果實(shí)卻未被充分的利用，本實(shí)驗(yàn)對(duì)桂花種子抗氧化性的研究，有助于資源開(kāi)發(fā)和利用，同時(shí)對(duì)天然抗氧化劑做出一定的貢獻(xiàn)，為進(jìn)一步的研究提供一些參考.

2.5 桂花種子油的成分測(cè)定按1.4.4的方法，用氣相色譜法[19]測(cè)定桂花種子油的成分.混合標(biāo)準(zhǔn)脂肪酸的GC譜圖見(jiàn)圖6，測(cè)定樣品的GC譜圖見(jiàn)圖7，主要成分和主要成分在油中所占比例，見(jiàn)表1.

桂花種子油的8種主要成分中，油酸、亞油酸、棕櫚酸和硬脂酸總占比為96.000%，不飽和脂肪酸中的單不飽和脂肪酸中，油酸所占比42.600%、花生一烯酸占0.240%，多不飽和脂肪酸中亞油酸占40.900%、亞麻酸占0.950%，在種子油中不飽和脂肪酸的總占比84.700%，而飽和脂肪酸較少，如棕櫚酸占比11.200%、硬脂酸占比3.030%、剩下的不飽和脂肪酸占比0.410%.因此，桂花種子油是高亞油酸型的植物油.

圖6 脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品的GC圖譜Fig.6 GC atlas of standard fatty acids

圖7 桂花種子油的GC圖譜Fig.7 GC atlas of OFSO

表1 桂花種子油的主要成分和其所占比例（n=3）Tab.1 The main components and content of OFSO （n=3）

通過(guò)氣相色譜法對(duì)桂花種子油進(jìn)行成分與含量分析，桂花種子油中的主要成分是不飽和脂肪酸，其中單不飽和脂肪酸[20]（油酸、花生一烯酸）與多不飽和脂肪酸[21]（亞油酸、亞麻酸）都有各自的作用，而飽和脂肪酸含量很少.總的來(lái)說(shuō)不飽和脂肪酸是人體的必需脂肪酸，具有降低血脂、血壓、軟化血管及促進(jìn)微循環(huán)的作用，可預(yù)防或是減少心腦血管疾病的發(fā)生[22-23].因此，桂花種子油在食品和功能性食品中都有一定的應(yīng)用和開(kāi)發(fā)前景.

3 結(jié)論

我國(guó)桂花資源豐富，本實(shí)驗(yàn)對(duì)桂花種子油進(jìn)行了抗氧化研究和成分測(cè)定，既避免了資源的浪費(fèi)和環(huán)境的污染，也充分發(fā)揮了植物副產(chǎn)物的價(jià)值.

1）采用DPPH法與ABTS法測(cè)定桂花種子油的抗氧化活性，在質(zhì)量濃度為62.500～500.000 mg/mL之間，ABTS自由基的清除率在38.460% ～89.840%，半數(shù)抑制質(zhì)量濃度為271.963 mg/mL，DPPH的自由基清除率為42.370% ～87.390%，半數(shù)抑制質(zhì)量濃度為286.347 mg/mL.因此，實(shí)驗(yàn)證明桂花種子有較強(qiáng)的抗氧化活性，而抗氧化劑有清除體內(nèi)的自由基的作用，有望用于延緩衰老和美容和功能性食品的開(kāi)發(fā)等方面.

2）采用氣相色譜法測(cè)定桂花種子油，數(shù)據(jù)表明其中主要含不飽和脂肪酸，如油酸、亞油酸，是高亞油酸型的植物油.桂花種子油中的不飽和脂肪酸具有軟化血管、降低血壓的作用，期望今后能在開(kāi)發(fā)用于預(yù)防心腦血管疾病的新資源植物.