GC-MS 結(jié)合電子鼻分析復(fù)熱對亞油酸-木糖-半胱氨酸體系揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響

張哲奇，臧明伍*，張凱華，李 丹，王守偉，李笑曼

（中國肉類食品綜合研究中心，北京食品科學(xué)研究院，肉類加工技術(shù)北京市重點實驗室，北京 100068）

豬肉是我國居民主要肉類來源，豬肉及其制品在我國消費量極大。目前隨著我國生活方式的改變，對即熱、即食型的豬肉制品需求不斷增加，但由于豬肉在加工、儲存、復(fù)熱過程中風(fēng)味的變化規(guī)律、影響因素以及具體的反應(yīng)機理、機制尚未完全闡明[1]，豬制品中存在的“蒸煮味”、“過熱味”等不良風(fēng)味無法得到有效控制，降低了消費者對產(chǎn)品的接受度，影響了產(chǎn)品的進一步推廣。

現(xiàn)有研究表明，豬肉中風(fēng)味物質(zhì)的生成途徑主要為脂質(zhì)降解、美拉德反應(yīng)、硫氨酸的降解以及脂肪氧化-美拉德反應(yīng)之間的相互作用[2]。美拉德反應(yīng)主要是發(fā)生在還原糖的羰基和氨基酸的氨基之間，通過一系列復(fù)雜的反應(yīng)，最終生成含氮雜環(huán)化合物和類黑精等物質(zhì)，反應(yīng)過程中生成的含硫化合物具有典型的肉香氣，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于肉味香精的生產(chǎn)。美拉德反應(yīng)中，反應(yīng)底物對于最終的風(fēng)味影響較大，如半胱氨酸作為底物其產(chǎn)物風(fēng)味與雞肉類似；甘氨酸則產(chǎn)生焦糖；谷氨酸參與反應(yīng)的產(chǎn)物則以苦杏仁味為主；木糖作為底物肉香較為豐富，葡萄糖則以焦香為主[3-4]；核糖雖然也可以參與反應(yīng)生成肉味香精，但是其熱穩(wěn)定性在常見還原糖中最低，容易發(fā)生熱解[5]。此外pH值和反應(yīng)溫度等也是影響產(chǎn)物的重要因素，侯莉等[6]研究了不同pH值下反應(yīng)體系的產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)物隨pH值升高呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，并在pH 5.5時達到最高；曹長春等[7]則發(fā)現(xiàn)在pH 5.5條件下140 ℃反應(yīng)溫度能夠產(chǎn)生更多的含硫揮發(fā)性物質(zhì)。

脂類降解是肉風(fēng)味形成的重要途徑，但是不同的脂肪對風(fēng)味的貢獻影響差異極大。有研究將皮下脂肪和肌內(nèi)脂肪分別添加到去脂豬肉中，發(fā)現(xiàn)添加肌內(nèi)脂肪后樣品的風(fēng)味發(fā)生了顯著的改變，風(fēng)味物質(zhì)的總峰面積達到處理前的2.5 倍，加入皮下脂肪則對風(fēng)味貢獻較不明顯。還有研究將豬肉中的皮下以及肌內(nèi)脂肪分別去除，發(fā)現(xiàn)去除皮下脂肪基本沒有改變豬肉的風(fēng)味，而當(dāng)肌內(nèi)脂肪被去除后豬肉的風(fēng)味產(chǎn)生較大的變化[8]。導(dǎo)致這一現(xiàn)象出現(xiàn)的主要原因可能是由于肌內(nèi)脂肪中的磷脂含量較高，張曉等[9]認為肌內(nèi)磷脂在水解產(chǎn)生大量不飽和游離脂肪酸的同時更易被接觸氧氣使其作為前體物質(zhì)對風(fēng)味的貢獻大于甘油酯。

脂肪氧化降解與美拉德體系的相互作用由于反應(yīng)復(fù)雜程度較高，影響因素較多，是近年來風(fēng)味研究的一個重點。目前國內(nèi)有對脂肪氧化產(chǎn)物脂肪醛對美拉德反應(yīng)體系影響的研究，如己醛、庚醛、(E)-2-庚烯醛和(E,E)-2,4-癸二烯醛等典型脂肪醛。結(jié)果顯示不同醛類對美拉德反應(yīng)的促進作用差異較大，如己醛會抑制美拉德中、末期反應(yīng)，而烯醛則對其有促進作用。總體上脂肪醛的添加會降低含硫化合物的生成，但會促進新的含硫化合物以及呋喃類化合物的產(chǎn)生[10-12]。但是目前脂肪醛前體物如磷脂、不飽和脂肪酸等與美拉德體系的相互作用以及復(fù)熱對其風(fēng)味影響的研究較少。亞油酸是豬肉中最豐富的不飽和脂肪酸，目前已知其是己醛、(E)-2-壬烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛的主要前體物質(zhì)，對于豬肉風(fēng)味的貢獻較大[13]。所以本研究采用氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用、電子鼻等分析手段，考察亞油酸對美拉德產(chǎn)物的影響以及復(fù)熱前后亞油酸-美拉德體系的揮發(fā)性物質(zhì)變化，以期為進一步研究脂肪氧化-降解體系與美拉德體系的相互作用以及過熟味的生成機制提供研究基礎(chǔ)及參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L-半胱氨酸（99.0%）、D-(+)木糖（98.0%）、亞油酸（＞97%） 麥克林生化科技有限公司；二水合磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉（均為分析純） 上海滬試實驗室器材股份有限公司；正構(gòu)烷烴（C8～C20） 北京化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TSQ8000 GC-MS聯(lián)用儀、TG Wax MS極性柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國賽默飛世爾科技（中國）有限公司；PEN3型便攜式電子鼻傳感器 德國Airsense公司；Tenax TA石英玻璃吸附管、TC-20型Tenax-TA吸附管自動凈化儀 德國Gerstel公司。

1.3 方法

1.3.1 模擬體系的制備

將12.48 g二水合磷酸二氫鈉溶于200 mL去離子水，配制成磷酸二氫鈉溶液；將2.84 g磷酸氫二鈉溶于100 mL去離子水，配制成磷酸氫二鈉溶液；在需要使用時將上述兩種溶液以92∶8的體積比例混合成所需要的緩沖溶液，pH 5.5[14]。每組均稱取木糖4 mmol（0.6 g）、L-半胱氨酸4 mmol（0.484 g）[15]，加入到50 mL配制好的緩沖溶液中。其中對照組不添加亞油酸，實驗組添加0.3%的亞油酸[16]，添加與亞油酸組等量的亞油酸并進行復(fù)熱處理。采用磁力攪拌器攪拌10 min，之后將容器置于高壓反應(yīng)釜中在120 ℃加熱60 min。加熱結(jié)束后用冷水浴降溫至室溫，然后將容器置于4 ℃熟化24 h后備用。復(fù)熱處理在4 ℃冷藏5 d后，沸水浴加熱30 min[17]。

1.3.2 電子鼻傳感器檢測

準(zhǔn)確量取1 mL樣品，放入樣品瓶，25 ℃平衡2 h，運用PEN3型電子鼻傳感器對不同樣品進行檢測。傳感型號在60 s后基本穩(wěn)定，選定信號采集時間為70 s。每種樣品分別做5 次平行重復(fù)。

1.3.3 樣品的動態(tài)頂空前處理條件

用移液槍吸取10 mL樣品裝入動態(tài)頂空瓶中，加入1 μL質(zhì)量濃度 0.816 μg/μL的2-甲基-3庚酮作為內(nèi)標(biāo)物，旋緊瓶蓋。動態(tài)頂空瓶的一端通氮氣，氮氣流速為50 mL/min，另一端接老化至無色譜雜峰的TA吸附管，在55 ℃恒溫條件下富集30 min，之后取出吸附管并插入半自動熱脫附進樣器進樣口進樣。

半自動熱脫附進樣條件：采用標(biāo)準(zhǔn)加熱模式；氦氣流速20 mL/min；不分流進樣；初始溫度40 ℃，延遲0.1 min，保持0.1 min，然后以40 ℃/min上升至210 ℃，保持5 min；傳輸線溫度215 ℃。

冷進樣條件：采用標(biāo)準(zhǔn)加熱模式；液氮冷卻，初始溫度-100 ℃，平衡0.1 min，之后以10 ℃/min升至215 ℃，保持5 min；分流比20∶1。

1.3.4 GC條件

采用TG-Wax MS極性色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為高純氦氣（純度＞99.99%）；流速1.0 mL/min；采用不分流模式，保持2 min。升溫程序：柱溫起始溫度40 ℃，保持3 min，之后以5 ℃/min速率升溫到200 ℃，保持1 min，再以8 ℃/min速率升溫到220 ℃，保持3 min。進樣口溫度250 ℃。

1.3.5 MS條件

電子電離源；傳輸線溫度230 ℃；電子能量70 eV；離子源溫度280 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z40～600；全掃描模式。

1.4 數(shù)據(jù)處理

1.4.1 定性分析

譜庫檢索鑒定：采用NIST和Willey譜庫檢索，選取正反匹配度均大于800的化合物實現(xiàn)定性鑒定。

保留指數(shù)（retention index，RI）：按式（1）計算各揮發(fā)物的RI并與文獻中的RI進行比對。

式中：Rt（x）、Rt（n）及Rt（n+1）分別為待測揮發(fā)性成分、含n個碳原子正構(gòu)烷烴及（n+1）個碳原子正構(gòu)烷烴的保留時間/min。

1.4.2 定量分析

根據(jù)已知內(nèi)標(biāo)2-甲基-3庚酮含量對揮發(fā)性組分進行定量分析，并依據(jù)化合物的峰面積比值與含量呈正比的原理，按式（2）計算每一種風(fēng)味化合物相對于內(nèi)標(biāo)化合物的含量：

式中：CX為未知揮發(fā)性化合物含量/（μg/kg）；C0為內(nèi)標(biāo)化合物質(zhì)量濃度/（μg/μL）；V0為內(nèi)標(biāo)化合物進樣體積/μL；SX為未知揮發(fā)性化合物的峰面積/（AU·min）；S0為添加的內(nèi)標(biāo)化合物峰面積/（AU·min）；m為試樣質(zhì)量/kg。

1.4.3 風(fēng)味成分評價

采用氣味活度值（odor active value，OAV）評價各化合物對樣品總體風(fēng)味的貢獻；0.1＜OAV＜1，說明該物質(zhì)對總體風(fēng)味有修飾作用；OAV＞1，說明該物質(zhì)可能對總體風(fēng)味有直接影響；在一定范圍內(nèi)，OAV越大說明該物質(zhì)對總體風(fēng)味貢獻越大[18]。按式（3）計算：

式中：C為物質(zhì)含量/（μg/kg）；T為嗅覺閾值/（μg/kg）。

1.4.4 統(tǒng)計分析

采用SPSS 19.0軟件進行方差分析；其他數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010進行處理。

電子鼻數(shù)據(jù)分析：運用Winmuster軟件對數(shù)據(jù)進行主成分分析（principal component analysis，PCA）和線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理組揮發(fā)性物質(zhì)及其含量

表1 不同處理模擬體系中揮發(fā)性物質(zhì)的分析Table 1 Analysis of volatile substances in different reaction systems

續(xù)表1

表2 不同處理模擬體系中揮發(fā)性物質(zhì)種類及含量Table 2 Classes and amounts of volatile compounds formed in three reaction systems

如表1、2所示，在3 個處理組中，共檢測到53 種揮發(fā)性物質(zhì)，其中烴類14 種，酮類8 種，醇類4 種，醛類4 種，酸類5 種，酯類2 種，氮氧雜環(huán)化合物7 種，含硫化合物9 種，各組共有化合物13 種。13 種共有物質(zhì)中除壬醛外，其余均為含硫化合物如噻吩、硫醇類物質(zhì)以及含氮或者含氧的雜環(huán)類物質(zhì)如呋喃、吡咯、吡嗪等，均為常見的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物。3 個處理組揮發(fā)性物質(zhì)種類數(shù)依次增高，分別為16、38、51 種，但亞油酸組中揮發(fā)性物質(zhì)含量最高為2 330.71 μg/kg，高于對照組的1 598.61 μg/kg和亞油酸復(fù)熱組的1 675.09 μg/kg。

2.2 亞油酸對美拉德反應(yīng)體系揮發(fā)性物質(zhì)的影響

亞油酸作為豬肉中主要的不飽和脂肪酸，對于豬肉風(fēng)味的貢獻極大。加入亞油酸后模擬體系中檢出了大量的烴類、酮類、醛類物質(zhì)。其中烷烴類物質(zhì)主要為芳香烴、烯烴（如二甲苯、苯乙烯）等，但是烴類物質(zhì)普遍嗅覺閾值較高，對風(fēng)味的貢獻較小；醛類物質(zhì)主要為(E,E)-2,4-癸二烯醛，這是一種典型的亞油酸降解產(chǎn)物，具有典型脂肪、油炸香氣，是豬肉中重要的風(fēng)味物質(zhì)，此外己醛、辛醛等也有檢出；酮類物質(zhì)最主要為異佛爾酮，具有樟腦和薄荷香氣。

對比對照組和亞油酸組可知，木糖-半光氨酸體系中加入亞油酸后主要美拉德反應(yīng)產(chǎn)物如呋喃甲醛、3-甲基-2-呋喃硫醇、2-甲基-3-戊硫醇、糠基硫醇等的含量顯著降低，這主要可能是由于脂肪酸氧化生成的醛類物質(zhì)與木糖競爭半胱氨酸的氨基降低了木糖-半胱氨酸的反應(yīng)速率；以及由于烯醛類物質(zhì)對美拉德中末期反應(yīng)的促進，導(dǎo)致呈味的美拉德反應(yīng)中期產(chǎn)物含量減少，而不揮發(fā)的類黑精生成增加。此外，由于美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有較強的抗氧化能力，而這一機制是通過電子還原作用分解過氫化物，生成二硫化物等途徑實現(xiàn)的，也導(dǎo)致了美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的降低[18-21]。

2.3 復(fù)熱對亞油酸-美拉德模擬體系揮發(fā)性物質(zhì)的影響

對比復(fù)熱前后的亞油酸-美拉德反應(yīng)體系，可見揮發(fā)性物質(zhì)的種類增加而總含量降低。除了酸、醇類物質(zhì)外，復(fù)熱組其余物質(zhì)含量均低于未復(fù)熱組。生成的酸類物質(zhì)中主要為辛酸，是亞油酸二次氧化的典型產(chǎn)物，生成路徑是亞油酸在氧化過程中活性雙烯丙基C11上的氫脫除生成的戊二烯基，戊二烯基被氧化產(chǎn)生共軛的C9-氫過氧化物，最終氫過氧化物裂解產(chǎn)生辛酸[22]。(E,E)-2,4-癸二烯醛和反-2-壬烯醛同樣也來源于C9-氫過氧化物的裂解，復(fù)熱組中(E,E)-2,4-癸二烯醛含量的下降可能是由于復(fù)熱過程中美拉德反應(yīng)產(chǎn)物對其生成產(chǎn)生了抑制，而反-2-壬烯醛在復(fù)熱前后均未檢出，提示美拉德反應(yīng)產(chǎn)物對其生成的抑制可能更為強烈，也可能與本體系反應(yīng)條件相關(guān)[23]。戊醇、己醛主要源于與C9-氫過氧化物同時生成的C13-氫過氧化物裂解，復(fù)熱后這2 種物質(zhì)含量均有增加，說明C13-氫過氧化物裂解途徑受美拉德反應(yīng)產(chǎn)物影響不大。值得注意的是1-辛烯-3-醇在亞油酸自然氧化過程中隨氧化時間延長含量呈下降趨勢，但是在本研究中僅在復(fù)熱組中出現(xiàn)，說明其產(chǎn)生可能需要相對溫和的反應(yīng)環(huán)境，該物質(zhì)嗅覺閾值較低，具有典型的蘑菇、泥土香氣，可能與復(fù)熱后的不良風(fēng)味具有相關(guān)性。

復(fù)熱組美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的下降除受到亞油酸降解產(chǎn)物的影響外，也與反應(yīng)時間延長，美拉德反應(yīng)中期階段產(chǎn)生的糠醛及其衍生物、二羰基化合物、醛類物質(zhì)，經(jīng)過進一步縮合聚合形成復(fù)雜的、不易揮發(fā)的高分子色素類黑精所致[24-25]。

2.4 OAV分析

表3 不同處理模擬體系中揮發(fā)性物質(zhì)OAVTable 3 OAVs of volatile substances formed in different reaction systems

如表3所示，在對照組中，對風(fēng)味貢獻較大的主要是含硫化合物，這類物質(zhì)具有極低的嗅覺閾值，具有典型的肉香味[26]。亞油酸組中，對風(fēng)味貢獻較大的除含硫化合物之外還有醛類物質(zhì)，整體風(fēng)味中肉香味降低，油脂香味增加。亞油酸復(fù)熱組中醛類、含硫化合物對風(fēng)味的貢獻均低于亞油酸組，其中含硫化合物為3 組最低，但醇類物質(zhì)（主要是1-辛烯-3-醇）的貢獻有所提升，表明復(fù)熱對風(fēng)味的不良影響可能是由于肉香味物質(zhì)含量的降低以及不飽和醇含量的增加[27-29]。

2.5 電子鼻分析

表4 電子鼻傳感器響應(yīng)類型及響應(yīng)值Table 4 Electronic nose sensor responses to volatile substances formed in different reaction systems

圖1 電子鼻測定結(jié)果的PCA（A）和LDA（B）Fig. 1 PCA (A) and LDA (B) of electronic nose sensor responses to volatile compounds formed in different reaction systems

由于TA吸附管對不同類型的揮發(fā)性物質(zhì)吸附能力存在差異，為更加全面地評價不同組之前的風(fēng)味變化，采用電子鼻對各處理組揮發(fā)性成分進行分析。如表4所示，木糖-半胱氨酸體系中，響應(yīng)最高的物質(zhì)主要為氮氧化物、無機硫化物、有機硫化物，且與其他2 組差異顯著（P＜0.05），與GC-MS測定結(jié)果相同。但是與GC-MS檢測結(jié)果相異的是，亞油酸組與亞油酸復(fù)熱組各傳感器響應(yīng)值差異極小，即使統(tǒng)計學(xué)分析顯示差異具有顯著性（P＜0.05）。與第1組相比，后兩組主要為芳香族、烷烴類、醛、酮、醇類物質(zhì)響應(yīng)值高（P＜0.05），總體上與GC-MS檢測結(jié)果一致，但響應(yīng)值增加幅度不大。上述差異可能是由于電子鼻中檢測含硫化合物的傳感器響應(yīng)靈敏度更高。值得注意的是，氮氧化合物電子鼻檢測器響應(yīng)值較高，但檢測出的氮氧化合物其OAV并不高，表明可能存在某些小分子揮發(fā)性化合物對反應(yīng)體系風(fēng)味具有貢獻。類似的還有無機硫化物，尤其是復(fù)熱后其響應(yīng)值相比復(fù)熱前增加，表明無機硫化物也可能對復(fù)熱產(chǎn)生的不良風(fēng)味有一定貢獻。

采用電子鼻配套軟件對不同處理組進行PCA和LDA，PC1、PC2的方差貢獻率分別為83.61%和13.39%，總貢獻率為97.00%，說明2 個主成分能夠較好反映各組樣本。由圖1A可知，不同處理組組內(nèi)一致性較好且各處理組之間具有較好區(qū)分度，3 個處理組在主成分空間中呈線性排列，亞油酸組在PC1和PC2上貢獻率均最低，而亞油酸復(fù)熱組貢獻率均最高，說明添加亞油酸與美拉德反應(yīng)的相互作用降低了其在主成分空間的貢獻率，而復(fù)熱處理則能極大提高其貢獻率。

LDA和PCA均基于數(shù)據(jù)降維的統(tǒng)計學(xué)處理方法，但是與PCA相比LDA更側(cè)重反映各組間的差異。處理中LD1、LD2的方差貢獻率分別為87.66%和6.75%，LD1、LD2的總貢獻率為94.41%，說明該處理能夠較好反映樣本信息。如圖1B所示，3 個處理組組內(nèi)一致性和組間區(qū)分度較好，亞油酸組與對照組的差異表明亞油酸產(chǎn)物含量增加的同時會抑制美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的生成，其中亞油酸復(fù)熱組在LD1和LD2上貢獻均最小，與亞油酸組相比在LD1上貢獻變化較大，說明在復(fù)熱處理會導(dǎo)致體系揮發(fā)性物質(zhì)含量尤其是亞油酸氧化產(chǎn)物含量的降低。

3 結(jié) 論

本實驗采用動態(tài)頂空-GC-MS和電子鼻分析了亞油酸對美拉德體系的作用以及復(fù)熱對亞油酸-木糖-半胱氨酸的影響。測定出了53 種揮發(fā)性物質(zhì)，其中共有物質(zhì)13 種。添加亞油酸后，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物含量下降并且對其中含硫化合物對風(fēng)味的貢獻也相應(yīng)降低，說明亞油酸對于美拉德反應(yīng)的進行具有一定的抑制作用。未復(fù)熱前亞油酸降解產(chǎn)物中對風(fēng)味具有較大貢獻的是(E,E)-2,4-癸二烯醛，其他檢測到的大多數(shù)揮發(fā)性物質(zhì)對風(fēng)味貢獻較低。復(fù)熱處理后，模擬體系中除酸、醇類物質(zhì)外，其他類物質(zhì)含量均呈降低趨勢，其中1-辛烯-3-醇在復(fù)熱組中對風(fēng)味的貢獻相對較為明顯提示其在真實體系中可能是熱異味的來源之一。電子鼻分析顯示3 個組之間揮發(fā)性物質(zhì)構(gòu)成差異區(qū)分明顯，無機硫化物可能是復(fù)熱導(dǎo)致熱異味的一個重要因素。