基于非靶向代謝組學的白茶與綠茶、烏龍茶和紅茶代謝產(chǎn)物特征比較

李鑫磊，俞曉敏，林 軍,4，趙小嫚，張 妍，林宏政,5，郝志龍,5，金心怡,5,*

（1.福建農(nóng)林大學園藝學院，福建 福州 350002；2. 福建農(nóng)林大學 福建省茶學重點實驗室，福建 福州 350002；3.福建農(nóng)林大學海峽聯(lián)合研究院園藝植物生物學及代謝組學研究中心，福建 福州 350002；4.福建微生物研究所，福建 福州 350007；5.福建農(nóng)林大學茶葉研究所，福建 福州 350002）

福建省特種茶類包括綠茶、紅茶、烏龍茶和白茶[1]，其中白茶產(chǎn)量2016年占全國產(chǎn)量的80%左右[2]。白茶以其獨特的甘甜、醇爽的品質(zhì)風格越來越為消費者所接受[3]。白茶具有良好的保健功效，在白茶原產(chǎn)地素有“一年茶，三年藥，七年寶”的說法[4]，研究證明，白茶具有保護小鼠肝臟和腦部組織免受急性氧化應(yīng)激損傷[5]、保護神經(jīng)細胞[6]以及抗癌[7]等作用。白茶全程萎凋后直接烘干的加工方式造成其內(nèi)特殊的代謝物積累模式，從而形成其獨特的品質(zhì)與保健特點。

近年來，越來越多研究關(guān)注于白茶的代謝物積累與其形成的加工原理[8-9]。已有研究表明，白茶與綠茶和紅茶之間代謝物含量分布存在較大差異[8]，兒茶素組分含量低于綠茶而高于紅茶，而茶黃素則相反[10]，游離氨基酸總量高于綠茶、烏龍茶、紅茶和黑茶[11]。然而，目前進行的研究大多基于靶向測定不同茶類樣本中特定的物質(zhì)含量，對茶樣整體代謝物特征進行比較分析的研究尚少，且尚未有針對白茶、綠茶、烏龍茶和紅茶這4 類福建省特種茶類之間代謝差異物質(zhì)及其加工原理的非靶向代謝組學研究。

福云六號與黃旦茶樹品種均為福建省廣泛種植的國家級優(yōu)良茶樹品種，適制綠茶、烏龍茶、紅茶和白茶[12]。其中，福云六號因其適制性廣、成茶品質(zhì)優(yōu)異[13]等特點，已成為福建省栽種面積最大的品種，部分茶區(qū)甚至占85%以上[14]；黃旦品種適制性同樣較廣，制成的綠茶、烏龍茶和紅茶品質(zhì)俱佳[12]。福云六號品種為大葉種[12]，而黃旦為中葉種原產(chǎn)于福建南部[12]。因此，本研究選擇福云六號與黃旦茶樹品種一芽二三葉鮮葉為原料，按照白茶、綠茶、烏龍茶和紅茶加工方法制成相應(yīng)茶類。使用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜測定白茶和其他茶類中全部代謝物質(zhì)豐度，進而篩選并鑒定出白茶與其他茶類之間差異代謝物，通過對比白茶與其他茶類之間差異代謝物豐度，探究白茶代謝物特征及其加工學原理，以期為白茶加工工藝改良、滋味品質(zhì)提升和功能性成分富集等方面研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

嫩度為一芽二三葉的福云六號、黃旦茶樹鮮葉各25 kg于2016年10月采自福建麒麟山茶葉有限公司與福建農(nóng)林大學南山茶園。將各品種鮮葉平均分成5 份，1 份用于原料直接熱風固樣、烘干為鮮葉樣品，其余4 份根據(jù)不同加工方法分別制成為綠茶、烏龍茶、紅茶和白茶（圖1）。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechingallate，EGCG）、表沒食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）、兒茶素（catechin，C）、表兒茶素沒食子酸酯（epicatechingallate，ECG）、表兒茶素（epicatechin，EC）、沒食子兒茶素（gallocatechin，GC）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（gallocatechin gallate，GCG），純度≥95%；乙腈（質(zhì)譜級）、甲醇（色譜級）、甲酸（純度98%） 美國Sigma公司；去離子水通過Milli-Q凈水系統(tǒng)獲得。

圖1 不同茶類加工工序與工藝參數(shù)Fig. 1 Processing procedures and parameters of different types of tea

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜儀 美國Waters公司；KQ-300GDV恒溫數(shù)控超聲波清洗器昆山超聲儀器公司；Milli-Q Advantage A10純水系統(tǒng)德國Merck Millipore公司；7754070冷凍干燥機 美國Labconco公司；MC京制00000246精密天平 德國Sartorius公司；5430R臺式高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；G560E渦旋振蕩器 美國Industrial Industries公司。

1.3 方法

1.3.1 茶樣前處理[15]

將各茶類毛茶分裝于50 mL Eppendorf離心管中，離心管蓋戳洞后放入冷凍干燥機中凍干，凍干條件為真空度0.02 mbar、溫度-50 ℃。凍干后的毛茶用研砵研磨成均勻粉末，稱取30 mg，加入1 mL甲醇。渦旋混勻后于25 ℃超聲20 min，12 000×g離心10 min，后轉(zhuǎn)移上清液至離心管中，放置-20 ℃冰箱保存。用前稀釋50 倍，各茶葉樣本均有3 個生物學重復。

1.3.2 儀器檢測條件[15]

利用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)采集。

超高效液相色譜條件：色譜柱：BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫：40 ℃；流動相A（0.1%甲酸溶液），流動相B（含有0.1%甲酸的乙腈溶液）；梯度洗脫：0～2 min（100%～93% A、0%～7% B），2～13 min（93%～60% A、7%～40% B），13～14 min（60%～0% A、40%～100% B），14～17 min（0%～100% A、100%～0% B）；流速：0.3 mL/min。

飛行時間質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI）；檢測模式ESI-；毛細管電壓1.5 kV；全信息串聯(lián)質(zhì)譜碰撞能量10～40 eV；掃描范圍50～1 200 Da；離子源溫度120 ℃；去溶劑化溫度500 ℃；去溶劑化流速800 L/h；錐孔電壓40 V。

1.4 數(shù)據(jù)處理

超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)利用Waters MassLynx采集，采集到的數(shù)據(jù)再導入到Progenesis QI 2.1（Nonlinear Dynamics公司）軟件中進行峰對齊、峰識別、歸一化等數(shù)據(jù)前處理。差異化合物篩選條件：P＜0.05、VIP＞1、Fold Change＞1.5，再利用SIMCA 13.0（Sartorius公司）對篩選后的物質(zhì)進行主成分分析以及載荷圖繪制。比對HMDB、Metlin、Massbank等數(shù)據(jù)庫、標準物質(zhì)以及相關(guān)文獻對篩選出物質(zhì)進行鑒定。

圖表制作利用Microsoft Office 2010（微軟公司），繪制熱圖利用MeV 4.9.0（J. Craig Venter Institute公司），顯著性分析利用SPSS 19.0（IBM公司）Turkey HSD檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 白茶和其他茶類整體代謝物分布特征分析

不同茶類樣本中共檢測到2 717 個物質(zhì)信號，這些信號經(jīng)篩選后，福云六號品種篩選出的不同茶類之間代謝差異物為152 個，黃旦品種篩選出的不同茶類之間代謝差異物為148 個。上述代謝差異物信號經(jīng)過標準樣品、數(shù)據(jù)庫和參考文獻比對，共鑒定出33 個差異代謝物（表1），其中包括6 個單體兒茶素類、3 個兒茶素衍生物類、1 個水解單寧、4 個花青素類、11 個黃酮醇或黃酮糖苷類、4 個酚酸類以及4 個茶黃素類。

圖2 白茶及其他茶類的主成分分析Fig. 2 Principle component analysis plots for white tea and other types of tea

主成分分析圖可反映樣本中代謝物豐度情況，樣本之間位置越近則越相似越遠則反之。從圖2可以看出，福云六號品種的主成分分析中，第1主成分占62%，第2主成分占31.6%，總和為93.6%；黃旦品種的主成分分析中，第1主成分占71.7%，第2主成分占16%，總和為87.7%，上述2 個品種的第1、2主成分已包含不同茶類中大部分的物質(zhì)信息。可以看出，不同茶類之間得到較好分離，綠茶位置與鮮葉樣品最接近，接近第1主成分負軸的軸線，而白茶位于第1主成分的正軸，第2主成分的負軸位置，顯示白茶與綠茶在第1主成分和第2主成分上化合物均存在明顯差異。從第1主成分方向上看，由負軸到正軸依次為鮮葉樣品、綠茶、烏龍茶、白茶和紅茶，綠茶和紅茶之間距離最遠，顯示第1主成分中的化合物反映了茶樣的發(fā)酵程度。從第2主成分方向上看，綠茶、烏龍茶和紅茶均在第2主成分的正軸上，而白茶位于第2主成分的負軸，顯示白茶代謝產(chǎn)物在第2主成分中的獨特性。

表1 不同茶類中鑒定出的差異代謝物Table 1 Differential metabolites identified among different types of tea

圖3 白茶與其他茶類的差異物質(zhì)載荷圖Fig. 3 Loading plots for white tea and other types of tea

主成分載荷圖反映樣本中代謝物在不同主成分中的分布。從圖3可以看出，第1主成分負軸分布的物質(zhì)主要為兒茶素、兒茶素衍生物和花青素組分，對應(yīng)鮮葉樣品與綠茶樣本位置；正軸為茶黃素、酚酸和黃酮醇或黃酮糖苷類物質(zhì)，對應(yīng)紅茶與白茶。第2主成分正軸分布主要為非酯型兒茶素組分、茶黃素組分、花青素組分，對應(yīng)鮮葉樣品、綠茶、烏龍茶和紅茶，負軸分布主要為酯型兒茶素、兒茶素衍生物和黃酮醇或黃酮糖苷類物質(zhì)，對應(yīng)白茶。因此，黃酮醇或黃酮糖苷類物質(zhì)、酯型兒茶素以及兒茶素衍生物是白茶區(qū)別于其他茶類的主要代謝特征。

2.2 黃酮醇或黃酮糖苷在白茶和其他茶類中的代謝特征分析

圖4 白茶與其他茶類中鑒定出的物質(zhì)豐度熱圖Fig. 4 Heatmaps of abundances of the identified compounds in white tea and other types of tea

茶葉中主要的黃酮醇或黃酮糖苷苷元為山柰酚、槲皮素、楊梅素和芹菜素等[24]。從圖4可以看出，白茶中大部分黃酮醇或黃酮糖苷顯著高于其他茶類，顯示白茶加工工藝有利于黃酮醇或黃酮糖苷類物質(zhì)保留與積累。而不同苷元的糖苷在其他茶類中分布不一，綠茶中山柰酚糖苷顯著低于紅茶，在福云六號中顯著低于烏龍茶；烏龍茶槲皮素糖苷較低；紅茶中楊梅素糖苷顯著低于其他茶類。研究表明，綠茶和烏龍茶在殺青過程均引起大部分黃酮醇或黃酮糖苷降低[25-26]，說明制茶過程中的高溫條件會引起黃酮醇或黃酮糖苷類物質(zhì)分解，含量降低。研究也表明，紅茶在發(fā)酵后，大部分酮醇或黃酮糖苷類物質(zhì)開始明顯降低，特別是楊梅素糖苷[27]。白茶在加工全程未經(jīng)歷高溫處理，葉片結(jié)構(gòu)完整，因此黃酮醇或黃酮糖苷類物質(zhì)在白茶中得以保留[8]。另外，茶葉中黃酮醇糖苷、花青素和兒茶素組分存在共同前體（圖5），白茶特殊的加工工藝可能有利于前體物質(zhì)形成黃酮醇或黃酮糖苷，并引起該物質(zhì)積累。

圖5 兒茶素組分、黃酮醇糖苷和茶黃素代謝通路簡圖Fig. 5 Simplified metabolism pathways of catechins, flavonol glycosides and theaf l avins

2.3 單體兒茶素和花青素組分在白茶和其他茶類中的代謝特征分析

從圖4可以看出，白茶大部分兒茶素組分顯著低于綠茶，非酯型兒茶素與紅茶相當，而酯型兒茶素如EGCG和ECG顯著高于紅茶，顯示白茶加工工藝引起兒茶素組分較大程度降低，其中非酯型兒茶素降低更明顯。研究表明，兒茶素在攤放和萎凋過程就開始降低轉(zhuǎn)化[28-29]，綠茶殺青使多酚氧化酶等酶類活性鈍化后兒茶素在殺青后得以保留[30-31]；烏龍茶萎凋后進入做青工序，做青時，茶葉葉緣區(qū)域由于受到機械力作用，集中于液泡中的兒茶素組分[32]因液泡膜透性增加而與細胞質(zhì)基質(zhì)中多酚氧化酶等酶類接觸[33]，兒茶素組分因受到部分酶促氧化而較綠茶更低，烏龍茶的葉緣區(qū)域也因此變紅，形成“三紅七綠”的品質(zhì)特征；紅茶萎凋后進入揉捻和發(fā)酵工序，揉捻使鮮葉細胞膜和細胞壁充分破碎，兒茶素組分與多酚氧化酶等酶類充分接觸，在發(fā)酵2 h后大量降低，茶黃素組分和茶雙沒食子兒茶素等兒茶素氧化產(chǎn)物顯著增加，形成“紅湯紅葉”的品質(zhì)特征[34]；白茶全程萎凋的工藝特點使得葉片物理結(jié)構(gòu)保持完整，酶活性未受破壞，但兒茶素仍有較大幅度降低，特別是非酯型兒茶素。白茶中降低的兒茶素組分可能通過氧化聚合等作用形成茶黃素、茶紅素、兒茶素衍生物等其他復雜的中間產(chǎn)物[35]。最近，白茶中分離出茶氨酸與兒茶素組分組成的衍生物[36-37]，也發(fā)現(xiàn)兒茶素聚合物茶雙沒食子兒茶素A和B在白茶中有較高積累[8]。

從圖4可以看出，花青素組分與兒茶素組分規(guī)律類似，大部分花青素組分在白茶和紅茶中明顯低于鮮葉樣品、綠茶和烏龍茶。研究表明，花青素及其苷類物質(zhì)在萎凋和發(fā)酵過程中降低[38]。

2.4 茶黃素組分和兒茶素衍生物在白茶和其他茶類中的代謝特征分析

茶黃素組分是紅茶中主要的酚類物質(zhì)，由兒茶素組分轉(zhuǎn)化而來[39]。從圖4可以看出，綠茶由于發(fā)酵程度最低，因此4 種茶黃素組分均顯著低于紅茶。紅茶所有茶黃素組分均顯著高于綠茶，而烏龍茶茶黃素含量均介于綠茶與紅茶之間，顯示出烏龍茶做青工序與紅茶揉捻和發(fā)酵工序?qū)Σ椟S素形成機理類似，只是做青工序造成的發(fā)酵程度更低。而白茶中茶黃素和黃旦品種中的茶黃素-3-沒食子酸酯顯著高于綠茶，茶黃素-3’-沒食子酸酯和茶黃素-3,3’-沒食子酸酯則與綠茶之間無顯著差異，顯示白茶加工過程中茶黃素積累存在組分特異性。說明白茶的茶黃素積累方式與烏龍茶和紅茶有所不同，可能是由于白茶在加工過程中葉片細胞結(jié)構(gòu)始終未受到機械力作用導致。

由酯型兒茶素轉(zhuǎn)化而成的茶黃素-3’-沒食子酸酯和茶黃素-3,3’-沒食子酸酯在白茶中積累量少，因此推測降低的酯型兒茶素可能更多地自動氧化、異構(gòu)化或形成兒茶素衍生物[36,40]。8-C-抗壞血酸基-EGCG是EGCG與抗壞血酸形成的一種衍生物，從圖4可以看出，白茶中8-C-抗壞血酸基-EGCG顯著高于其他茶類，而其他茶類之間并無顯著差異，顯示白茶加工工藝有利于8-C-抗壞血酸基-EGCG的積累。8-C-抗壞血酸基-EGCG被證明對艾滋病有治療作用[41]?？箟难岷虴GCG在室溫條件下反應(yīng)6 d后，8-C-抗壞血酸基-EGCG不斷大幅增加，而6-C-抗壞血酸基-EGCG則增加量較少[40]。白茶加工過程中經(jīng)歷的長時間萎凋（48～72 h）可能是8-C-抗壞血酸基-EGCG在茶葉中積累的原因。

3 結(jié) 論

本實驗通過應(yīng)用非靶向代謝組學方法對由鮮葉原料加工而成的白茶與綠茶、烏龍茶、紅茶中的所有代謝產(chǎn)物進行測定、篩選并最終鑒定出茶葉中33 種主要的代謝產(chǎn)物。主成分分析表明白茶特征代謝產(chǎn)物為黃酮醇或黃酮糖苷類物質(zhì)、酯型兒茶素和兒茶素衍生物。白茶中黃酮醇或黃酮糖苷類物質(zhì)顯著高于其他茶類；兒茶素顯著低于綠茶并接近紅茶，特別是非酯型兒茶素，花青素與兒茶素相似；與紅茶和烏龍茶中酯型兒茶素聚合形成茶黃素-3-沒食子酸酯與茶黃素-3,3’-沒食子酸酯不同，白茶中酯型兒茶素可能更多地形成衍生物如8-C-抗壞血酸基-EGCG。白茶特殊的加工特點形成了白茶上述獨特的代謝產(chǎn)物特征，加工對白茶特定代謝物影響的機理尚待進一步深入研究。