茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香白酒不同釀造區(qū)域可培養(yǎng)酵母種群結(jié)構(gòu)多樣性分析

羅方雯，黃永光,*，涂華彬

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州茅臺(tái)酒廠（集團(tuán)）習(xí)酒有限責(zé)任公司，貴州 習(xí)水 564622）

醬香白酒屬于固態(tài)發(fā)酵，是多微混菌的開(kāi)放式發(fā)酵過(guò)程，在多種微生物菌群相互調(diào)控作用下形成獨(dú)特的發(fā)酵體系和酒體風(fēng)格[1]，其特殊的酒體風(fēng)格在于其獨(dú)特釀造工藝及釀造環(huán)境所形成的特殊微生物區(qū)系[2]。其微生物區(qū)系包括細(xì)菌、酵母、霉菌等菌群結(jié)構(gòu)的演替[3]。其中，酵母不僅能發(fā)酵糖類產(chǎn)生乙醇，而且能代謝產(chǎn)生豐富的風(fēng)味成分，如生香釀酒酵母和假絲酵母等；再如在不同發(fā)酵條件下，畢赤酵母可以產(chǎn)生醇、酯、酸等多種風(fēng)味物質(zhì)[4-6]，從而影響白酒的產(chǎn)品味感和風(fēng)味特征。

大曲是一種糖化發(fā)酵劑，富含多種酶類和菌類，素有“曲為酒之骨”的說(shuō)法[7]，醬香大曲更是與產(chǎn)品風(fēng)味特征密切相關(guān)的發(fā)酵劑和釀造原料[8]。有研究[9]認(rèn)為高溫制曲不利于酵母生長(zhǎng)，在曲胚出房收曲時(shí)檢出酵母很少，甚至檢不出酵母。但通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）手段對(duì)生產(chǎn)之前的高溫大曲研究發(fā)現(xiàn)，大曲中存在大量酵母，數(shù)量可達(dá)103～104CFU/g[10]。這可能與大曲在貯存、使用過(guò)程富集環(huán)境中的酵母有關(guān)。胡曉龍[11]研究發(fā)現(xiàn)大曲中的微生物可來(lái)源于制曲原材料、空氣、場(chǎng)地、曲房、器具及覆蓋物等；Wang Qiang等[3]通過(guò)DGGE研究表明茅臺(tái)酒發(fā)酵酒醅中微生物來(lái)自大曲、窖泥、高粱、空氣及地面微生物；吳徐建[12]分析醬香大曲與釀造過(guò)程中的酵母，發(fā)現(xiàn)大曲中的酵母進(jìn)入了發(fā)酵過(guò)程，但遠(yuǎn)不及環(huán)境中酵母對(duì)釀造過(guò)程的貢獻(xiàn)。范光先等[13]從茅臺(tái)酒廠周邊生態(tài)環(huán)境中分離鑒定出11 種酵母。張亞麗[14]從茅臺(tái)鎮(zhèn)空氣中分離出16 種酵母。吳徐建[12]從醬香型白酒釀造2～7輪次的環(huán)境、大曲以及酒醅中共分離獲得21 種菌落形態(tài)各異的酵母，通過(guò)比較釀造環(huán)境、大曲、酒醅中的酵母相似性，發(fā)現(xiàn)空氣中存在的酵母種屬與大曲中的酵母種屬基本一致。以往研究可看出釀造環(huán)境及其微生物生態(tài)結(jié)構(gòu)對(duì)大曲酵母菌群結(jié)構(gòu)、白酒釀造均具有舉足輕重的意義。

釀造環(huán)境與大曲都是醬香白酒釀造不可或缺的部分，環(huán)境和大曲中的酵母通過(guò)堆積富集等途徑進(jìn)入發(fā)酵酒醅，對(duì)酒醅的發(fā)酵以及酒體風(fēng)味形成發(fā)揮重要作用。但目前仍然鮮見(jiàn)對(duì)釀造環(huán)境區(qū)域及釀酒大曲中酵母的系統(tǒng)研究。為進(jìn)一步探究環(huán)境微生物結(jié)構(gòu)對(duì)白酒釀造品質(zhì)的影響，本課題在前期利用宏基因組學(xué)系統(tǒng)分析微生物結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，通過(guò)可培養(yǎng)方法，對(duì)茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香白酒7 個(gè)不同釀造區(qū)域1～7輪次釀造環(huán)境和大曲中的可培養(yǎng)酵母菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行一個(gè)年度生產(chǎn)期（1～7輪次）的跟蹤分析研究，擬充分認(rèn)識(shí)不同區(qū)域釀造環(huán)境和大曲之間酵母菌的多樣性結(jié)構(gòu)特征及其關(guān)系，解析大曲中酵母的來(lái)源，以期為分析各區(qū)域白酒品質(zhì)差別提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

取貴州省仁懷市茅臺(tái)鎮(zhèn)觀音寺區(qū)、上坪村、椿樹(shù)村、巖灘村、向陽(yáng)村、盧榮壩村及合馬鎮(zhèn)街道社區(qū)共7 個(gè)釀造醬香型白酒的不同區(qū)域，17 個(gè)代表性釀酒企業(yè)的釀造環(huán)境和生產(chǎn)應(yīng)用大曲樣品。環(huán)境取樣點(diǎn)包括：酒廠生產(chǎn)車(chē)間的窗戶玻璃表面、窗臺(tái)上、晾堂四周墻體表面、晾堂地面、墻角、行車(chē)梯梯子及梁柱表面、配電箱表面、消防箱表面、儲(chǔ)酒罐及其他一些平時(shí)不易被打掃的角落、車(chē)間外地面等。取樣時(shí)間為2018年1-9月，茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香型白酒釀造1～7輪次釀造生產(chǎn)的堆積發(fā)酵期。每個(gè)企業(yè)樣品采集的每次取樣點(diǎn)固定為同一點(diǎn)。按照區(qū)域劃分，將從每個(gè)酒廠采集的樣品等量混合為一個(gè)區(qū)域的綜合樣（研究實(shí)驗(yàn)分析樣品，代表一個(gè)區(qū)域的綜合樣品）。每輪次采集樣品為2 d時(shí)間，采集樣品均勻密封袋、專用箱轉(zhuǎn)運(yùn)，樣品采集完立即生物性保藏運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室研究分析，留存樣低溫保存。

DNA Marker 上海生物工程（上海）股份有限公司；真菌DNA提取試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；核酸染料（Gengreen） 上海賽百盛有限公司；酵母引物（NL1和NL4） 北京全式金生物技術(shù)有限公司。

WL營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基：酵母粉5.0 g、酸水解酪蛋白5.0 g、葡萄糖50.0 g、磷酸二氫鉀0.55 g、氯化鉀0.425 g、氯化鈣0.125 g、硫酸鎂0.125 g、氯化鐵0.002 5 g、硫酸錳0.002 5 g、溴甲酚綠0.022 g、瓊脂17 g，溶于1 000 mL蒸餾水中，pH 5.5±0.2。麥芽汁液體培養(yǎng)基：麥芽膏粉130.0 g、氯霉素0.1 g，溶于1 000 mL蒸餾水中，pH 5.6±0.2。均購(gòu)于上海博微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超凈工作臺(tái) 蘇州金凈科技有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋臺(tái)式、高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Thermo Fisher公司；旋渦混合器 海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司；PCR儀美國(guó)伯樂(lè)公司；DYY-8C型電泳儀 北京六一儀器廠；JS-680C凝膠成像儀 上海培清科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母菌株分離鑒定

分別稱取各區(qū)域最后的綜合樣品25 g于裝有225 mL無(wú)菌生理鹽水的三角瓶中，200 r/min振蕩浸提30 min。吸取上清液，稀釋到合適濃度，取100 μL涂布，3 個(gè)平行；30 ℃倒置培養(yǎng)1～2 d。挑取不同形態(tài)的菌落至已滅菌的WL培養(yǎng)基，純化培養(yǎng)直至得到單菌落，酵母菌的鑒定根據(jù)形態(tài)持征，可參照《常見(jiàn)與常用真菌》[15]中的方法鑒定。

1.3.2 酵母菌基因組DNA提取

根據(jù)北京索萊寶科技有限公司的柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)，對(duì)酵母菌株進(jìn)行基因組DNA提取，將提取的菌株基因組DNA置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 26S rDNA的PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測(cè)

引物為NL1（5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAA AG-3’）、NL4（5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’）。PCR體系（25 μL）：primer 1和primer 2各1 μL，DNA模板2 μL，dd H2O 8.5 μL，Mix 12.5 μL。PCR程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)反應(yīng)，最后72 ℃繼續(xù)延伸10 min[16]。

1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)擴(kuò)增目標(biāo)產(chǎn)物后，送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。在NCBI的BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行DNA序列比對(duì)分析，選取同源性較高的相關(guān)菌株的26Sr DNA D1/D2區(qū)域序列作為參比分析對(duì)象[17]。

1.3.4 菌種保藏

甘油保藏：用接種環(huán)挑取純化的菌株于5 mL于己滅菌麥芽汁液體培養(yǎng)基中，30 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，取0.5 mL培養(yǎng)的渾濁菌液和0.5 mL已滅菌的30%甘油于1.5 mL EP管中混合均勻，每個(gè)菌株做3個(gè)甘油保藏，標(biāo)記并放置于-80 ℃冰箱長(zhǎng)期保藏。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用WPS進(jìn)行數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析，Origin 8.6對(duì)各區(qū)域環(huán)境的酵母種類、數(shù)量變化進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用在線軟件繪制韋恩圖（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同區(qū)域釀造環(huán)境及大曲中可培養(yǎng)酵母菌種分析

從樣品中共分離獲得568 株酵母，其中環(huán)境334 株，大曲234 株。環(huán)境與大曲酵母根據(jù)菌落形態(tài)及其顏色特征排重，共送檢202 株。通過(guò)酵母26S rDNA D1/D2區(qū)域序列比對(duì)分析，共鑒定得到15 個(gè)屬，36 個(gè)種。其中，從環(huán)境樣品中鑒定出26 種酵母菌，大曲中鑒定出21 種酵母菌。表1為本課題分離鑒定與其他研究報(bào)道酵母菌的比較分析結(jié)果。

表1 本課題分離鑒定結(jié)果與其他文獻(xiàn)報(bào)道酵母菌比較分析Table 1 Comparative analysis between the strains of yeast identified in this study and those reported in the literature

核苷酸序列比對(duì)結(jié)果（表1）表明，所分離獲得的酵母包括復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）、裂殖酵母屬（Schizosaccharomyces）、紅酵母屬（Rhodotorula）、有孢漢生酵母屬（Hanseniaspora）、柯達(dá)酵母屬（Kodamaea）、拜耳結(jié)合酵母屬（Zygosaccharomyces）、南極假絲酵母屬（P s e u d o z y m as p）各1 種，隱球菌屬（C r y p t o c o c c u s）、德巴利酵母屬（Torulaspora）、釀酒酵母屬（Saccharomyces）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）各2 種，絲孢酵母屬（Trichosporon）3 種，維克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）4 種，畢赤酵母屬（Pichia/Hyphopichia）6 種，假絲酵母屬（Candida）8種，4 株未知屬 N. rattus、H. oryzae、uncultured fungus、uncultured yeast。

Wu Qun等[17]從醬香型白酒釀造過(guò)程中鑒定出9 種酵母菌，并且結(jié)果表明S. cerevisiae、Z. bailii、P. membranifaciens和S. pombe為堆積過(guò)程的優(yōu)勢(shì)酵母。本次實(shí)驗(yàn)從環(huán)境和大曲中未分離出Z. bailii、P. membranifaciens，但本課題組其他人員從3、4、5輪次酒醅中分離出Z. bailii，未分離出P. membranifaciens，原因可能是Z. bailii、P. membranifaciens存在于不同輪次酒醅和環(huán)境中的差異，且P. membranifaciens是好氧菌，在酒醅中的數(shù)量一直很低。釀造環(huán)境和大曲中未發(fā)現(xiàn)Z. bailii、P. membranifaciens可能的原因是環(huán)境和大曲的條件不適合這兩種酵母生存。通過(guò)與其他相關(guān)研究結(jié)果比較，本課題檢出酵母在屬水平和種水平最為豐富，并且在醬香白酒釀造過(guò)程中首次檢出10 種酵母，分別為N. rattus、Wickerhamomyces sp. H1Y23、T. faecale、Issatchenkia sp. S612Y5、W. pijperi、Kazachstania sp.IMB190R、Pseudozyma sp.、K. solicola、Torulaspora sp.Z8Y10和H. oryzae；同時(shí)也較為系統(tǒng)的對(duì)醬香白酒釀造環(huán)境區(qū)域和大曲的酵母資源進(jìn)行深入解析，進(jìn)一步豐富了醬香型白酒釀造微生物資源信息庫(kù)。

2.2 不同區(qū)域釀造環(huán)境酵母種群多樣性結(jié)構(gòu)

圖1 各區(qū)域環(huán)境樣品酵母酵母種群結(jié)構(gòu)變化Fig. 1 Changes in yeast population structure in environmental samples from various brewing regions

從環(huán)境樣品中分離獲得334 株酵母，分屬于14 個(gè)屬、26 個(gè)種（包括1 株N. rattus和uncultured yeast）。環(huán)境樣品酵母多樣性結(jié)構(gòu)分布結(jié)果見(jiàn)圖1。由不同酵母菌的檢出頻率可知，W. anomalus、H. burtonii、S. cerevisiae和C. albidus檢出頻率為100%；其次為N. rattus、T. asahii、P. pastoris、T. delbrueckii、P. kudriavzevii和K. ohmeri，檢出頻率為85.71%，C. glabrata和R. mucilaginosa檢出頻率為71.43%，其余酵母菌檢出頻率都低于43%。其中，uncultured yeast、Wickerhamomyces sp. H1Y23、S. paradoxus、C. humilis、M. farinosa、P. galeiformis和T. faecale 7 個(gè)種的酵母菌只出現(xiàn)在1 個(gè)區(qū)域且僅分離出1 株，具有明顯的區(qū)域性微生態(tài)特征。26 種酵母菌中，相對(duì)豐度最大的為W. anomalus（30.24%），其次為S. cerevisiae（20.36%）和H. burtonii（7.78%），相對(duì)豐度都超過(guò)了7%，其余酵母菌株相對(duì)豐度小于4%。

黃永光等[34]對(duì)茅臺(tái)酒釀造發(fā)酵過(guò)程中的微生物釀造機(jī)理研究表明，其發(fā)酵環(huán)境為極端釀造環(huán)境，屬于高溫、高乙醇、高酸度的微生物生態(tài)環(huán)境。因此，發(fā)酵過(guò)程的酵母來(lái)源值得進(jìn)一步探索。大氣空氣環(huán)境中已知的細(xì)菌和放線菌有1 200 種，真菌有4 000 種，主要來(lái)自自然界的水、土壤、動(dòng)物等[35]。張文平[36]認(rèn)為醬香型白酒在釀造過(guò)程中很大一部分微生物來(lái)自空氣。研究顯示[37-38]，Cryptococcus、Hanseniaspora、Pichia、Candida、Debaryomyces、Issatchenki、Rhodotorula、Kodamaea和Wickerhamomyces等酵母屬大量存在于淡水、土壤及生物內(nèi)臟等，且大部分為土壤優(yōu)勢(shì)菌屬。本課題采集樣品為茅臺(tái)鎮(zhèn)釀造醬香白酒的不同釀造環(huán)境，主要包括釀造空氣沉降灰塵、釀造車(chē)間地面灰塵、釀造區(qū)域土壤等，所采集樣品具有充分的代表性，能體現(xiàn)環(huán)境樣品特征性。結(jié)合環(huán)境酵母的檢出頻率和相對(duì)豐度，結(jié)果表明茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香白酒釀造環(huán)境的酵母菌結(jié)構(gòu)的特征性優(yōu)勢(shì)種為W. anomalus、S. cerevisiae和H. burtonii。這些酵母在大曲和酒醅當(dāng)中也有適量的存在，由此可知，環(huán)境樣品中的酵母主要來(lái)自釀造環(huán)境的土壤、空氣、水和動(dòng)植物等，這充分說(shuō)明特殊釀造環(huán)境中的生物資源是白酒釀造過(guò)程中酵母菌的重要來(lái)源之一，同時(shí)也表明釀造環(huán)境生態(tài)中的本底微生物結(jié)構(gòu)對(duì)傳統(tǒng)白酒釀造的重要性，這就是國(guó)內(nèi)外不同酒類釀造產(chǎn)區(qū)形成的產(chǎn)業(yè)基礎(chǔ)和核心產(chǎn)區(qū)釀造微生物結(jié)構(gòu)差異特征，由此才有中國(guó)遵義（茅臺(tái)）醬香白酒產(chǎn)區(qū)、瀘州濃香產(chǎn)區(qū)、宜賓濃香產(chǎn)區(qū)的特色白酒產(chǎn)業(yè)分布結(jié)果等。

2.3 不同區(qū)域釀造企業(yè)生產(chǎn)用大曲酵母種群多樣性特征

從大曲中分離出 234 株酵母，經(jīng)形態(tài)與分子鑒定其分屬于12 個(gè)屬、21 個(gè)種（包括1 株H. oryzae和uncultured fungus），結(jié)果如圖2所示。W. anomalus、S. cerevisiae、H. burtonii和S. fibuligera檢出頻率為100%，其次C. allociferrii、I. orientalis和C. glabrata檢出頻率為85.71%，在6 個(gè)區(qū)域生產(chǎn)的大曲中均出現(xiàn)；P. kluyveri檢出頻率為71.43%，其余酵母出現(xiàn)區(qū)域少于4 個(gè)區(qū)域，且分離出的酵母數(shù)量較少。W. anomalus（95 株）的相對(duì)豐度在每個(gè)輪次中的比例都比較高，其次為S. fibuligera（23 株）、H. burtonii（15 株）、S. cerevisiae（14 株），其余酵母都低于14 株，其中Trichosporonoides sp. SZ8Y3、uncultured fungus、R. mucilaginosa、S. paradoxus和Pseudozyma sp.只出現(xiàn)在某一區(qū)域釀造生產(chǎn)的大曲中，且為1 株。結(jié)合酵母菌在大曲中檢出頻率及相對(duì)豐度可知，茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香白酒釀造區(qū)域生產(chǎn)大曲中特征性優(yōu)勢(shì)酵母為W. anomalus、S. fibuligera和H. burtonii。其次為S. cerevisiae、I. orientalis和C. glabrata。

圖2 各區(qū)域大曲樣品中的酵母種群結(jié)構(gòu)變化Fig. 2 Changes in yeast population structure in Daqu from various brewing regions

郭敏[39]通過(guò)高通量對(duì)傳統(tǒng)大曲和機(jī)械大曲中的真菌進(jìn)行分析比較，結(jié)果表明Wickerhamomyces（傳統(tǒng)制曲為37.32%，機(jī)械制曲為4.91%）是其主要真菌屬；Wang Haiyan等[40]對(duì)多種大曲DGGE研究結(jié)果表明高溫大曲中存在多種酵母，其中P. anomala和S. fibuligera在醬香大曲中處于優(yōu)勢(shì)地位；王曉丹等[25]分離篩選醬香高溫大曲中的酵母菌，在分離時(shí)出現(xiàn)大量S. fibuliqura形態(tài)的酵母，且S. fibuligera、I. orientalis和H. burtonii在醬香型白酒高溫大曲中均有報(bào)道；蔣思峽等[16]從傳統(tǒng)和機(jī)械大曲中都分離出S. fibuliqura和S. cerevisiae；朱婷婷[41]用傳統(tǒng)分離方法分析牛欄山大曲真菌的多樣性，得出S. fibuliqura為大曲的優(yōu)勢(shì)菌；高亦豹[10]對(duì)不同工藝生產(chǎn)大曲（如口子窖中溫曲、劍南春中偏高溫曲、郎酒高溫曲等）酵母26S rRNA區(qū)基因DGGE圖譜分析，發(fā)現(xiàn)S. fibuliqura和W. anomalus普遍存在于這些大曲中；王勇[27]運(yùn)用高通量測(cè)序?qū)ε谏酱笄奈⑸锞航Y(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，得出S. fibuligera是主體真核微生物；喬曉梅等[42]研究得出P. kudriavzevii和S. fibuligera是清香型大曲中的優(yōu)勢(shì)菌；胡佳音等[43]等對(duì)清、醬、濃3 種大曲真菌進(jìn)行多樣性分析，結(jié)果表明S. fibuliqura是清香大曲的主要真菌，P. kudriavzevii是濃香大曲主要真菌，Eurotium chevalieri和Thermomyces lanuginosus是醬香型大曲的主要真菌。結(jié)合其他研究者的研究結(jié)論以及本課題研究結(jié)果，說(shuō)明W. anomalus、S. fibuliqura、P. kudriavzevii、I. orientalis和H. burtonii為一般傳統(tǒng)大曲中的優(yōu)勢(shì)酵母；W. anomalus和S. fibuliqura為醬香大曲的特征性優(yōu)勢(shì)酵母，本研究明確了醬香大曲的優(yōu)勢(shì)酵母菌，為大曲微生物系統(tǒng)化研究提供理論支持。通過(guò)與環(huán)境檢出酵母相比較分析，大曲與環(huán)境中的特征優(yōu)勢(shì)酵母菌的檢出頻率及相對(duì)豐度具有一致性，進(jìn)一步說(shuō)明茅臺(tái)鎮(zhèn)釀造核心區(qū)域環(huán)境酵母種群結(jié)構(gòu)對(duì)醬香白酒釀造質(zhì)量調(diào)控的重要意義。

2.4 不同區(qū)域釀造環(huán)境與大曲酵母種群結(jié)構(gòu)多樣性差異

圖3 各釀造區(qū)域環(huán)境、大曲中酵母數(shù)量及種類變化Fig. 3 Changes in the number and type of yeast strains in environmental samples and Daqu from each brewing area

由圖3可知，環(huán)境和大曲中的可培養(yǎng)酵母數(shù)量和酵母種類在各區(qū)域的變化上具有基本一致性趨勢(shì)。在酵母數(shù)量上都呈現(xiàn)先急劇上升后急劇下降，最后趨于平緩的變化規(guī)律。其中，2區(qū)域酵母數(shù)量和種類最多，其原因可能是2區(qū)域的條件更適合大多數(shù)酵母的生存或該區(qū)域的釀酒微生物生態(tài)馴化程度很高，使得酵母數(shù)量和種類增加，這為醬香白酒企業(yè)的選址提供一定的基礎(chǔ)理論。這與吳徐建[12]的報(bào)道結(jié)論具有相似性，其認(rèn)為空氣中存在的酵母種屬與大曲中的酵母種屬基本一致。各釀造區(qū)域環(huán)境的酵母種群數(shù)量普遍高于大曲，其中2區(qū)域環(huán)境酵母數(shù)量幾乎是大曲中酵母數(shù)量的2 倍，其他各區(qū)域的數(shù)量變化也遵循此趨勢(shì)，其主要原因源于高溫制曲工藝對(duì)酵母的篩選和釀造區(qū)域生產(chǎn)環(huán)境對(duì)酵母的富集和馴化，其進(jìn)一步說(shuō)明環(huán)境微生物馴化及其資源的重要性。從酵母種類來(lái)看，環(huán)境中的酵母種類數(shù)高于大曲，但是差異相差不大。總體而言，環(huán)境中的酵母數(shù)量和種類都高于大曲，兩者在酵母數(shù)量上具有明顯差異，但酵母種類差異不大。結(jié)合張亞麗[14]、吳徐建[12]和范光先等[13]的研究結(jié)論以及本課題研究結(jié)論，說(shuō)明釀造環(huán)境對(duì)醬香白酒大曲中酵母的來(lái)源具有重要貢獻(xiàn)和調(diào)控功能。

圖4 大曲及環(huán)境中酵母種群的Venn 分析圖Fig. 4 Venn analysis of yeast populations in Daqu and environmental samples

利用Venn圖可直觀反映釀造環(huán)境與大曲在可培養(yǎng)酵母種群結(jié)構(gòu)多樣性方面的共有特征及特有種群的特征性。圖4結(jié)果表明，大曲在酵母種群上高達(dá)52.38%來(lái)自環(huán)境。環(huán)境與大曲相同的酵母菌為S. cerevisiae、W. anomalus、H. burtonii、C. glabrata、Trichosporonoides sp.SZ8Y3、S. paradoxus、R. mucilaginosa、S. fibuligera、T. delbrueckii、P. kudriavzevii和K. ohmer。醬香型白酒釀造生產(chǎn)應(yīng)用的高溫大曲需要存放一段時(shí)間才能使用，前期的高溫使酵母很少存活或處于休眠狀態(tài)，由于環(huán)境中的酵母種類多樣性高于大曲，而大曲在貯存過(guò)程可富集環(huán)境中的酵母，既實(shí)現(xiàn)環(huán)境中有益酵母向大曲的遷移，又實(shí)現(xiàn)了酵母種類數(shù)量的富集，使大曲中酵母的多樣性得到增加，為后續(xù)的發(fā)酵生產(chǎn)提供發(fā)酵動(dòng)力。

3 結(jié) 論

對(duì)茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香白酒釀造的7 個(gè)不同釀造區(qū)域環(huán)境及生產(chǎn)大曲的可培養(yǎng)酵母種群結(jié)構(gòu)多樣性進(jìn)行研究，獲得了568 株酵母菌，先后經(jīng)形態(tài)和26S rRNA D1/D2區(qū)序列鑒定，對(duì)202 株進(jìn)行鑒定，最后鑒定為36 種不同酵母。通過(guò)對(duì)釀造環(huán)境及大曲中酵母的多樣性進(jìn)行分析，得出釀造環(huán)境的特征性優(yōu)勢(shì)酵母為W. anomalus、S. cerevisiae和H. burtonii；醬香大曲的特征性優(yōu)勢(shì)酵母為W. anomalus和S. fibuliquras，明確了醬香大曲的優(yōu)勢(shì)酵母菌結(jié)構(gòu)。且環(huán)境中的酵母和大曲中的酵母在檢出頻率及相對(duì)豐度上具有一致性，進(jìn)一步說(shuō)明環(huán)境是白酒釀造過(guò)程中重要的微生物來(lái)源。

環(huán)境中的酵母數(shù)量和酵母種類高于大曲，其中2區(qū)域環(huán)境和大曲的酵母數(shù)量和種類都高于其他區(qū)域，進(jìn)一步又證實(shí)了環(huán)境是醬香型白酒釀造微生物的主要來(lái)源，為茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香白酒生產(chǎn)廠地選址奠定了理論基礎(chǔ)，同時(shí)也說(shuō)明了同一釀造大區(qū)域內(nèi)部不同的微生物生態(tài)結(jié)構(gòu)差異性特征。與現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道比較，本課題研究所獲得的N. rattus、Wickerhamomyces sp. H1Y23、Issatchenkia sp. S612Y5、W. pijperi、T. faecale、Kazachstania sp.IMB190R、Pseudozyma sp.、K. solicola、Torulaspora sp.Z8Y10和H. oryzae為首次在醬香型白酒釀造過(guò)程檢出的酵母，其在醬香型白酒釀造過(guò)程的功能正在開(kāi)展進(jìn)一步的詳細(xì)研究和功能證實(shí)。