雙水相法制備鱖魚（Siniperca chuatsi）肌動蛋白及定量分析

王洋洋，徐明芳,*，白衛(wèi)濱，鄭春麗，葉 蕾，鄭琴琴

（1.暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510632；2.暨南大學(xué)理工學(xué)院，廣東 廣州 510632）

鱖魚（Siniperca chuatsi）俗稱翹嘴鱖、桂花魚、桂魚等，隸屬鱸形目、鮨科，為我國特有的淡水肉食性兇猛魚類，在中國分布極為廣泛，除青藏高原外，南北水系中均有出產(chǎn)，廣泛分布于中東部的江河、湖庫中。鱖魚肉質(zhì)純白細嫩、味道鮮美可口，是我國重要的名貴經(jīng)濟魚類，深受廣大消費者的喜愛，有“淡水石斑”之稱[1]，是進行魚類肌肉品質(zhì)評價研究的良好材料。魚肉主要由蛋白質(zhì)和脂肪構(gòu)成，魚類肌肉蛋白質(zhì)量分數(shù)高達18%～22%，高于豬肉（20.2%）、牛肉（19.8%）、羊肉（15.5%）等禽類的蛋白質(zhì)含量[2]。魚類肌肉中的肌原纖維蛋白約占總蛋白質(zhì)的55%～60%，是魚肌肉中含量最高的蛋白質(zhì)[3]，適宜的加工處理可以使其形成穩(wěn)定的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而賦予肉制品良好的凝膠特性和感官特性[4]，主要包括起收縮作用的肌動蛋白、肌球蛋白、原肌球蛋白和肌原蛋白等[5]，其中肌動蛋白和肌球蛋白的含量分別約占肌原纖維蛋白的20%和50%～55%[3]。肌漿蛋白占總蛋白質(zhì)的25%～35%，主要包括肌白蛋白、球蛋白和酶類等多種蛋白質(zhì)[6]；基質(zhì)蛋白是結(jié)締組織蛋白質(zhì)，質(zhì)量分數(shù)約為10%～15%[7]，包括膠原蛋白、網(wǎng)狀蛋白及黏蛋白等；肌動蛋白是所有真核細胞中高度保守的豐富蛋白質(zhì)[8-9]，單體肌動蛋白分子質(zhì)量約為42 kDa，由375～377 個氨基酸組成。在肌肉細胞中，肌動蛋白細絲參與肌肉收縮。在非肌細胞中，肌動蛋白通過單體（G-肌動蛋白）和聚合體（F-肌動蛋白）形式之間的動態(tài)轉(zhuǎn)換調(diào)節(jié)多種細胞過程，包括細胞分裂、黏附、運動和物質(zhì)運輸[10]。在肉制品中，肌動蛋白不能單獨形成凝膠，但與肌球蛋白以一定比例結(jié)合可改變形成凝膠的能力，是影響肉糜及肉制品加工特性的主要特性蛋白質(zhì)[11]。肌動蛋白的變性溫度顯著高于肌球蛋白，在肉制品凍藏過程中，肌動蛋白比肌球蛋白更穩(wěn)定[12]。

目前，國內(nèi)外對肌動蛋白提取研究主要包括王志峰等[13]的丙酮抽提-層析法、張秀真[14]的兩次層析法及Ebashi[15]的離心直提法，這些方法實驗步驟多耗時，操作繁瑣溶劑消耗大。因此，建立一種高效快速分離肌動蛋白方法對于名貴魚類品質(zhì)鑒定及營養(yǎng)功能與加工特性研究十分必要。雙水相萃?。╝queous two-phase system，ATPS）是一種新型的液-液萃取技術(shù)，對蛋白質(zhì)、酶、病毒、核酸、抗體、抗生素等生物物質(zhì)、天然產(chǎn)物的提取、純化，具有處理時間短，條件溫和，生物活性物質(zhì)不失活、不變性，不存在有機溶劑殘留，易于工藝放大和連續(xù)操作，提取率高等優(yōu)點[16-18]，可以廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)、細胞生物學(xué)、生物化工和食品化工等領(lǐng)域。

肌動蛋白質(zhì)量濃度測定方法主要包括化學(xué)法如考馬斯亮藍法、雙縮脲法及光譜法等。Spudich[19]采用Lowry顯色法測定兔骨骼肌肌動蛋白質(zhì)量濃度，袁軍等[20]應(yīng)用雙波長薄層掃描分析確定凝膠電泳樣品中肌動蛋白占總蛋白質(zhì)的相對百分含量，這些檢測方法反應(yīng)速度慢、易受干擾、定量結(jié)果偏差較大[21]。由于缺乏魚類肌動蛋白標準品，儀器精確定量檢測肌動蛋白的研究鮮有報道，導(dǎo)致名貴魚類品質(zhì)屬性鑒定非常困難。毛細管電泳（capillary electrophoresis，CE）法是一類以彈性石英毛細管為分離通道，以高壓直流電場為驅(qū)動力，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實現(xiàn)分離的電泳分離-分析方法，分離效率高（理論塔板數(shù)已達106～107/m）、消耗的溶劑或樣品體積小，可采用多種模式來改變選擇性，擴大應(yīng)用范圍，操作簡便，易于實現(xiàn)自動化等諸多優(yōu)點[22]，廣泛用于復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品的多維分離與分析，以其快速高效的特點對于蛋白質(zhì)的定量檢測具有突出的優(yōu)越性[23-25]。

本實驗采用雙水相體系分離肌原纖維蛋白中的肌動蛋白，通過高聚物-無機鹽雙水相體系與低分子有機物-無機鹽雙水相體系成相能力分析，建立雙水相分離純化鱖魚肌動蛋白的方法，基于高效毛細管膠束電動色譜（micellar electrokinetic capillary chromatography，MECC）耦合二極管陣列檢測器（diode array detector，DAD），探索MECC-DAD法定量檢測鱖魚肌動蛋白的新方法，以期為名貴魚類質(zhì)量品質(zhì)屬性的鑒定奠定基礎(chǔ)，為肌動蛋白標準品的研制與大規(guī)模制備提供一種新的思路，為魚類蛋白功能開發(fā)利用及快速定量檢測提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

6 尾齡鮮活鱖魚購自暨南大學(xué)菜市場，養(yǎng)殖體質(zhì)量（450±50）g，體長（25.2±0.5）cm，體高（8.1±0.5）cm，體質(zhì)健康。每次取背部肌肉20 g于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

兔肌動蛋白（電泳純≥85%）、對乙酰氨基酚（色譜純≥99%） 上海源葉生物科技有限公司；異丙醇、硫酸銨 天津大茂試劑廠；預(yù)染蛋白Marker（10、15、25、35、40、55、70、100、130、170 kDa） 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；甲醇、無水乙醇、正丙醇、異丁醇、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）（相對分子質(zhì)量600、2 000、4 000、6 000、10 000）、四硼酸鈉、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、無水碳酸鈉、三水磷酸氫二鉀（簡稱磷酸氫二鉀）、考馬斯亮藍G-250等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Coulter P/ACETM MDQ型CE儀、毛細管柱（60 cm×75 μm，有效長度44 cm） 美國Beckman公司；CP224C型電子天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司；UV1750型紫外分光光度計 日本島津公司；HC-2518R型高速冷凍離心機 安徽中科中佳儀器廠；Scientz-10N型冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司；PHS-3C型pH計 上海雷磁儀器廠；DYCZ-24DN型垂直電泳槽、DYY-11型電腦三恒多用電泳儀 北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 雙水相相圖的制作

采用濁點法[26]繪制PEG-鹽和有機溶劑-鹽雙水相體系的相圖。

取一定量已知濃度的不同分子質(zhì)量的PEG于25 mL的燒杯中；向其中逐滴加入已知濃度的鹽溶液至混合溶液恰好出現(xiàn)渾濁，再滴加1 滴水，溶液馬上變得澄清；再多加1 滴鹽溶液，溶液又馬上渾濁，則可以判定該濁點為臨界點。重復(fù)上述操作，計算出濁點時溶液各組分的質(zhì)量分數(shù)。

取一定質(zhì)量的無機鹽（m1）加入一定量的蒸餾水（m2）；然后逐滴加入有機溶劑（m3）至混合溶液恰好出現(xiàn)渾濁，再滴加1 滴水，溶液馬上變得澄清；再多加1 滴有機溶劑，溶液又馬上渾濁，則可以判定該濁點為臨界點。重復(fù)上述操作，算出濁點時溶液各組分的質(zhì)量分數(shù)。有機溶劑和無機鹽質(zhì)量分數(shù)計算如下：

1.3.2 肌原纖維蛋白提取

參考Lv Mingchun[27]等的方法稍作修改，取剁碎的魚背部肌肉加入5 倍體積20 mmol/L Tris-馬來酸（含0.1 mol/L NaCl，pH 7.5）緩沖液，攪拌均勻，4 ℃、10 000 r/min離心5 min，沉淀重復(fù)3 次。將最后一次的沉淀溶于10 倍體積20 mmol/L Tris-馬來酸（含0.6 mol/L NaCl，pH 7.5）緩沖液，4 ℃靜置1 h，10 000 r/min離心10 min，上清液即為肌原纖維蛋白溶液。將肌原纖維蛋白溶液用300 目尼龍網(wǎng)紗過濾，計算肌動蛋白提取率時，調(diào)節(jié)肌原纖維蛋白溶液的質(zhì)量濃度為（1±0.05）mg/mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 雙水相分離肌動蛋白有機溶劑和無機鹽的確定[28]

取1 mL肌原纖維蛋白溶液，向其中加入不同類型的短鏈醇有機溶劑和不同分子質(zhì)量的PEG使之與磷酸氫二鉀形成雙水相?？刂企w系的總質(zhì)量為10.0 g，相比為1.0左右，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）選出僅能分離出肌動蛋白單條帶的有機溶劑，計算肌動蛋白的提取率確定最優(yōu)有機溶劑。

取1 mL肌原纖維蛋白溶液，向其中加入不同類型的無機鹽使之與異丙醇形成雙水相?？刂企w系的總質(zhì)量為10.0 g，相比為1.0左右，通過SDS-PAGE選出僅能分離出肌動蛋白單條帶的無機鹽，計算肌動蛋白的提取率確定最優(yōu)無機鹽。

式中：R為相比；Vt、Vb分別為上、下相體積/mL。

式中：c為上相肌動蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）；M為體系中肌原纖維蛋白的質(zhì)量/mg。

1.3.4 單因素試驗

以肌動蛋白提取率為評價指標，分別考察異丙醇質(zhì)量分數(shù)（24%、26%、28%、30%、32%），硫酸銨質(zhì)量分數(shù)（6%、8%、10%、12%、14%）、雙水相體系pH值（6、7、8、9、10）及肌原纖維蛋白加入量（10%、20%、30%、40%、50%）對肌動蛋白提取率的影響。

1.3.5 響應(yīng)面分析試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以異丙醇質(zhì)量分數(shù)、硫酸銨質(zhì)量分數(shù)和體系pH值為自變量，肌動蛋白提取率為響應(yīng)值，按照Box-Behnken設(shè)計進行響應(yīng)面試驗，因素與水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Independent variables and their levels used in Box-Behnken design

1.3.6 雙水相體系放大制備肌動蛋白

雙水相體系放大500 倍，肌原纖維蛋白加入量分別為10%和30%，在異丙醇質(zhì)量分數(shù)26%、硫酸銨質(zhì)量分數(shù)11%、pH 9.0的條件下放大，制備肌動蛋白凍干粉。分離出上相經(jīng)過35 ℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)20 min，4 ℃靜置過夜，離心收集沉淀，蒸餾水透析后凍干得到肌動蛋白凍干粉。1.3.7 分析檢測

1.3.7.1 SDS-PAGE分析

參照Laemmli[29]的方法，分離膠質(zhì)量分數(shù)10%，濃縮膠質(zhì)量分數(shù)5%，電極緩沖液含0.05 mol/L Tris，0.384 mol/L甘氨酸，0.1% SDS。上樣量為15 μL；開始電泳時濃縮膠電壓為80 V，待樣品進入分離膠后電壓改為120 V。電泳結(jié)束后，取出膠片用考馬斯亮藍染色，用無水乙醇-冰醋酸脫色至背景清晰。

1.3.7.2 蛋白質(zhì)量濃度的檢測

考馬斯亮藍法[30]測定蛋白質(zhì)量濃度。標準曲線測定：取潔凈的試管，分別加入0.1 mg/mL標準牛血清白蛋白溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL，依次加入蒸餾水補足體積至1 mL。各管加入5 mL考馬斯亮藍溶液，混勻后室溫靜置5 min，在595 nm波長處測定吸光度。用1 mL蒸餾水作為空白對照，制得標準曲線為y=5.81x+0.071，R2=0.999，線性關(guān)系良好，說明可用于肌動蛋白質(zhì)量濃度的測定。

1.3.7.3 肌動蛋白純度鑒定[31]

將凍干粉復(fù)溶為1 mg/mL的蛋白溶液，通過分析型反相高效液相色譜（reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）進行純度鑒定，色譜柱：反相C18柱；進樣體積：20 μL；流速：1 mL/min；柱溫：25 ℃，檢測波長：214 nm。選用的流動相為：A液（純水），B液（100%乙腈）。洗脫條件：0～5 min，0%～20% B；5～8 min，20%～40% B；8～15 min，40%～60% B；15～20 min，60%～20% B。肌動蛋白純度按式（5）計算：

1.3.7.4 CE定量檢測肌動蛋白

CE檢測條件A[23]：未涂層熔融石英毛細管柱，有效分離長度44 cm；DAD：檢測波長194 nm；CE壓力進樣0.5 psi×5 s；電壓15 kV；分離溫度25 ℃。運行緩沖液：10 mmol/L的四硼酸鈉、50 mmol/L的SDS溶液，鹽酸溶液調(diào)其pH 9.2。

CE檢測條件B[24]：未涂層熔融石英毛細管柱，有效分離長度44 cm；運行緩沖溶液為20 mmol/L的PBS，pH 7.4，DAD：檢測波長214 nm，分離電壓10 kV，分離溫度25 ℃，CE壓力進樣0.5 psi×5 s。

1.3.7.5 溶液配制

兔肌動蛋白溶液：稱取0.001 1 g市售兔肌動蛋白，運行緩沖液溶解定容至0.5 mL，0.45 μm濾膜過濾后上機；透析液進樣溶液：取肌動蛋白透析液0.5 mL，加入1 mL內(nèi)標物對乙酰氨基酚（1 mg/mL），運行緩沖液定容至5 mL，0.45 μm濾膜過濾后上機；凍干粉進樣溶液：凍干粉用運行緩沖液復(fù)溶，取2 mL，加入1 mL內(nèi)標物對乙酰氨基酚（1 mg/mL），運行緩沖液定容至5 mL，0.45 μm濾膜過濾后上機。

1.3.7.6 肌動蛋白含量檢測

凍干粉復(fù)溶液，加入內(nèi)標物對乙酰氨基酚后進樣，記錄內(nèi)標物和肌動蛋白的峰面積，按式（6）計算肌動蛋白含量：

式中：C為內(nèi)標物的質(zhì)量濃度/（mg/mL）；A1、A2分別為內(nèi)標物和肌動蛋白的峰面積；N為稀釋倍數(shù)；V為肌動蛋白定溶體積/mL；M為肌動蛋白凍干粉的質(zhì)量/mg。

1.4 數(shù)據(jù)分析

肌動蛋白質(zhì)量濃度平行測定3 次，用Excel 2007計算，結(jié)果用表示。應(yīng)用Origin 8.5軟件繪制相圖、折線圖及MECC-DAD圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙水相體系的建立

2.1.1 3 種醇-鹽雙水相體系相圖

本實驗研究了不同分子質(zhì)量的高聚醇PEG、小分子短鏈醇與磷酸氫二鉀，異丙醇與3 種鹽形成的雙水相體系，采用濁點法繪制雙水相體系的相圖分別如圖1～3所示。

圖1 PEG-磷酸氫二鉀體系相圖Fig. 1 Phase diagrams of PEG/K2HPO4 ATPS

由圖1可知，PEG 600與磷酸氫二鉀體系的分相能力最好，在PEG 600質(zhì)量分數(shù)范圍5.4%～46%，磷酸氫二鉀質(zhì)量分數(shù)范圍5.1%～24%均可以形成穩(wěn)定的雙水相。PEG 2 000～10 000與磷酸氫二鉀體系分相能力較弱，其中PEG 4 000～10 000與磷酸氫二鉀體系的相圖幾乎重合，說明PEG 4 000～10 000與磷酸氫二鉀體系的分相能力相同。

由圖2可知，磷酸氫二鉀與乙醇、異丙醇的分相能力較好，在乙醇質(zhì)量分數(shù)范圍4%～34%，鹽質(zhì)量分數(shù)范圍6%～48%都可以形成穩(wěn)定的雙水相；在異丙醇質(zhì)量分數(shù)范圍2.4%～30%，鹽質(zhì)量分數(shù)范圍7%～48%都可以形成穩(wěn)定的雙水相。

圖2 醇-磷酸氫二鉀體系相圖Fig. 2 Phase diagrams of alcohol/K2HPO4 ATPS

圖3 異丙醇-鹽雙水相體系相圖Fig. 3 Phase diagrams of isopropanol/salt ATPS

由圖3可知，異丙醇與磷酸氫二鉀、硫酸銨、碳酸鈉均可在較大質(zhì)量分數(shù)范圍內(nèi)形成雙水相。

2.1.2 2 種雙水相體系對鱖魚肌動蛋白分離的影響

2.1.2.1 PEG-磷酸氫二鉀體系分離肌原纖維蛋白中的肌動蛋白電泳

按照1.3.3節(jié)中的方法配制不同分子質(zhì)量的PEG與磷酸氫二鉀雙水相體系，如表2所示。加入肌原纖維蛋白后室溫靜置3 h，分離出上下相進行SDS-PAGE，結(jié)果如圖4所示。

表2 PEG-磷酸氫二鉀體系組成Table 2 Composition of PEG/K2HPO4 systems

圖4 PEG-磷酸氫二鉀體系提取肌動蛋白SDS-PAGE圖Fig. 4 SDS-PAGE profile of actin extracted by PEG/K2HPO4 ATPS

由圖4可知，PEG 600-磷酸氫二鉀體系的上相有2 條帶：肌動蛋白和原肌球蛋白；PEG 2 000～10 000與磷酸氫二鉀體系的上相有2 條帶：肌鈣蛋白和原肌球蛋白。所有體系的下相均沒有條帶檢出，所有體系均不能分離出肌動蛋白單條帶。因此PEG-磷酸氫二鉀體系不能滿足本實驗分離肌動蛋白的要求，在后續(xù)實驗中不再采用PEG-磷酸氫二鉀體系。

2.1.2.2 醇-磷酸氫二鉀體系分離肌原纖維蛋白中的肌動蛋白有機溶劑的選擇

按照1.3.3節(jié)中的方法配制不同短鏈醇與磷酸氫二鉀雙水相體系（表3），加入肌原纖維蛋白后室溫靜置3 h，分離出上下相進行SDS-PAGE，結(jié)果如圖5所示。

圖5 醇-磷酸氫二鉀體系提取肌動蛋白SDS-PAGE圖Fig. 5 SDS-PAGE profile of actin extracted by alcohol/K2HPO4 ATPS

表3 雙水相提取肌動蛋白最佳有機溶劑的選擇Table 3 Choice of optimum organic solvent for ATPS

由圖5可知，正丙醇、異丙醇與磷酸氫二鉀體系的上相只有肌動蛋白一條帶，下相沒有蛋白檢出。其他體系的上相或下相不只含有肌動蛋白一條帶。由表3可以看出，異丙醇-磷酸氫二鉀體系提取肌動蛋白的提取率最高，達11.74%。因此，最佳有機溶劑選擇異丙醇。

2.1.2.3 異丙醇-鹽體系分離肌原纖維蛋白中的肌動蛋白無機鹽的選擇

按照1.3.3節(jié)中的方法配制不同無機鹽與異丙醇雙水相體系（表4），加入肌原纖維蛋白后室溫靜置3 h，分離出上下相進行SDS-PAGE，結(jié)果如圖6所示。

圖6 異丙醇-鹽雙水相體系SDS-PAGE圖Fig. 6 SDS-PAGE profile of actin extracted by isopropanol/salt ATPS

表4 雙水相提取肌動蛋白最佳無機鹽的選擇Table 4 Choice of optimum inorganic salt for ATPS

由圖6可知，異丙醇-碳酸鈉體系的上相含有肌動蛋白和肌球蛋白，異丙醇-硫酸銨體系和異丙醇-磷酸氫二鉀體系的上相均只含有肌動蛋白一種蛋白，不含肌球蛋白等其他蛋白。由表4可知，異丙醇-硫酸銨體系的肌動蛋白提取率高于異丙醇-磷酸氫二鉀體系，因此最佳無機鹽選擇硫酸銨。

2.2 單因素試驗優(yōu)化肌動蛋白提取條件

2.2.1 異丙醇質(zhì)量分數(shù)對肌動蛋白提取率的影響

圖7 異丙醇質(zhì)量分數(shù)對肌動蛋白提取率的影響Fig. 7 Inf l uence of isopropanol concentration on actin extraction yield

雙水相體系硫酸銨質(zhì)量分數(shù)為10%，pH 7.0，加入肌原纖維蛋白溶液1 mL，考察不同異丙醇質(zhì)量分數(shù)對肌動蛋白提取率的影響。由圖7可知，當(dāng)體系中異丙醇質(zhì)量分數(shù)為28%時，肌動蛋白提取率最高，達15.88%，隨著異丙醇質(zhì)量分數(shù)的降低或者增加，提取率都隨之降低。原因可能是由醇的親水/疏水平衡值變化引起的[28]。醇類物質(zhì)同時具有極性和非極性基團，與蛋白質(zhì)分子的相互作用包含了親水相互作用和疏水相互作用的平衡；可能隨著醇用量的增加，上相中的親水/疏水平衡值改變，進而影響肌動蛋白提取率。因此，雙水相最佳異丙醇質(zhì)量分數(shù)為28%。

2.2.2 硫酸銨質(zhì)量分數(shù)對肌動蛋白提取率的影響

圖8 硫酸銨質(zhì)量分數(shù)對肌動蛋白提取率的影響Fig. 8 Inf l uence of ammonium sulfate concentration on actin extraction yield

雙水相體系異丙醇質(zhì)量分數(shù)為28%，pH 7.0，加入肌原纖維蛋白溶液1 mL，考察不同硫酸銨質(zhì)量分數(shù)對肌動蛋白提取率的影響。由圖8可知，隨著體系中硫酸銨質(zhì)量分數(shù)的增加，提取率降低。當(dāng)體系中硫酸銨的質(zhì)量分數(shù)為10%時，肌動蛋白提取率最高，達15.51%?？赡苁请S著鹽用量的增加導(dǎo)致下相體積增大、水增多，由于上相中水量減少致使上相的親水/疏水平衡值降低。因此，雙水相體系最佳硫酸銨質(zhì)量分數(shù)為10%。

2.2.3 體系pH值對肌動蛋白提取率的影響

圖9 體系pH值對肌動蛋白提取率的影響Fig. 9 Inf l uence of pH on actin extraction yield

雙水相體系硫酸銨質(zhì)量分數(shù)為10%，異丙醇質(zhì)量分數(shù)為28%，加入肌原纖維蛋白溶液1 mL，考察體系不同pH值對肌動蛋白提取率的影響。體系pH值變化可以改變蛋白質(zhì)表面的電荷，從而影響蛋白質(zhì)在兩相間的分布。由圖9可以看出，隨著pH值的增加，上相肌動蛋白的提取率先升高后下降，且在體系的pH值為8時，肌動蛋白提取率最高，為13.62%，隨著pH值的改變，提取率隨之降低，雙水相體系最佳pH值為8。

2.2.4 肌原纖維蛋白添加量對肌動蛋白提取率的影響

圖10 不同肌原纖維蛋白加入量提取肌動蛋白SDS-PAGE圖Fig. 10 SDS-PAGE profile of actin extracted with different amounts of myofibrillar proteins

雙水相體系硫酸銨質(zhì)量分數(shù)為10%，異丙醇質(zhì)量分數(shù)為28%，考察體系不同肌原纖維蛋白添加量對肌動蛋白提取率的影響。由圖10可知，不同肌原纖維蛋白加入量的雙水相體系上相主要蛋白成分為肌動蛋白。隨著肌原纖維蛋白加入量的增加，雜蛋白逐漸開始出現(xiàn)。當(dāng)加入量為20%時，開始出現(xiàn)雜蛋白d；當(dāng)加入量為30%時，開始出現(xiàn)雜蛋白a；當(dāng)加入量為40%時，開始出現(xiàn)雜蛋白b和c。研究表明，隨著肌原纖維蛋白加入量增加，對雙水相體系提取率有一定影響。

2.3 雙水相提取肌動蛋白條件的響應(yīng)面法優(yōu)化

運用Design-Expert 8.0.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析軟件，選取硫酸銨質(zhì)量分數(shù)、異丙醇質(zhì)量分數(shù)和體系pH值3 個因素，采用3因素3水平的響應(yīng)面分析方法對雙水相提取肌動蛋白條件進行優(yōu)化設(shè)計。以肌動蛋白的提取率為響應(yīng)值。響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果見表5。

表5 響應(yīng)面優(yōu)化雙水相提取肌動蛋白試驗設(shè)計與結(jié)果Table 5 Box-Behnken design in terms of coded data with experimental values of actin extraction yield

表6 各因素和回歸方程的方差分析Table 6 Analysis of variance of the effect of various factors on actin extraction yield

運用Design-Expert 8.0.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析軟件對表5數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到肌動蛋白提取率與異丙醇質(zhì)量分數(shù)（A）、硫酸銨質(zhì)量分數(shù)（B）和體系pH值（C）的二次多項回歸方程：Y=10.48-1.10A-0.91B+1.66C-0.55AB+0.50AC-0.16BC-0.23A2-1.61B2+1.27C2。

由表6可知，回歸方程模型的P值為0.015 2，差異顯著，表明該方程擬合度較好。失擬項P值為0.356 9，差異不顯著，模型不失擬，選擇合理。各因素對肌動蛋白提取率的影響順序為C（體系pH值）＞A（異丙醇質(zhì)量分數(shù)）＞B（硫酸銨質(zhì)量分數(shù)）。當(dāng)優(yōu)化條件為異丙醇質(zhì)量分數(shù)26%、硫酸銨質(zhì)量分數(shù)11%、pH 9.0時，模型預(yù)測肌動蛋白提取率可達為13.815 2%。為了檢驗預(yù)測模型的有效性，在最優(yōu)工藝條件下進行3 次平行實驗，肌動蛋白提取率為11.04%，略低于回歸方程的預(yù)測值，標準偏差為1.39%。

提取的肌動蛋白和兔肌動蛋白采用SDS-PAGE法驗證，結(jié)果如圖11所示，各泳道均出現(xiàn)清晰的肌動蛋白條帶。雙水相上相溶液（泳道1）和兔肌動蛋白溶液（泳道5）顯示出肌動蛋白一條帶，無明顯雜蛋白；肌動蛋白凍干粉溶液電泳圖中（泳道3、4）顯示有少量雜蛋白，推測在制備樣品凍干粉過程中，少量蛋白變性及少量高分子肌動蛋白水不溶性。凍干粉水溶液經(jīng)分析型RP-HPLC檢測（圖12），與溶劑空白對照，面積積分顯示肌動蛋白凍干粉的純度達到94.26%，表明雙水相體系分離肌動蛋白的有效性。

圖11 驗證實驗SDS-PAGE圖Fig. 11 SDS-PAGE profile obtained in verification experiments

圖12 溶劑空白（a）及肌動蛋白（b）HPLC圖Fig. 12 HPLC chromatograms of blank (a) and actin (b)

2.4 肌動蛋白質(zhì)量濃度分析與定量

2.4.1 雙水相組成體系放大與肌動蛋白質(zhì)量濃度分析

為了實現(xiàn)大規(guī)模制備樣品，在響應(yīng)面優(yōu)化雙水相體系組成體系的基礎(chǔ)上，用考馬斯亮藍法檢測雙水相體系上相肌動蛋白質(zhì)量濃度，結(jié)果如圖13所示，不同實驗條件下雙水相體系上相的肌動蛋白質(zhì)量濃度有一定的差異。當(dāng)雙水相體系組成為異丙醇質(zhì)量分數(shù)26%、硫酸銨質(zhì)量分數(shù)11%，pH 9.0時，肌動蛋白測定質(zhì)量濃度最高，肌動蛋白提取率達到13.54%，因此后續(xù)在此條件下進行雙水相體系放大實驗制備肌動蛋白。

圖13 考馬斯亮藍法檢測肌動蛋白質(zhì)量濃度Fig. 13 Actin concentration determined by Coomassie blue method

2.4.2.2 肌動蛋白樣品進樣模式對肌動蛋白出峰時間的影響

提取的鱖魚肌動蛋白分別以凍干粉和透析液與內(nèi)標物混合的形式進樣，結(jié)果如圖16所示。透析液進樣模式下的內(nèi)標物和肌動蛋白出峰時間分別為4.4 min和9.8 min；凍干粉進樣模式下的內(nèi)標物和肌動蛋白出峰時間分別為4.5 min和9.7 min。2 種樣品進樣模式下內(nèi)標物和肌動蛋白的出峰時間沒有差異，考慮到提取的鱖魚肌動蛋白的保存，后續(xù)采用凍干粉進樣模式對肌動蛋白定量。

2.4.2 CE法定量分析肌動蛋白

2.4.2.1 肌動蛋白分離條件選擇與出峰時間確定

將兔肌動蛋白、魚肌動蛋白分別溶解后進行CE法分析。由圖14可知，在磷酸鹽緩沖體系中，兔肌動蛋白和提取的魚肌動蛋白出峰時間均在12 min左右；由圖15可知，在四硼酸鈉-SDS緩沖體系中，兔肌動蛋白和提取的魚肌動蛋白的出峰時間均在10 min左右。肌動蛋白在四硼酸鈉-SDS緩沖體系中的信號強度遠高于磷酸鹽緩沖體系中的強度，在實驗中發(fā)現(xiàn)肌動蛋白易溶于四硼酸鈉-SDS溶液而難溶于磷酸鹽溶液，這是由于SDS具有吸附、增溶、形成膠束等功能[32]，可增加肌動蛋白的溶解度、減少蛋白在毛細管壁的吸附程度，提高電泳的分離速度。因此選擇四硼酸鈉-SDS緩沖體系對肌動蛋白定量檢測。

圖14 磷酸鹽體系肌動蛋白的MECC-DAD圖Fig. 14 MECC-DAD chromatogram of actin separated in phosphate buffer solution

圖15 四硼酸鈉-SDS體系肌動蛋白的MECC-DAD圖Fig. 15 MECC-DAD chromatogram of actin separated in sodium tetraborate-SDS system

圖16 鱖魚肌動蛋白凍干粉（a）和透析液（b）進樣的MECC-DAD圖Fig. 16 MECC-DAD chromatograms of fish actin lyophilized powder (a)and dialysate (b)

2.4.2.3 肌動蛋白內(nèi)標法定量分析

雙水相體系放大500 倍，肌原纖維蛋白加入量分別為10%和30%，制備肌動蛋白凍干粉。研究中精確稱取凍干粉溶于緩沖液定容至5 mL，各取2 mL凍干粉復(fù)溶液，加入1 mL對乙酰氨基酚內(nèi)標物（1 mg/mL），運行緩沖液定容至5 mL，0.45 μm濾膜過濾后分別進樣，記錄內(nèi)標物和肌動蛋白的峰面積，計算出肌動蛋白含量。

圖17 內(nèi)標物和凍干粉樣品檢測的MECC-DAD圖Fig. 17 MECC-DAD chromatograms of internal standard and lyophilized powder sample

表7 CE定量檢測肌動蛋白含量Table 7 Quantitative detection of actin content by MECC-DAD

由圖17可知，內(nèi)標物出峰時間為4.5 min；2 個批次肌動蛋白樣品MECC-DAD圖基線平穩(wěn)，無雜峰干擾。由表7可知，肌原纖維蛋白加入量為10%和30%制備的肌動蛋白CE檢測含量相近，每個樣品3 次測定結(jié)果比較接近，重復(fù)性實驗結(jié)果相對標準偏差均小于8%，重復(fù)性良好。

3 結(jié) 論

本實驗篩選了高分子PEG-鹽和低分子醇-鹽2 種雙水相體系提取鱖魚肌原纖維蛋白中的肌動蛋白，結(jié)合SDS-PAGE和肌動蛋白提取率最終確定最佳分離體系為異丙醇-硫酸銨雙水相體系。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法分析確定了雙水相提取鱖魚肌動蛋白的最佳工藝條件：異丙醇質(zhì)量分數(shù)26%、硫酸銨質(zhì)量分數(shù)11%、pH 9.0。在此工藝條件下進行3 次平行實驗，肌動蛋白提取率為（11.04±0.54）%，略低于模型預(yù)測值。毛細管膠束電動色譜MECC-DAD法研究結(jié)果顯示，肌動蛋白的定量出峰時間約為10 min，CE圖譜基線平穩(wěn)無雜峰。肌原纖維蛋白加入量分別為10%和30%，放大制備肌動蛋白凍干粉，檢測含量相近，實驗結(jié)果相對標準偏差均小于8%，重復(fù)性良好。研究結(jié)果為名貴魚類質(zhì)量品質(zhì)屬性鑒定及魚類肌動蛋白標準品的研制奠定基礎(chǔ)，為魚類蛋白功能開發(fā)利用及快速定量檢測提供理論依據(jù)。