芋艿采后主要病原菌分離鑒定及檜木醇抑菌效果

趙璐藐，郜海燕，劉瑞玲，丁玉庭，韓延超，陳杭君,*

（1.浙江工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，浙江 杭州 310014；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品科學(xué)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部果品產(chǎn)后處理重點實驗室，中國輕工業(yè)果蔬保鮮與加工重點實驗室，浙江省果蔬保鮮與加工技術(shù)研究重點實驗室，浙江 杭州 310021）

芋艿（Colocasia esculenta L. Schott）屬天南星科，是多年生單子葉草本植物，其肉質(zhì)球莖，富含淀粉，食用價值高，原產(chǎn)于中國、印度等熱帶沼澤地區(qū)[1-3]。浙江奉化是我國最早栽培芋艿的地區(qū)之一，奉化芋艿肉質(zhì)細膩，個大皮薄，品質(zhì)極佳，深受大眾喜愛[4-5]。但新鮮芋艿水分高，采后易發(fā)生腐爛褐變[6]而失去商品價值，其采后病害問題已成為浙江芋艿產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要問題。

近年來，對芋艿的研究主要集中于田間病蟲害及采后褐變。據(jù)文獻報道，芋艿田間病害主要有芋疫病、炭疽病等[7-8]，均由真菌引起，病原真菌侵染是引起果蔬采后病腐的主要原因[9]，而目前關(guān)于芋艿采后病害問題鮮見報道。因此，分離鑒定芋艿采后主要病原菌，并針對性采取有效措施對減少芋艿采后貯藏損失及延長貯藏期具有重大意義。為了延長芋艿的保鮮期，前人研究以低溫保鮮[10]為主，但低溫不能有效阻止病原菌侵染，而植物提取物是存在于植物體內(nèi)通過化學(xué)或物理方法提取出的具有有效抑菌作用的物質(zhì)[11]。檜木醇是從扁柏樹中提取的一種單萜類天然化合物[12]，具有抗菌、抗氧化以及抗腫瘤功效，是高安全性的植物提取成分[13-14]。有研究表明，檜木醇可控制桃子和茄子等采后病害[15]，且能維持采后龍眼品質(zhì)[14]，而其在芋艿采后病原菌控制方面還鮮見研究。

本研究采用傳統(tǒng)菌種分離法對浙江奉化芋艿采后常溫貯藏過程中的病原菌進行分離純化，并對其進行形態(tài)學(xué)及rDNA-ITS序列分子學(xué)鑒定，旨在明確主要病原菌的種類；同時研究檜木醇溶液處理對芋艿采后主要病原菌的抑菌效果，以期為后續(xù)采取針對性的研發(fā)綠色防腐保鮮技術(shù)提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

芋艿采自浙江寧波奉化芋艿基地，選擇大小均一、無明顯病蟲害的健康芋艿，于室溫下貯藏。貯藏期間，定期觀察發(fā)病情況并將其病原菌分離進行后續(xù)實驗。

檜木醇（純度＞99%） 梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）、馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基（potato dextrose broth，PDB） 上海盛思生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MLS-3781L-PC高壓蒸汽滅菌器 松下健康醫(yī)療器械株式會社；MJX-160B-Z霉菌培養(yǎng)箱 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；超凈工作臺 江蘇蘇凈集團有限公司；H7650透射電子顯微鏡 日本Hitachi公司；UV9000紫外-可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱 太倉市實驗設(shè)備廠；axio-vert倒置熒光顯微鏡 卡爾·蔡司股份公司。

1.3 方法

1.3.1 病原菌分離純化

參照文獻[16]，將貯藏過程中自然發(fā)病的芋艿按不同病癥分組，采用常規(guī)組織分離法對病原菌進行分離純化，反復(fù)純化出現(xiàn)單菌落后轉(zhuǎn)接斜面培養(yǎng)，菌種編號并低溫保存，用于菌落形態(tài)觀察及鑒定。

1.3.2 病原菌致病性檢測

選用健康無傷的芋艿，采用針刺法將純化后的絲狀真菌塊回接至芋艿刺傷部分，以不接真菌塊為對照，于室溫貯藏，定期觀察芋艿發(fā)病癥狀，顯出病癥后再次對其進行分離鑒定，觀察菌株是否與接種菌一致，以便判斷主要致病菌。每個病原菌處理3 個重復(fù)。

1.3.3 病原菌形態(tài)觀察

將保存的純病原菌活化，并接種于PDA培養(yǎng)基中，25 ℃恒溫箱培養(yǎng)至產(chǎn)孢，于熒光顯微鏡下觀察菌絲體及孢子形態(tài)并拍照。

1.3.4 病原菌rDNA-ITS序列與系統(tǒng)發(fā)育分析

采用CTAB法提取和純化基因組DNA[17]。利用真菌通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）對病原菌的基因組DNA進行PCR擴增，引物合成委托杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司完成。擴增程序：98 ℃預(yù)變性2 min，98 ℃變性10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，35 個循環(huán)，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

上述擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，切下目的片段進行回收，由杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進行測序。將測序結(jié)果提交到GenBank數(shù)據(jù)庫，并利用NCBI網(wǎng)站進行BLAST比對分析，尋找同源性較高的已知序列。利用Neighbor-Joining法[18]構(gòu)建菌株親緣關(guān)系較近的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)合菌株形態(tài)，確定菌株種屬。

1.3.5 體外抑菌

將一定量已配制好的檜木醇溶液加入已滅菌的PDA培養(yǎng)基中，制成檜木醇質(zhì)量濃度為0、10、20、30、40、50、60、80、100 mg/L的平板。用無菌打孔器在病原菌平板上取直徑6 mm的菌塊，放入PDA平板中央，在25 ℃條件下培養(yǎng)，定期觀察菌落，用游標卡尺測量菌落直徑并記錄，實驗重復(fù)3 次求平均值。

1.3.6 孢子萌發(fā)率測定

參考Li Jiangkuo[19]和周靈靈[20]等方法，稍作修改。在無菌條件下，將病原菌孢子懸浮液分別混合于不同質(zhì)量濃度檜木醇的葡萄糖溶液中，分別取不同質(zhì)量濃度的終液50 μL滴入雙凹載玻片，將載玻片放置在培養(yǎng)皿中（直徑200 mm），于25 ℃培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)，在第6、12、18小時于顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)情況，每處理鏡檢孢子數(shù)不少于100 個，以芽管長度超過孢子直徑一半計為孢子萌發(fā)。實驗重復(fù)3 次，孢子萌發(fā)率計算公式如下：

1.3.7 丙二醛濃度測定

病原菌細胞膜脂質(zhì)過氧化程度可用丙二醛（malondialdehyde，MDA）濃度作為指標進行測定。參考Li Jiangkuo等[19]的方法，稍作修改。稱取2.5 g（濕質(zhì)量）的菌絲體加入含有合適濃度的檜木醇溶液的PDB液體培養(yǎng)基中，搖床（25 ℃，140 r/min）培養(yǎng)0、3、6、9、12、24 h后，分別取2 mL上清液采用硫代巴比妥酸法測定吸光度，實驗重復(fù)3 次。

1.3.8 透射電鏡觀察

菌絲固定采用戊二醛、鋨酸雙重固定法。稱1 g菌絲（濕質(zhì)量）浸泡于3%戊二醛室溫下固定過夜，用pH 6.8的磷酸鹽緩沖液反復(fù)沖洗15 min后用1%的鋨酸固定2 h（4 ℃），再經(jīng)乙醇梯度脫水、包埋、聚合。聚合后進行切片處理，超薄切片經(jīng)醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色后，于透射電鏡下觀察菌絲體并拍照。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實驗數(shù)據(jù)用Microsoft Office Excel 2010軟件整理，采用SPSS Statistics 23軟件進行差異顯著性分析（P＜0.05，差異顯著），圖片繪制采用Origin 2017以及Photoshop CS4。

2 結(jié)果與分析

2.1 芋艿采后病原菌的分離鑒定

2.1.1 病原菌分離純化及致病性檢測結(jié)果

根據(jù)科赫法則，從芋艿的自然發(fā)病部位分離出3 株真菌，編號為CE-1、CE-2、CE-3，回接致病（圖1d、h）和再分離純化后確定芋艿采后致病菌為CE-1和CE-2，此2 種菌株能不同程度地導(dǎo)致芋艿發(fā)病腐爛，初期均從采摘受損處發(fā)病。CE-1菌使芋艿表皮出現(xiàn)白色絨狀物病斑，而后長出白色菌絲使其腐爛，CE-2菌使表皮出現(xiàn)褐變進而軟化，直至長出灰黑色疏松菌絲。

CE-1菌在PDA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)5 d后菌落形態(tài)如圖1b所示，CE-1菌落圓形，菌絲為白色或淺灰色，形如羊絨，菌落背面略帶黃色。菌絲有隔，分生孢子兩端較尖，呈鐮刀型或紡錘形，孢體稍彎曲（圖1c）。CE-2菌在PDA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)3 d后菌落形態(tài)如圖1f所示，CE-2菌落圓形，絨狀菌絲叢，初期白色，后期轉(zhuǎn)為炭黑色，且隨培養(yǎng)時間的延長，產(chǎn)生少許菌核。菌絲有隔，分枝，分生孢子黑褐色，卵圓形，基部平截，端部鈍圓，壁厚（圖1g）。

圖1 芋艿貯藏期發(fā)病果實病害癥狀、分離菌株菌落形態(tài)特征及其回接癥狀Fig. 1 Symptoms of postharvest diseases on taro, and morphology and pathogenicity of pathogens

2.1.2 病原菌rDNA-ITS序列和系統(tǒng)發(fā)育樹分析

以病原菌基因組DNA為模板，采用引物ITS1和ITS4進行PCR擴增，2 個病原菌菌株均獲得1 條500 bp左右的擴增條帶。將其序列在NCBI中進行BLAST比對發(fā)現(xiàn)，菌株CE-1與鐮刀菌屬序列相似度達99%以上，菌株CE-2與可可毛色二孢菌序列相似度達99%以上，可信度較高。選取同源性高低不同的菌株進行多重序列比較和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建（圖2），結(jié)果表明：菌株CE-1與茄病鐮刀菌（Fusarium solani，登錄號：KF938479.1）親緣關(guān)系較近，與禾谷鐮刀菌（F. graminearum，登錄號：KT318586.1）及層生鐮刀菌（F. proliferatum，登錄號：KU984710）等鐮刀菌親緣關(guān)系較遠。菌株CE-2與可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia theobromae，登錄號：MH454030.1）聚為一類。因此，結(jié)合2 種病原菌的形態(tài)特征鑒定，rDNA-ITS序列分析以及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，確定引起芋艿采后病害的主要病原菌為Fusarium sp.和L. theobromae。

圖2 基于ITS基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree based on ITS sequences

2.2 檜木醇對芋艿采后病原菌的抑菌活性

2.2.1 檜木醇體外抑菌效果

2 種病原菌菌落生長速度不同，CE-1長滿培養(yǎng)皿需5 d時間，而CE-2則在2 d長滿。從圖3可以看出，檜木醇溶液對芋艿采后2 種病原菌均有一定的抑菌效果，且隨質(zhì)量濃度的升高抑制能力增強，相對來說，檜木醇對CE-2的抑制能力要弱于CE-1。質(zhì)量濃度為10 mg/L的檜木醇溶液對CE-1菌絲生長有明顯的抑菌效果，在培養(yǎng)3 d后不同質(zhì)量濃度處理間菌絲生長有顯著差異（P＜0.05），且質(zhì)量濃度為50 mg/L的檜木醇溶液完全抑制了CE-1的生長。對于CE-2，檜木醇質(zhì)量濃度為40 mg/L時對菌絲生長有明顯抑制作用，在培養(yǎng)2 d后不同質(zhì)量濃度處理間菌絲生長有顯著差異（P＜0.05），且質(zhì)量濃度為100 mg/L時完全抑制CE-2的生長。

圖3 檜木醇處理對CE-1和CE-2菌絲生長的影響Fig. 3 Inhibitory effects of hinokitiol at different concentrations against mycellial growth of the two pathogens

2.2.2 檜木醇對病原菌孢子萌發(fā)率的影響

圖4 檜木醇處理對CE-1病原菌孢子萌發(fā)的抑制效果Fig. 4 Inhibitory effects of hinokitiol at different concentrations on spore germination of the pathogens

為研究檜木醇對病原菌孢子萌發(fā)的抑制效果，進一步分析了檜木醇溶液對CE-1在培養(yǎng)第6、12、18小時的孢子萌發(fā)率。由圖4可以看出，隨著檜木醇質(zhì)量濃度的增加，CE-1孢子萌發(fā)率顯著降低（P＜0.05），18 h對照組孢子萌發(fā)率達到91.33%，而40 mg/L和80 mg/L檜木醇處理組孢子萌發(fā)率僅分別為32%和9.67%，其中孢子萌發(fā)抑制率分別約為66%和90%。在進行CE-2孢子萌發(fā)實驗時，采用普通培養(yǎng)基培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)孢子困難，這與Saha等[21]研究結(jié)果一致。進一步采用燕麥培養(yǎng)基及連續(xù)光照等方法進行優(yōu)化培養(yǎng)，培養(yǎng)26 d后產(chǎn)孢量依然很少，不具備統(tǒng)計學(xué)意義。因此，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，檜木醇能顯著抑制CE-1病原菌孢子的萌發(fā)，也由此抑制其菌絲生長。

2.2.3 檜木醇對菌絲膜脂過氧化的影響

MDA是膜脂過氧化的主要產(chǎn)物，是衡量膜系統(tǒng)氧化損傷的重要指標之一[22]。為能明顯看出抑菌效果，選取抑菌率為60%以上的檜木醇處理菌種，即以40 mg/L質(zhì)量濃度處理CE-1和80 mg/L質(zhì)量濃度處理CE-2。從圖5a可以看出，質(zhì)量濃度為40 mg/L檜木醇溶液處理CE-1，在處理6 h后MDA濃度開始超過對照組并始終保持上升，于第24小時達到最高水平。從圖5b可以看出，質(zhì)量濃度為80 mg/L檜木醇溶液處理CE-2，其MDA濃度始終高于對照組。由此可見，檜木醇能夠誘導(dǎo)芋艿采后兩種病原菌菌絲膜脂質(zhì)過氧化，加劇膜的損傷，促進MDA的大量積累。MDA可與真菌的蛋白質(zhì)及核酸發(fā)生相應(yīng)反應(yīng)，從而改變其結(jié)構(gòu)，破壞其生物學(xué)功能，致使真菌死亡。

圖5 檜木醇處理對2 種病原菌菌絲脂質(zhì)過氧化影響Fig. 5 Effects of hinokitiol on membrane lipid peroxidation of the two pathogens

2.2.4 檜木醇對菌絲體亞細胞結(jié)構(gòu)的影響

由圖6可知，檜木醇處理對CE-1和CE-2的亞細胞結(jié)構(gòu)有明顯破壞的影響，對照組的2 種菌菌絲體細胞壁層次清楚，有明確界限的質(zhì)膜，厚度均勻且細胞器完整未受損傷。而經(jīng)檜木醇處理后的CE-1細胞膜部分模糊，厚度不均勻，菌絲體內(nèi)部分細胞質(zhì)解體出現(xiàn)空腔（圖6A、B）。CE-2菌絲體膜有溶解跡象，且菌絲體內(nèi)細胞器液泡化（圖6C、D）。2 種病原菌細胞完整性均遭到破壞，表明檜木醇對鐮刀菌屬和可可毛色二孢菌菌絲體有一定的破壞作用，促使膜脂質(zhì)過氧化而造成膜損傷，改變膜通透性，從而達到抑菌效果。

圖6 檜木醇處理對2 種病原菌菌絲體亞細胞結(jié)構(gòu)的影響Fig. 6 Transmission electron micrographs of the two pathogens treated and not treated with hinokitiol

3 討論與結(jié)論

本研究通過形態(tài)學(xué)觀察、分子生物學(xué)鑒定以及致病性檢測方法，初步確定引起芋艿采后腐爛變質(zhì)的主要病原菌為鐮刀菌屬（Fusarium sp.）和可可毛色二孢菌（L. theobromae）。此2 種菌均能對芋艿采后造成不同程度的病變，其中可可毛色二孢菌引起的芋艿果實采后病害為國內(nèi)首次報道?？煽擅呔梢瘕堁劢垢23]、橡膠樹葉斑病[24]、桑樹根腐病[25]以及枇杷采后病害[26]，具有一定的致病力。守川俊幸等[27]研究發(fā)現(xiàn)茄病鐮刀菌可引起低溫貯藏的富山縣芋頭發(fā)病，這與本研究分離出鐮刀菌屬菌株有相同之處?？赡芨鞯貐^(qū)不同品種芋艿采后病害不盡相同，而是否均能致病且有無存在復(fù)合侵染還有待進一步研究。

我國植物資源豐富，其產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物有40多萬 種，不同植物有不同的抑菌活性成分，其結(jié)構(gòu)類型涉及醇類、萜類、生物堿類、精油類等化合物均有抑菌、殺菌或抗菌的功效[28]。研究表明，芳樟醇和檸檬醛[29]、香茅醇[30]、肉桂精油[31]、黃帚橐吾[32]等植物提取物分別對柑橘褐色蒂腐病菌、鐮刀菌屬、藍莓采后致病菌以及辣椒疫霉菌有較好的抑菌作用。Zhou Ting等[33]研究發(fā)現(xiàn)癸烷精油能夠顯著抑制青霉菌（Penicillium expansum）的菌絲生長和孢子萌發(fā)，從而發(fā)揮抑制青霉病的作用。劉瑞玲等[34]采用體外直接接觸法和體外熏蒸法，研究了香芹酚精油、肉桂精油和百里香精油對火龍果采后主要病原菌層生鐮刀菌（F. proliferatum）和平頭炭疽菌（Colletotrichum fructicola）的抑制效果，發(fā)現(xiàn)香芹酚精油表現(xiàn)出較強的抑菌性，可作為火龍果貯藏前的熏蒸劑。檜木醇從柏科樹木中提取，天然安全，具有良好的抗真菌活性，研究發(fā)現(xiàn)其能抑制灰霉病菌，是良好的食品防腐劑和發(fā)芽抑制劑[35]，有持久的抗菌效果，然而，目前關(guān)于檜木醇對果蔬采后病原菌的抑制作用及可能的作用機理鮮有報道。

本研究通過體外平板抑菌實驗，明確了檜木醇溶液對芋艿采后兩種主要病原菌的抑制作用，50 mg/L的檜木醇溶液能完全抑制鐮刀菌屬真菌的生長，這與Morita等[36]研究結(jié)果一致。同時，100 mg/L檜木醇溶液可完全抑制可可毛色二孢菌的生長。有文獻報道，檜木醇可抑制各類腐霉菌的體外菌絲生長[15]，這給本研究結(jié)果提供了理論依據(jù)，且研究發(fā)現(xiàn)檜木醇溶液濃度越大對病原菌的抑制率越大。進一步通過其對病原菌孢子萌發(fā)、菌絲體脂質(zhì)過氧化以及亞細胞結(jié)構(gòu)的影響判斷對病原菌的破壞程度，初探其作用機理。鐮刀菌屬孢子萌發(fā)受檜木醇在一定程度上的抑制，采用40 mg/L和80 mg/L檜木醇溶液分別處理鐮刀菌屬和可可毛色二孢2 種病原菌，發(fā)現(xiàn)均能使菌的MDA濃度比對照組的高，表明膜脂過氧化嚴重，可能膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)遭到破壞，從而促使細胞死亡，抑制菌絲的生長。透射電鏡的觀察發(fā)現(xiàn)檜木醇破壞菌絲的亞細胞結(jié)構(gòu)，推測其作用于真菌細胞膜導(dǎo)致通透性增加，直接接觸線粒體等亞細胞器，造成其損傷，引起細胞能量代謝障礙，最終導(dǎo)致真菌細胞死亡，也進一步證實以上結(jié)論。

近幾年對檜木醇的研究主要集中于人體醫(yī)學(xué)和營養(yǎng)學(xué)方面的應(yīng)用，而在食品保鮮領(lǐng)域較少報道。本實驗分離鑒定出芋艿采后主要病原菌，并對檜木醇處理此兩種病原菌的抑制效果進行了初步研究，對進一步開發(fā)綠色、安全、高效的芋艿防腐保鮮技術(shù)提供了理論參考價值，而至于檜木醇的抑菌機理尚未清晰，還需后續(xù)實驗更進一步闡明。