大豆分離蛋白與單糖、雙糖、多糖共價(jià)復(fù)合物的凍融特性及結(jié)構(gòu)表征

王玉瑩，張安琪，周國衛(wèi)，王 琳，王喜波*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）為蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)在90%以上[1]，富含有多種必需氨基酸和不飽和脂肪酸的優(yōu)質(zhì)蛋白[2]，是少數(shù)可與動(dòng)物蛋白比擬的植物蛋白，由于其具有表面活性而常被用作乳化劑，但是蛋白質(zhì)的乳化特性會受到外界因素的影響，當(dāng)溫度降低時(shí)，水相會形成尖銳冰晶會刺破油水界面膜，使乳液呈現(xiàn)失穩(wěn)狀態(tài)。

蛋白質(zhì)改性是改善蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)的有效方法[3]，化學(xué)改性由于顯著效果常用作蛋白質(zhì)改性，如糖基化、脫酸胺化、磷酸化、羧甲基化、共價(jià)交聯(lián)等[4]。其中，糖基化改性僅通過加熱不需要催化劑就能提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，是一種理想的改性蛋白質(zhì)的方法[5]。竇超然等[6]制備的凍融穩(wěn)定型糖基化SPI乳液的分層系數(shù)和出油率顯著降低。孫洪蕊等[7]發(fā)現(xiàn)濕法糖基化能夠制備抗凍融SPI復(fù)合物。Zhang Zeyu等[8]利用超聲輔助提高了大豆蛋白凍融性質(zhì)，明顯降低了凍融循環(huán)后乳析指數(shù)（creaming index，CI）和粒徑。Yu Jie等[9]利用酶改性獲得不同水解度的SPI水解物，觀察發(fā)現(xiàn)酶改性后的乳液在3 次凍融循環(huán)后蛋白沒有明顯的沉淀絮凝現(xiàn)象。Zang Xiaodan等[10]通過木瓜蛋白酶和植酸酶處理修飾的SPI可以顯著提高冷凍的穩(wěn)定性，并能承受多種環(huán)境因素。Chen Yebao等[11]揭示了經(jīng)熱誘導(dǎo)后，SPI納米顆粒形成穩(wěn)定Pickering乳液的凍融穩(wěn)定性的重要性。

綜上，目前關(guān)于SPI與多糖共價(jià)復(fù)合物凍融性質(zhì)的研究較多，但對SPI與單糖和雙糖共價(jià)復(fù)合物凍融性質(zhì)研究鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上，比較分析SPI與單糖、雙糖、多糖共價(jià)復(fù)合物在凍融循環(huán)后的功能穩(wěn)定性并優(yōu)化出最佳反應(yīng)條件，以期尋求制備凍融穩(wěn)定型糖基化SPI的最佳工藝為冷凍產(chǎn)品提供新的技術(shù)思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄糖（glucose，G） 上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；麥芽糖（maltose，M） 北京化學(xué)試劑廠；葡聚糖（dextran，D） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；九三大豆油 市售；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FJ200高速分散均質(zhì)機(jī) 上海滬析實(shí)業(yè)有限公司；AVP-1000型高壓均質(zhì)機(jī) 德國APV公司；F-2700熒光分光光度計(jì) 上海棱光技術(shù)有限公司；TU-1800型紫外-可見分光光度計(jì) 上海菁華分析儀器公司；Nicolet is5傅里葉變換紅外光譜儀 上海力晶科學(xué)儀器有限公司；Mr-90恒溫磁力攪拌器 華北試驗(yàn)儀器廠；MS104TS分析天平上海右一儀器有限公司；FDU-1200冷凍干燥機(jī) 深圳市科力易翔儀器設(shè)備有限公司；數(shù)顯型恒溫水浴鍋上海碩光電子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SPI提取

參考Sorgentini等[12]采用堿溶酸沉法提取，凱氏定氮法測定SPI蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90.23%。

1.3.2 糖基化SPI的制備

將SPI分別與G、M、D按一定質(zhì)量比（1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1）溶解于0.01 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液，配成一定蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)（2%、3%、4%、5%、6%）的溶液，室溫?cái)嚢? h后，加入微量疊氮化鈉防止滋生微生物并于4 ℃冰箱中過夜。取不同樣品溶液于水浴鍋（60、70、80、90、100 ℃）反應(yīng)（1、2、3、4、5 h），反應(yīng)結(jié)束后，樣品置于冰水浴冷卻10 min使反應(yīng)停止，然后樣品在2 000 r/min離心20 min，取上清液于蒸餾水中透析24 h，冷凍干燥備用。共價(jià)復(fù)合物分別為SPI-G、SPI-M、SPI-D。

1.3.3 乳化性測定

參考Perace等[13]方法，略有改進(jìn)。用0.1 mol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液溶解樣品，取30 mL樣品和10 mL大豆油混合，置于高速乳化機(jī)，在11 000 r/min均質(zhì)1 min以形成乳濁液，分別在0 min與10 min從底部吸取100 μL加入10 mL（0.1%）SDS中，于500 nm波長處測定吸光度，以0.1% SDS溶液為空白。乳化活性指數(shù)（emulsifying activity index，EAI）和乳化穩(wěn)定性指數(shù)（emulsifying stability index，ESI）計(jì)算公式如下：

式中：T為2.303；A0為第0分鐘時(shí)的吸光度；N為稀釋倍數(shù)（100）；φ為體系中油相所占的體積分?jǐn)?shù)（0.25）；C為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/（g/mL）；L為比色池光徑（1 cm）。

式中：A0為第0分鐘時(shí)的吸光度；A10為第10分鐘時(shí)的吸光度；?T為時(shí)間差10 min。

1.3.4 高壓均質(zhì)制備乳液工藝

用磷酸鹽緩沖溶液（10 mmol/L，pH 7.0）溶解樣品SPI-G、SPI-M、SPI-D，并加入體積分?jǐn)?shù)10%～30%的大豆油，置于高速乳化機(jī)，在11 000 r/min處理3 min形成粗乳液，然后高壓均質(zhì)（60 MPa）處理得微乳液。加入0.02%的疊氮化鈉，防止微生物污染。

1.3.5 凍融處理

將新制備的樣品乳液20 mL轉(zhuǎn)移到具塞試管內(nèi)，-20 ℃冰箱中冷凍儲存22 h，取出后于20 ℃水浴解凍2 h[14]，取部分樣品進(jìn)行凍融穩(wěn)定性分析，如此循環(huán)3 次凍融。

1.3.6 CI測定

經(jīng)凍融處理后乳液分層。用刻度尺量取底部透明或渾濁的乳清層高度與乳液總高度，乳液的凍融性質(zhì)CI表示[15]。CI計(jì)算如式（3）所示：

式中：HS為乳清層高度/cm；HT為乳液總高度/cm。

1.3.7 出油率測定

參考Palanuwech等[16]方法，略有改進(jìn)。將1 000 g大豆油與0.015 g蘇丹III充分混合，蘇丹III油溶液與乳液按質(zhì)量比4∶1精確放入離心管內(nèi)混勻，10 000 r/min離心20 min后于508 nm波長處測吸光度，以大豆油為空白。出油率計(jì)算如式（4）所示：

式中：φ為出油率/%；m0為蘇丹III油溶液質(zhì)量；me為乳液質(zhì)量；a為蘇丹III油溶液吸光度與離心后蘇丹III油溶液吸光度的比值；φd為乳液中油相的質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%。

1.3.8 接枝度測定

將樣品SPI-G、SPI-M、SPI-D配制成4 mg/mL的樣品溶液，取200 μL樣品溶液加入到4 mL鄰苯二甲醛溶劑[17]，混勻后于35 ℃水浴中保溫反應(yīng)2 min，以鄰苯二甲醛溶劑試劑作空白，在340 nm紫外波長處測定吸光度，接枝度計(jì)算如式（5）所示：

式中：DG為接枝度/%；A0為接枝反應(yīng)前吸光度；A1為接枝反應(yīng)后吸光度。

1.3.9 傅里葉變換紅外光譜測定

取適量冷凍干燥后的樣品與一定量溴化鉀混合，研磨成粉末后壓成薄片，設(shè)置分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)32 次，隨后用傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行全波段（4 000～400 cm-1）掃描[18]。

1.3.10 熒光光譜測定

用磷酸鹽緩沖溶液（10 mmol/L，pH 7.0）將樣品SPI-G、SPI-M、SPI-D配制成蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的樣品溶液，設(shè)置激發(fā)波長347 nm，發(fā)射波長掃描范圍375～550 nm[19]。然后用0.01 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液稀釋20 倍使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.025%，設(shè)置激發(fā)波長290 nm，發(fā)射波長掃描范圍300～400 nm。激發(fā)和發(fā)射的狹縫均為5.0 nm，掃描速率240 nm/min[20]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 共價(jià)復(fù)合物制備工藝優(yōu)化

2.1.1 反應(yīng)溫度對反應(yīng)產(chǎn)物凍融穩(wěn)定性的影響

在SPI與糖的質(zhì)量比2∶1、反應(yīng)時(shí)間3 h、蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%條件下，研究反應(yīng)溫度對SPI-G、SPI-M、SPI-D乳化性和1、2、3 次凍融循環(huán)后CI的影響。

圖1 反應(yīng)溫度對SPI-G（a）、SPI-M（b）、SPI-D（c）乳化性和CI的影響Fig. 1 Effect of reaction temperature on the emulsifying activity and creaming index of SPI-G (a), SPI-M (b), and SPI-D (c)

研究表明，溫度能夠提高美拉德反應(yīng)速率，加快反應(yīng)進(jìn)程[21]。乳化性是蛋白質(zhì)作為功能性食品配料應(yīng)用于冷凍食品中的一項(xiàng)重要的功能性質(zhì)[22]，從圖1a、b可知，EAI和ESI都隨著溫度的升高而上升，并均在80 ℃達(dá)到最大。從圖1c可知，SPI-D的EAI和ESI也呈增大趨勢，并在90 ℃達(dá)到最大。這是因?yàn)樵谝欢ǚ秶鷥?nèi)增加溫度，蛋白質(zhì)的肽鏈展開，增加了游離氨基數(shù)量，進(jìn)而提高了與糖的結(jié)合幾率，增加反應(yīng)效率。但隨著溫度進(jìn)一步升高，乳化性顯著降低，可能是因?yàn)榧訜釡囟冗^高，蛋白質(zhì)嚴(yán)重變性[23]。CI是表明乳液凍融穩(wěn)定性的一個(gè)重要指標(biāo)，CI越低，乳液狀態(tài)越穩(wěn)定[24]。如圖1所示，溫度逐漸升高，CI先減小后增大。SPI-G和SPI-M在80 ℃顯示了最低的CI，SPI-D在90 ℃顯示了最低的CI，但與80 ℃時(shí)的CI相差不大。這是因?yàn)闇囟壬撸龠M(jìn)接枝反應(yīng)，糖包裹了蛋白形成立體網(wǎng)絡(luò)，提高了接枝物對外界環(huán)境的抵抗力[25]。綜合比較，SPI-M的乳化性升高幅度和CI降低程度，均高于SPI-G和SPI-D。這可能是由于糖的分子結(jié)構(gòu)有所不同，形成不同的空間位阻。考慮到反應(yīng)溫度過高時(shí)蛋白質(zhì)會變性，選擇80 ℃作為反應(yīng)溫度進(jìn)行后續(xù)研究。

2.1.2 反應(yīng)時(shí)間對反應(yīng)產(chǎn)物凍融穩(wěn)定性的影響

圖2 反應(yīng)時(shí)間對SPI-G（a）、SPI-M（b）、SPI-D（c）乳化性和CI的影響Fig. 2 Effect of reaction time on the emulsifying activity and creaming index of SPI-G (a), SPI-M (b), and SPI-D (c)

在SPI與糖的質(zhì)量比2∶1、反應(yīng)溫度80 ℃、蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%條件下研究反應(yīng)時(shí)間對SPI-G、SPI-M、SPI-D乳化性和1、2、3 次凍融循環(huán)后CI的影響。

由圖2可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長SPI-G、SPI-M、SPI-D的EAI和ESI均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，反應(yīng)時(shí)間為3 h時(shí)最大?？赡苁且?yàn)榉磻?yīng)時(shí)間延長，使得維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的次級鍵被破壞，肽鏈變得疏松，SPI的溶解度增加，促進(jìn)了接枝反應(yīng)，增加了SPI的表面活性[26]。而反應(yīng)時(shí)間過長，暴露更多疏水基團(tuán)，促使蛋白質(zhì)重新聚集，使接枝物的EAI和ESI降低。如圖2所示，CI隨加熱時(shí)間的延長，逐漸降低而又上升，同樣是在反應(yīng)3 h表現(xiàn)出最好的凍融性質(zhì)，可能是因?yàn)榧訜釙r(shí)間過長，糖過度引入，疏水基團(tuán)增多，蛋白質(zhì)聚集，失去親水親油平衡，破壞穩(wěn)定的界面膜，使接枝物的CI降低[27]。綜合來看，SPI-M的凍融性質(zhì)均好于SPI-G和SPI-D。結(jié)合考慮能源損耗，最終選擇反應(yīng)時(shí)間3 h進(jìn)行后續(xù)研究。

2.1.3 蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)對反應(yīng)產(chǎn)物凍融穩(wěn)定性的影響

圖3 蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)對SPI-G（a）、SPI-M（b）、SPI-D（c）乳化性和CI的影響Fig. 3 Effect of protein concentration on the emulsifying activity and creaming index of SPI-G (a), SPI-M (b), and SPI-D (c)

在SPI與糖的質(zhì)量比2∶1、反應(yīng)時(shí)間3 h、反應(yīng)溫度80 ℃條件下研究蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)對SPI-G、SPI-M、SPI-D乳化性和1、2、3 次凍融循環(huán)后CI的影響。

由圖3可知，隨著蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，接枝物的EAI和ESI同樣出現(xiàn)先升高又下降的趨勢，在蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)4%時(shí)，SPI-G、SPI-M、SPI-D的乳化性最優(yōu)，其中SPI-M乳化性最好?？赡苁且?yàn)镾PI濃度的上升提高了蛋白質(zhì)分子與糖分子的碰撞機(jī)會，促進(jìn)美拉德反應(yīng)的發(fā)生，提高了乳化性，但隨著蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的進(jìn)一步提高，導(dǎo)致溶液黏度增大、流動(dòng)緩慢，進(jìn)而阻礙了接枝反應(yīng)的發(fā)生[7]。SPI-G、SPI-M、SPI-D接枝物的CI均隨蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，并在4%時(shí)凍融性質(zhì)最佳，SPI-M的下降幅度最大?？赡苁且?yàn)榈鞍踪|(zhì)量分?jǐn)?shù)越大，反應(yīng)效率越高，但蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)過大，蛋白與糖的空間位阻變大，降低碰撞幾率，不利于接枝反應(yīng)的發(fā)生進(jìn)而使乳液的凍融穩(wěn)定性下降[28]?？紤]到反應(yīng)程度及經(jīng)濟(jì)問題，選擇蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%進(jìn)行后續(xù)研究。

2.1.4 SPI與糖質(zhì)量比對反應(yīng)產(chǎn)物凍融穩(wěn)定性的影響

在反應(yīng)溫度80 ℃、反應(yīng)時(shí)間3 h、蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%條件下研究SPI與糖質(zhì)量比對SPI-G、SPI-M、SPI-D乳化性和1、2、3 次凍融循環(huán)后CI的影響。

SPI和糖的美拉德反應(yīng)是基團(tuán)之間特定的交聯(lián)反應(yīng)，一定的比例不僅可以提高反應(yīng)的進(jìn)程，而且能降低副反應(yīng)的發(fā)生[7]。由圖4a、b可知，在蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)一定的情況下，隨著G、M比例的減少，接枝物的EAI呈明顯上升趨勢，ESI與EAI變化趨勢基本一致，這是因?yàn)橐脒m量的糖，親水基團(tuán)的增多使產(chǎn)物的極性增加，繼而提高溶解性，增加界面活性，所以提高了產(chǎn)物的乳化活性[29]。但隨著糖比例進(jìn)一步降低，蛋白質(zhì)與糖接枝物的乳化性逐步降低。由圖4c可知，D的添加會提高SPI-D的乳化性，僅質(zhì)量比1∶1時(shí)有明顯變化，隨糖的比例減少，下降趨勢明顯，這是因?yàn)镈分子質(zhì)量大，遷移速率緩慢，醛基濃度太低，較少的糖不足以與蛋白充分發(fā)生反應(yīng)。雖然接枝物的乳化性都有提高，但SPI-G、SPI-D的升高幅度遠(yuǎn)小于SPI-M，這可能是由于G、M、D內(nèi)部結(jié)構(gòu)不同，M更易于與SPI結(jié)合。圖4中接枝物的CI均隨著糖的引入而呈現(xiàn)降低的趨勢，這是因?yàn)樘怯性龀碜饔?，增加了乳液中未凍結(jié)水的含量，提高了水相的黏度，增強(qiáng)了膜的厚度，降低了對外界環(huán)境的敏感度進(jìn)而提高產(chǎn)物凍融穩(wěn)定性[22]，但仍是SPI-M在SPI與糖質(zhì)量比4∶1表現(xiàn)出最好的凍融性質(zhì)?？紤]到改性應(yīng)當(dāng)以SPI為主體并分析考慮了乳化性、CI及經(jīng)濟(jì)問題，選取SPI-G、SPI-M、SPI-D分別在SPI與糖質(zhì)量比3∶1、4∶1、1∶1為最佳反應(yīng)參數(shù)。

圖4 SPI與糖質(zhì)量比對SPI-G（a）、SPI-M（b）、SPI-D（c）乳化性和CI的影響Fig. 4 Effect of mass ratio between SPI and sugar on the emulsifying activity and creaming index of SPI-G (a), SPI-M (b), and SPI-D (c)

2.2 共價(jià)復(fù)合物的性質(zhì)分析

不同改性產(chǎn)物制備的最佳單因素組合條件：SPI-G的制備條件為反應(yīng)溫度80 ℃、反應(yīng)時(shí)間3 h、蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%、SPI與G質(zhì)量比3∶1；SPI-M的制備條件為反應(yīng)溫度80 ℃、反應(yīng)時(shí)間3 h、蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%、SPI與M質(zhì)量比4∶1；SPI-D的制備條件為反應(yīng)溫度90 ℃、反應(yīng)時(shí)間3 h、蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%、SPI與D質(zhì)量比1∶1。在此條件下平行實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)對照組。

2.2.1 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的出油率分析

乳液凍融后的不穩(wěn)定作用使部分脂肪游離，通過出油率可以測定乳液的穩(wěn)定性，出油率越低，乳液越穩(wěn)定[30]。由圖5可知，隨著凍融次數(shù)的增加，SPI的出油率急劇增加。接入糖之后出油率顯著下降，可能是因?yàn)樘堑募尤?，使溶液得極性增加，靜電斥力變大，減少了脂肪的聚集。經(jīng)過3 次凍融循環(huán)后，與SPI相比，SPI-G的出油率分別降低了4%、16%、22%；SPI-M的出油率分別降低了4.8%、16.8%、22.6%；SPI-D的出油率分別降低了2%、12%、17%。優(yōu)化后的產(chǎn)物乳化性能較好，但仍是SPI-M比SPI-G和SPI-D穩(wěn)定，說明優(yōu)化的反應(yīng)參數(shù)能夠提高改性產(chǎn)物的凍融穩(wěn)定性。

圖5 SPI及SPI-G、SPI-M、SPI-D凍融循環(huán)3 次的出油率Fig. 5 Oiling off of SPI, SPI-G, SPI-M, and SPI-D after one, two and three freeze-thaw cycles

2.2.2 共價(jià)復(fù)合物的接枝度分析

圖6 SPI-G、SPI-M、SPI-D的接枝度Fig. 6 Degrees of grafting of SPI-G, SPI-M, and SPI-D

對于蛋白，接枝表示在氨基側(cè)鏈的活性基團(tuán)引入糖分子的側(cè)鏈，使復(fù)合物表現(xiàn)出糖的親水特性，水溶性增加，一定程度上改善了蛋白質(zhì)的功能特性[31]。SPI與糖形成共價(jià)復(fù)合物的比率通過接枝度體現(xiàn)。由圖6可知，SPI-M的接枝度明顯高于SPI-G和SPI-D的接枝度，SPI-G和SPI-D的接枝度分別為24.23%和17.5%，而SPI-M的接枝度最高，達(dá)到27.2%?？赡苁且?yàn)椴煌N類的糖結(jié)構(gòu)不同，而M更易與SPI發(fā)生反應(yīng)。

2.2.3 共價(jià)復(fù)合物的傅里葉變換紅外光譜分析

圖7 SPI及SPI-G、SPI-M、SPI-D傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 7 Fourier transform infrared spectra of SPI and SPI-G,SPI-M, and SPI-D

大豆蛋白與糖的共價(jià)復(fù)合改性是將糖分子以共價(jià)鍵的形式接入到SPI分子中，其特征是羥基的引入[26]，在傅里葉變換紅外掃描特征吸收上體現(xiàn)為在波數(shù)為3 700～3 200 cm-1處有一個(gè)較寬的伸縮振動(dòng)峰，CO鍵在波數(shù)1 260～1 000 cm-1處也出現(xiàn)較強(qiáng)的振動(dòng)[32-33]。由圖7可知，復(fù)合物SPI-G、SPI-M、SPI-D均在3 700～3 200 cm-1處的吸收峰變寬，說明美拉德反應(yīng)發(fā)生后，羥基數(shù)量增加，引起了振動(dòng)吸收。同時(shí)反應(yīng)產(chǎn)物在1 260～1 000 cm-1處吸收峰明顯增強(qiáng)，表明C—N數(shù)量增加。并且SPI-G、SPI-M、SPI-D的吸收振動(dòng)均強(qiáng)于SPI，其中SPI-M相較于SPI-G和SPI-D復(fù)合物，具有更強(qiáng)的吸收振動(dòng)。蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)影響蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的穩(wěn)定性，由表1可知，反應(yīng)產(chǎn)物與SPI相比，α-螺旋含量減少，β-轉(zhuǎn)角含量增加，說明蛋白質(zhì)從有序向?yàn)闊o序狀態(tài)轉(zhuǎn)變，提高了分子的柔性，其中SPI-M的二級結(jié)構(gòu)改變最大，SPI-D的二級結(jié)構(gòu)改變最小。綜上，證明了SPI與糖是以共價(jià)鍵的方式結(jié)合發(fā)生美拉德反應(yīng)，改善了復(fù)合物的凍融穩(wěn)定性。

表1 SPI及SPI-G、SPI-M、SPI-D二級結(jié)構(gòu)含量Table 1Secondary structure contents of SPI and SPI-G, SPI-M, and SPI-D%

2.2.4 共價(jià)復(fù)合物的熒光強(qiáng)度分析

圖8 SPI及SPI-G、SPI-M、SPI-D在激發(fā)波長347 nm（a）和290 nm（b）的熒光光譜圖Fig. 8 Fluorescence spectra of SPI and SPI-G, SPI-M, and SPI-D at excitation wavelengths of 347 nm (a) and 290 nm (b)

美拉德反應(yīng)特征熒光物質(zhì)的典型熒光光譜為激發(fā)波長在320～370 nm處時(shí)，發(fā)射波長在420～440 nm范圍內(nèi)有最大的熒光強(qiáng)度[34]。如圖8a所示，激發(fā)波長為347 nm進(jìn)行掃描，SPI在451.6 nm波長處有最大熒光強(qiáng)度，而SPI-G、SPI-M、SPI-D復(fù)合物分別在431.6、429.6 nm和433.6 nm波長處有最大熒光強(qiáng)度，λmax向短波長方向移動(dòng)，發(fā)生了藍(lán)移，并且復(fù)合物的熒光強(qiáng)度均高于SPI，表明發(fā)生了美拉德反應(yīng)。色氨酸主要影響SPI的內(nèi)源熒光，對環(huán)境的變化非常敏感，因此較快反映蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化[35]。如圖8所示，激發(fā)波長為290 nm進(jìn)行掃描，復(fù)合物與SPI相比，λmax均向長波長方向移動(dòng)，發(fā)生了不同程度的紅移，并且可明顯看出SPI-M復(fù)合物的紅移程度比SPI-G和SPI-D更大，表明SPI與M發(fā)生更深程度的美拉德反應(yīng)，暴露了更多的色氨酸殘基，使其極性增加。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以乳化性和CI為指標(biāo)，分別對SPI與G、M、D的接枝反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，得出SPI-G、SPI-M、SPI-D復(fù)合物最佳反應(yīng)參數(shù)分別為：反應(yīng)溫度80 ℃、反應(yīng)時(shí)間3 h、蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%、SPI與G質(zhì)量比3∶1；反應(yīng)溫度80 ℃、反應(yīng)時(shí)間3 h、蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%、SPI與M質(zhì)量比4∶1；反應(yīng)溫度90 ℃、反應(yīng)時(shí)間3 h、蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%、SPI與D質(zhì)量比1∶1。優(yōu)化的SPI-G的EAI和ESI分別為對照品的1.22 倍和1.29 倍，經(jīng)過3 次凍融循環(huán)后，CI分別降低了28.03%、26.50%、22.84%；優(yōu)化的SPI-M的EAI和ESI分別是對照品的1.41 倍和1.29 倍，經(jīng)過3 次凍融循環(huán)后，CI分別降低了28.03%、28.30%、29.57%；優(yōu)化的SPI-D的EAI和ESI分別為對照品的1.26 倍和1.19 倍，經(jīng)過3 次凍融循環(huán)后，CI分別降低了20.9%、20.81%、24.55%，發(fā)現(xiàn)無論從凍融穩(wěn)定性還是經(jīng)濟(jì)能源方面，SPI-M的性質(zhì)均好于SPI-G和SPI-D。

出油率分析表明優(yōu)化后的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物凍融性質(zhì)顯著提高；接枝度分析表明SPI與M形成共價(jià)復(fù)合物的比率明顯高于SPI與G和D形成共價(jià)復(fù)合物的比率；傅里葉變換紅外光譜分析表明糖分子以共價(jià)鍵的形式接入到SPI分子中；熒光分析表明蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化出濕熱條件下SPI與單糖、雙糖、多糖共價(jià)復(fù)合物最佳反應(yīng)條件，提高了SPI的凍融穩(wěn)定性，并降低改性溫度、節(jié)約了能源，降低糖的添加，減少了成本，為冷凍食品提供新的技術(shù)依據(jù)。