基于UPLC-Q-TOF-MS 分析酵母對葡萄酒中糖苷態(tài)香氣物質(zhì)釋放的影響

安效輝，苗瀛心，陳 倬，張欣珂，段長青，潘秋紅*

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，葡萄與葡萄酒研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部葡萄酒加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

葡萄果實(shí)直接為葡萄酒提供品種香，包括萜烯類、降異戊二烯類、芳香族類、脂肪族類、吡嗪類香氣物質(zhì)等[1]。這些香氣物質(zhì)按照其揮發(fā)性可以分為游離態(tài)和結(jié)合態(tài)。結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)不具有揮發(fā)性，沒有直接的香氣貢獻(xiàn)，通常被稱為香氣前體物，但它們可以在葡萄酒發(fā)酵和陳釀過程中，被酵母糖苷酶水解或葡萄酒環(huán)境酸水解，轉(zhuǎn)變?yōu)橛袚]發(fā)的、可感知的游離態(tài)香氣物質(zhì)[2]，進(jìn)而共同貢獻(xiàn)于葡萄酒的品種香氣。由于結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)在葡萄果實(shí)總香氣物質(zhì)中占有很大的比例，因此，這類物質(zhì)是釀酒葡萄原料中潛在的極為重要的香氣組分，對葡萄酒品質(zhì)起著重要作用[3]。

結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)根據(jù)其結(jié)合方式的不同可分為兩大類，一類是與單糖或雙糖鍵合形成的糖苷態(tài)，另一類是與氨基酸或小分子肽以硫鍵的形式結(jié)合的前體物[3]。糖苷態(tài)香氣物質(zhì)的結(jié)構(gòu)分為兩部分，一部分是具有揮發(fā)性的配基，另一部分是糖苷配體，二者通過β-糖苷鍵連接[1]。揮發(fā)性配基主要是單萜、降異戊二烯等香氣化合物，糖苷配體主要有單糖苷和二糖苷，單糖苷通常是β-D-吡喃葡萄糖苷，雙糖苷主要是己糖基-葡萄糖苷，如6-O-α-L-吡喃鼠李糖苷-β-D-吡喃葡萄糖苷即蕓香糖苷，也有戊糖基-葡萄糖苷，如6-O-α-L-呋喃阿拉伯糖基-β-D-吡喃葡萄糖苷、6-O-α-L-呋喃芹菜糖基-β-D-吡喃葡萄糖苷[4-6]。也有文獻(xiàn)報道鑒定到了單萜三糖苷，以己糖基-戊糖基-己糖苷的形式存在[7]。糖苷態(tài)香氣前體物轉(zhuǎn)化為游離態(tài)物質(zhì)的最終濃度，主要取決于葡萄果汁中糖苷態(tài)香氣前體物的濃度、發(fā)酵中酵母糖苷態(tài)酶的活性、貯藏過程中的葡萄酒pH值和溫度等[3]。

糖苷態(tài)香氣前體物在葡萄酒發(fā)酵過程中分解方式主要為酶解[8]，通過糖苷酶釋放香氣配基可以是一步反應(yīng)也可以是連續(xù)反應(yīng)。單糖苷可以通過β-葡萄糖苷酶裂解釋放，而二糖苷或三糖苷則需要特定的水解酶降解糖苷鍵，往往先順序斷裂末端的戊糖或己糖，最后裂解O-葡萄糖苷鍵。不過也存在一步切開糖苷鍵的雙糖苷酶，如β-葡萄糖苷內(nèi)切酶[9]。在發(fā)酵過程中，發(fā)酵帶來的香氣可以補(bǔ)充品種的香氣[10]，酵母中的糖苷酶對葡萄酒香氣的提升具有十分重要的作用[11]，且不同菌株在發(fā)酵條件下的相對酶活性和特異性底物會有所差異[12-14]，因此，釀酒時所用酵母菌株的不同也會影響到葡萄酒的感官香氣和酒體風(fēng)格，釀酒師可以通過選用不同的酵母菌株對葡萄酒的整體香氣進(jìn)行微調(diào)[15]。

已有研究在許多不同葡萄品種中都檢測到了糖苷結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)存在[16-18]。糖苷結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)的檢測通常采用氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用的方法，即先固相萃取糖苷態(tài)香氣物質(zhì)，接著用糖苷水解酶（如AR2000）或添加鹽酸進(jìn)行水解，得到揮發(fā)性配基，采用GC-MS對香氣配基進(jìn)行定性和定量分析[19]。樣品處理所采用的酸解法和酶解法都存在一定的局限性，酸解法中萜烯物質(zhì)會發(fā)生分子重排，導(dǎo)致物質(zhì)結(jié)構(gòu)改變[20]；而酶解法存在酶解不充分的問題，測得的水解產(chǎn)物不能完全代表結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)的天然存在形式[21]。也有研究利用液相色譜-高分辨率質(zhì)譜和二級質(zhì)譜研究葡萄中的糖苷態(tài)香氣物質(zhì)[7,22-23]。相比之下，超高效液相色譜技術(shù)具有更好的穩(wěn)定性和靈敏度，擁有更好的定性能力，且已經(jīng)廣泛應(yīng)用于肉類、乳類藥物殘留檢測等食品安全檢測領(lǐng)域[24-25]。利用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間-質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole-time-of-flight-mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）法檢測糖苷態(tài)香氣物質(zhì)，不會改變其配基和糖苷的組成，能夠檢測到物質(zhì)原有的結(jié)構(gòu)形式，可以更好地反映糖苷態(tài)香氣物質(zhì)的含量及其變化，避免水解樣品帶來的弊端。TOF的精確質(zhì)量檢測可對物質(zhì)進(jìn)行精準(zhǔn)的推測，進(jìn)而結(jié)合MS/MS檢測結(jié)果鑒定物質(zhì)的結(jié)構(gòu)[2,26]。實(shí)驗(yàn)室在前人研究方法的基礎(chǔ)上[7,22]，建立葡萄果實(shí)主要糖苷態(tài)香氣物質(zhì)質(zhì)譜信息庫。本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-Q-TOF-MS方法，研究2 種酵母Red Fruit和Zymaf l ore ST分別在‘北冰紅’冰酒和‘威代爾’冰酒的發(fā)酵過程中，對糖苷態(tài)香氣前體物含量的影響，以及瓶儲1 年后葡萄酒中糖苷態(tài)香氣前體物含量的變化，從而評價酵母對糖苷態(tài)香氣物質(zhì)釋放的效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

所有樣品均取自吉林通化集安市鴨江谷酒莊。

Zymaf l ore ST酵母 法國Laffort公司；Red Fruit活性干酵母、Extra Zym果膠酶 意大利Enartis公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；HX-250恒溫循環(huán)器 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；SHB-IIIA循環(huán)水式多用真空泵 上海振捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SHZ-DIII循環(huán)水式真空泵 天津奧特塞恩斯儀器有限公司；Agela負(fù)壓真空固相萃取裝置 天津博納艾杰爾科技有限公司；1290 Infinicty II UPLC-Q-TOF（6545 Q-TOF）-MS儀 美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 冰酒發(fā)酵流程及取樣

發(fā)酵流程：對已達(dá)到理論成熟度后70 d的‘北冰紅’葡萄和‘威代爾’葡萄果實(shí)，在-13 ℃條件下人工采收，通過振動分選臺進(jìn)行穗選，用框式壓榨機(jī)壓榨，得到的葡萄汁經(jīng)在線添加90 mg/L SO2，入罐至450 L發(fā)酵罐，讓其自然沉淀，并向其中添加果膠酶，6 ℃澄清3 d，分離清汁，待回溫至12 ℃后接種酵母，接種量為30 g/（h·L），發(fā)酵溫度控制在12～14 ℃之間，發(fā)酵結(jié)束（約42 d）后將溫度降低至0 ℃以終止乙醇發(fā)酵。倒罐，澄清過濾，過濾后添加100 mg/L SO2。穩(wěn)定過濾后，用GAI灌裝線，裝瓶于375 mL瓶中，打入天然軟木塞。貯藏于相對濕度60%～70%，溫度（16±1）℃的酒窯中?！北t’品種每種酵母做2 個重復(fù)，而‘威代爾’每種酵母做1 個重復(fù)，共6 個發(fā)酵罐。

取樣方法：接種酵母前（葡萄汁）取樣1 次，葡萄發(fā)酵液比重每下降0.02取樣一次，發(fā)酵結(jié)束后取樣一次，每個發(fā)酵罐每次取樣500 mL于礦泉水瓶中。對用Red Fruit發(fā)酵的‘北冰紅’冰酒在過濾和瓶儲1 年后各取樣1 次。所有樣品均于-40 ℃條件下貯藏待用。

1.3.2 糖苷態(tài)香氣物質(zhì)的固相萃取

用10 mL甲醇（分析純）和10 mL純凈水依次活化Cleanert PEP-SPE固相萃取柱，將2 mL冰酒樣品加入活化后的萃取柱中，依次用2 mL水和5 mL二氯甲烷分別洗滌低分子質(zhì)量的糖、酸等極性化合物和游離態(tài)的非極性香氣化合物，最后用20 mL甲醇洗脫并收集糖苷態(tài)香氣前體物。將洗脫液置于蒸餾燒瓶中，30 ℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用2 mL甲醇（優(yōu)級純）復(fù)溶，充分搖勻。取1 mL提取液，加入10 μL內(nèi)標(biāo)（100 mg/Ln-辛基-β-D-葡萄糖苷），最后用0.22 μm有機(jī)相濾膜過濾待用。

1.3.3 糖苷態(tài)香氣物質(zhì)的檢測

使用UPLC-Q-TOF-MS檢測各種糖苷態(tài)香氣物質(zhì)的含量。

UPLC條件：Agilent SB C18RRHD色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相為含0.1%甲酸溶液（A相）和含0.1%甲酸的乙腈（B相）；流速0.4 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量5 μL；梯度洗脫：0～40 min，5%～95% B。

QTOF檢測條件：采用Dual AJS電子電離源，負(fù)離子模式；每個循環(huán)采集3 個母離子；一級質(zhì)譜（MS）采集范圍m/z100～900；二級質(zhì)譜（MS/MS）m/z20～600；采集頻率4 sprctra/s；鞘氣（氮?dú)猓┝魉?0 L/min，400 ℃；干燥氣（氮?dú)猓┝魉? L/min，350 ℃；霧化氣壓60 psig；噴嘴電壓1 kV；毛細(xì)管電壓3.5 kV。使用標(biāo)準(zhǔn)混合物（調(diào)諧液）G1969-85000（Supelco Inc.）進(jìn)行負(fù)質(zhì)量校準(zhǔn)，并且預(yù)期質(zhì)量偏差為±0.2×10-6，校準(zhǔn)物質(zhì)為三氟乙酸銨（m/z112.985 6）和三氟乙酸陰離子加合物（m/z1 033.988 1）。

1.3.4 糖苷態(tài)香氣物質(zhì)的定性定量分析

通過樣品的二級質(zhì)譜信息與個人化合物數(shù)據(jù)庫和譜庫（PCDL庫）進(jìn)行比對，找到具有一定斷裂規(guī)律的物質(zhì)進(jìn)行定性分析。由于目前可購得的糖苷態(tài)香氣物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品很少，而且戊糖中的阿拉伯糖、芹菜糖、木糖等化合物均具有相同分子式，大部分單萜組分也有相同的分子式且結(jié)構(gòu)極為相似，在相同的碰撞能量下，同一類化合物的斷裂情況也極為相似，所以本研究只對物質(zhì)進(jìn)行種類的定性分析，根據(jù)各物質(zhì)進(jìn)行相對定量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

由于固相萃取效率會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生一定影響，每個取樣做2 個萃取重復(fù)，每個重復(fù)上機(jī)做2 個測定平行。采用SPSS統(tǒng)計軟件ANOVA進(jìn)行顯著性分析；采用Origin Pro 9.0軟件繪圖；測定結(jié)果以 ±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘威代爾’和‘北冰紅’冰酒的主要理化指標(biāo)

表1 ‘北冰紅’和‘威代爾’冰酒的主要理化指標(biāo)Table 1 Physicochemical parameters of ‘Beibinghong’ and‘Vidal’ ice wines

2 種冰酒均采用450 L發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵，如表1所示，2 種酵母發(fā)酵結(jié)束的‘北冰紅’冰酒中，殘?zhí)琴|(zhì)量濃度分別為（225.00±12.50）g/L和（212.50±35.36）g/L結(jié)束，乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為（8.79±0.81）%和（7.66±0.12）%；而‘威代爾’冰酒中，殘?zhí)琴|(zhì)量濃度分別為（162.50±12.50）g/L和（150.00±35.36）g/L，乙醇體積分?jǐn)?shù)分別達(dá)到（7.2 3±0.8 1）%和（7.43±0.12）%；‘威代爾’冰酒中可滴定酸含量高于‘北冰紅’，2 種冰酒的揮發(fā)酸質(zhì)量濃度在1.33～1.56 g/L之間，符合GB/T 25504—2010《冰葡萄酒》要求。

2.2 2 個品種葡萄汁中糖苷態(tài)香氣物質(zhì)種類的比較

2 個品種的葡萄汁中共檢測出30多種不同的糖苷態(tài)香氣前體物質(zhì)，其中單萜二醇-戊糖基葡萄糖苷（C21H36O11）、單萜醇-戊糖基葡萄糖苷（C21H36O10）等都檢測到不同的組分，在葡萄果實(shí)中，單萜醇有里那醇、香葉醇、香茅醇、橙花醇、α-萜品醇等物質(zhì)，戊糖基也有阿拉伯糖基、木糖苷、芹菜糖苷等，它們有相同的分子式且結(jié)構(gòu)相似，在相同碰撞能量下，同類化合物（如單萜二醇-戊糖苷葡萄糖苷）有極其相似的斷裂情況，難以確定具體的化合物，但可以通過保留時間進(jìn)行組分的區(qū)分。如表2所示，‘威代爾’葡萄汁糖苷態(tài)香氣物質(zhì)的種類較‘北冰紅’更為豐富，在‘威代爾’中可檢測到2 個葡萄糖苷、24 個戊糖基-葡萄糖苷和5 個己糖基-葡萄糖苷組分，而在‘北冰紅’中只檢測到11 個戊糖苷-葡萄糖苷和6 個己糖苷-葡萄糖苷組分，說明‘北冰紅’冰酒的香氣潛力相對較弱，這印證了前人的研究結(jié)果[27]。

表2 ‘威代爾’和‘北冰紅’葡萄汁中糖苷態(tài)香氣物質(zhì)的種類Table 2 Composition of glycosidically bound aroma compounds in‘Vidal’ and ‘Beibinghong’ grape juices

2.3 ‘北冰紅’冰酒發(fā)酵過程中2 種酵母對糖苷態(tài)香氣物質(zhì)釋放的影響

2.3.1 對不同糖苷類型的香氣物質(zhì)含量的影響

圖1 酵母Red Fruit和Zyma flore ST發(fā)酵的‘北冰紅’冰酒過程中不同糖苷類型香氣物質(zhì)的變化（n=8）Fig. 1 Variations in various aroma glycoside compounds during fermentation of ‘Beibinghong’ ice wine by Red Fruit or Zyma flore ST (n = 8)

如圖1所示，‘北冰紅’葡萄汁在Red Fruit或Zymaflore ST酵母發(fā)酵下，戊糖基-葡萄糖苷類香氣物質(zhì)的含量均逐漸下降，相比之下，Zymaf l ore ST酵母發(fā)酵的冰酒中，戊糖基-葡萄糖苷的下降較為明顯，表明該酵母中水解戊糖基-葡萄糖苷的酶活性較高。己糖基-葡萄糖苷類香氣物質(zhì)的含量在Zymaf l ore ST酵母發(fā)酵過程中無顯著變化，在Red fruit酵母發(fā)酵過程中甚至有所增加，說明2 種酵母對‘北冰紅’葡萄汁中己糖基-葡萄糖苷香氣物質(zhì)的水解釋放作用較小，相應(yīng)的水解酶活性較低?？傮w上，Zymaf l ore ST酵母和Red Fruit酵母對‘北冰紅’發(fā)酵過程中糖苷態(tài)香氣物質(zhì)的影響有限。

表3 ‘北冰紅’冰酒發(fā)酵過程中各類糖苷態(tài)香氣物質(zhì)質(zhì)量濃度的變化Table 3 Variation in various aroma glycosides compounds during ‘Beibinghong’ ice wine fermentation mg/L

2.3.2 對各類糖苷態(tài)香氣物質(zhì)含量的影響

將‘北冰紅’冰酒中鑒定到的結(jié)合態(tài)組分依據(jù)其定性命名歸為9 類，如表3所示，在戊糖基-葡萄糖苷中，結(jié)合態(tài)單萜二醇是相對含量較高的一類物質(zhì)，在Red Fruit酵母和Zymaf l ore ST酵母的發(fā)酵過程中，其含量均呈逐漸下降趨勢，這可能是導(dǎo)致這類戊糖基-葡萄糖苷總量下降的主要原因（圖1）。而其他3 類戊糖基-葡萄糖苷物質(zhì)，在Red Fruit酵母發(fā)酵起始（0 d）和發(fā)酵結(jié)束時（42 d）均沒有明顯差異，而Zymaflore ST酵母發(fā)酵時，這3 類物質(zhì)含量均隨著發(fā)酵進(jìn)程而下降（表3）。

‘北冰紅’冰酒中鑒定到5 類己糖基-葡萄糖苷香氣物質(zhì)，1-己醇-鼠李糖基-葡萄糖苷含量相對較高，其在Red Fruit酵母發(fā)酵過程中含量有所增加，而在Zymaflore ST酵母發(fā)酵過程中含量幾乎沒有改變；而3-己烯-1-醇-己糖基-葡萄糖苷在2 種酵母發(fā)酵過程中，均表現(xiàn)為下降趨勢。其他3 類隨Red Fruit酵母發(fā)酵，或增加或無明顯變化，但在Zymaf l ore ST酵母發(fā)酵起始與結(jié)束的酒樣中，含量變化很小（表3）。上述結(jié)果表明，2 種酵母發(fā)酵對不同的結(jié)合態(tài)組分的影響存在差異。

2.4 ‘威代爾’冰酒發(fā)酵過程中2 種酵母對糖苷態(tài)香氣物質(zhì)釋放的影響

2.4.1 對不同糖苷類型的香氣物質(zhì)含量的影響

表4 ‘威代爾’冰酒發(fā)酵過程中各類糖苷態(tài)香氣物質(zhì)質(zhì)量濃度的變化Table 4 Variation in various aroma glycosides combounds during fermentation of ‘Vidal’ ice wine mg/L

圖2 酵母Red Fruit和Zyma flore ST發(fā)酵的‘威代爾’冰酒過程中不同糖苷類型香氣物質(zhì)的變化（n=4）Fig. 2 Variation in various aroma glycosides compounds during fermentation of ‘Vidal’ ice wine by Red Fruit or Zyma flore ST (n = 4)

將‘威代爾’冰酒中糖苷結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)歸為3 大類糖苷，分別為葡萄糖苷、戊糖基-葡萄糖苷和己糖基-葡萄糖苷，如圖2所示，Zymaflore ST酵母發(fā)酵的‘威代爾’冰酒中，這3 大類結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)的含量均呈顯著下降趨勢。相比之下，Red Fruit酵母的發(fā)酵作用下，結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)的含量并無明顯變化（己糖基-葡萄糖苷類除外），甚至呈現(xiàn)增加的趨勢，在目前實(shí)驗(yàn)條件下，無法解釋增加的原因，推測可能與三糖苷化合物的水解有關(guān)。以上結(jié)果說明，Zymaf l ore ST酵母發(fā)酵較利于‘威代爾’葡萄酒中糖苷態(tài)香氣前體物的釋放，在‘威代爾’基質(zhì)中，Zymaflore ST酵母中水解不同類型糖苷態(tài)物質(zhì)的酶活性均比較高。而Red Fruit酵母對‘威代爾’葡萄汁中結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)的水解釋放作用較小，相應(yīng)的水解酶活性較低。而Red Fruit酵母并不適合‘威代爾’冰酒的釀造。

2.4.2 對各類糖苷態(tài)香氣物質(zhì)含量的影響

如表4所示，將‘威代爾’冰酒中鑒定得到的結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)依據(jù)本研究的定性命名歸為17 類，但在Zymaflore ST酵母發(fā)酵的冰酒中，1-己醇-戊糖基-葡萄糖苷和香葉酸-鼠李糖基-葡萄糖苷不能被有效地定量，可能與該發(fā)酵罐中這2 類物質(zhì)的含量較低有關(guān)。隨Zymaflore ST酵母的發(fā)酵，除含量較低的3-甲基-1-丁醇-戊糖基-葡萄糖苷沒有明顯變化之外，其他14 類結(jié)合態(tài)物質(zhì)的含量均呈現(xiàn)下降的趨勢。相反，在Red Fruit酵母發(fā)酵‘威代爾’的過程中，與起始階段相比，發(fā)酵結(jié)束時大多數(shù)結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)含量略有升高或幾乎不變。這些結(jié)果進(jìn)一步說明，采用Zymaf l ore ST酵母發(fā)酵，能夠使‘威代爾’葡萄醪中的各種糖苷態(tài)香氣物質(zhì)轉(zhuǎn)化為具有揮發(fā)性的游離態(tài)香氣。

2.5 ‘北冰紅’冰酒過濾和瓶儲1 年后糖苷態(tài)香氣物質(zhì)含量的變化

如表5所示，在葡萄酒發(fā)酵結(jié)束后進(jìn)行過濾處理，經(jīng)過瓶儲1 年后，所有結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)含量均下降，水解率在19.1%～54.5%之間，最高的是單萜醇-鼠李糖苷-葡萄糖苷，結(jié)果表明瓶儲過程中糖苷態(tài)香氣前體物發(fā)生了較明顯的水解，該水解反應(yīng)主要是酸催化的[28]，且這一過程對底物沒有選擇性。這也說明冰酒經(jīng)過1 年的瓶儲會有更多的結(jié)合態(tài)香氣前體物釋放出來。

表5 ‘北冰紅’冰酒（Red Fruit酵母）瓶儲1 年糖苷態(tài)香氣物質(zhì)的變化（n=8）Table 5 Variation in glycosidically bound aroma compounds of‘Beibinghong’ ice wine after aging for one year (n= 8)

注：同行不同字母表示差異顯著（P＜0.05）。

3 討論與結(jié)論

糖苷結(jié)合態(tài)香氣前體物沒有揮發(fā)性，需要經(jīng)過水解釋放揮發(fā)性苷元，水解可通過酶催化或酸催化進(jìn)行[8]，通過糖苷酶釋放苷元的過程可以是一步反應(yīng)，也可以是一系列連續(xù)反應(yīng)，簡單的葡萄糖苷可以通過β-葡萄糖苷酶裂解（一步反應(yīng)），然而結(jié)合了一個非葡萄糖的雙糖，則需要特定的外切酶水解糖苷鍵，如α-鼠李糖苷酶等，接著β-葡萄糖苷鍵再水解釋放出揮發(fā)性苷元[8]。酵母在發(fā)酵過程中具有糖苷酶活性[20]，不同菌株在發(fā)酵條件下的酶相對活性和特異性底物會有所不同[29]，本研究也發(fā)現(xiàn)，無論是對‘北冰紅’還是‘威代爾’，用Red Fruit酵母發(fā)酵對糖苷態(tài)香氣物質(zhì)的影響都明顯不同于用Zymaflore ST酵母。Chassagne等[30]發(fā)現(xiàn)在‘霞多麗’葡萄酒的發(fā)酵過程中，不同酵母菌株對糖苷鍵的水解效果在17%～57%之間變化。

除酵母自身水解酶種類和活性存在差異之外，發(fā)酵基質(zhì)對酶的活性也會產(chǎn)生影響，本研究發(fā)現(xiàn)Zymaf l ore ST酵母發(fā)酵‘威代爾’冰酒時，糖苷態(tài)香氣物質(zhì)有較明顯的水解作用，但發(fā)酵‘北冰紅’冰酒時則沒有這種效果。Zinnai等[31]發(fā)現(xiàn)一些葡萄酒成分，特別是乙醇對β-葡萄糖苷酶活性具有抑制作用。同時，較低的pH值、高葡萄糖濃度也會使酵母中糖苷酶的穩(wěn)定性喪失，導(dǎo)致酶活性的降低[32]。因此在釀酒過程中，對于不同葡萄品種，釀酒師可以通過選用不同的酵母菌株，更好地發(fā)掘葡萄酒的香氣潛力，充分體現(xiàn)出葡萄酒的風(fēng)格。

在葡萄酒陳釀期間，糖苷則經(jīng)歷緩慢的酸水解，已有很多研究證據(jù)表明，酸水解對糖基基團(tuán)沒有選擇性，在低pH值和高溫下會發(fā)生得更快[3]，這解釋了本研究結(jié)果，瓶儲1 年的葡萄酒中，幾乎所有的糖苷態(tài)香氣物質(zhì)含量都下降。

本研究采用UPLC-Q-TOF-MS探究2 個葡萄品種分別在2 種酵母發(fā)酵下糖苷態(tài)香氣物質(zhì)的變化，研究認(rèn)為，酵母Red Fruit和Zymaflore ST對發(fā)酵過程中‘北冰紅’糖苷態(tài)香氣釋放影響較為有限，糖苷態(tài)香氣釋放可能主要在陳釀階段，相對而言，酵母Zymaf l ore ST發(fā)酵較有利于‘威代爾’糖苷態(tài)香氣的釋放。該結(jié)果為冰酒的釀造和陳釀工藝設(shè)計提供了參考。