UPLC/Q Exactive MS 快速測定食蟹猴體內(nèi)黃藤素的血藥濃度

張培培，崔佳麗，周藝佳，劉紅斌，柯 瑾

（1） 昆明衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院藥學(xué)院，云南昆明 650600；2） 云南白藥集團藥物安全性評價中心，云南昆明 650111；3） 云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，云南昆明 650500）

黃藤為防己科植物黃藤Fibraurea recisa Pierre.的干燥藤莖，又名天仙藤、土黃連、金鎖匙、藤黃連等，主要分布在我國的云南、廣西、廣東等地以及越南、柬埔寨、緬甸，是當?shù)厣贁?shù)民族常用的中藥和天然染料[1]?，F(xiàn)收載于2015年版《中國藥典》，其味苦，性寒，歸心、肝經(jīng)，具有清熱解毒、瀉火通便的功效[2]，而且能夠防治多種感染性疾病，如婦科炎癥、外科感染、菌痢、腸炎、呼吸道感染、眼結(jié)膜炎等[3]。黃藤中抗菌主要有效成分為黃藤素（C21H22ClNO4，387.86），又名鹽酸巴馬汀、鹽酸棕櫚堿、掌葉防已堿、非洲防已堿等，是中國首先自行研制的純天然植物藥，被當代醫(yī)學(xué)稱為“植物抗生素”。在一定程度上，彌補化學(xué)抗生素問題[4]。

隨著現(xiàn)代分析儀器的發(fā)展，黃藤素的體內(nèi)、外藥物分析方法不斷優(yōu)化，早期有學(xué)者[5-6]采用紫外分光光度法進行黃藤素測定，隨著高效液相色譜儀（HPLC） 的普及，逐漸采用HPLC 法[7-12]測定黃藤素片、注射液、粉針劑等制劑中黃藤素的含量。黃藤素體內(nèi)藥物分析方法很多，有高效液相色 譜-熒 光 檢 測（HPLC-FLU） 法[13]、（RP）-HPLC 法[14-15]等。由于黃藤素口服吸收較差[16-17]，體內(nèi)血藥濃度較低，因此需要建立靈敏度更高的分析測定方法。有學(xué)者[18-19]采用液質(zhì)聯(lián)用的技術(shù)進行黃藤素血藥濃度分析。為了進一步提高分析速度、簡化樣品處理過程，本研究建立一種特異性強、準確、快速、靈敏的UPLC-Q Exactive-MS 測定方法[20]，按照《中國藥典》 （2015年版） 四部“生物樣品定量分析方法驗證指導(dǎo)原則”項下進行方法學(xué)驗證，為黃藤素藥代及毒代研究提供方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試藥黃藤素對照品（鹽酸巴馬汀，PMH，C21H22ClNO4，相對分子量為387.86，含量為86.8%，批號110732-201611，中國食品藥品檢定研究院） ；內(nèi)標鹽酸小檗堿對照品（C20H18ClNO4，相對分子量為371.81，含量為86.7%，批號110713-201212，中國食品藥品檢定研究院）；食蟹猴空白血漿（廣東悅源動物養(yǎng)殖有限公司，合格證號：SCXK（粵） 2015-0038，15%EDTA-Na2 抗凝）。

1.1.2 試劑甲酸（批號10K11-F211，Admas）；乙腈為質(zhì)譜純（J.T.Baker），實驗用水為超純水。

1.1.3 儀器Thermo UltiMate 3000 液相色譜系統(tǒng)（美國賽默飛），Qexactive 四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀（美國賽默飛），MD200 氮氣吹掃儀（杭州奧盛儀器有限公司），DV215CD 分析天平（奧豪斯儀器（上海） 有限公司），XW-80A 渦旋混合儀（上海精科實來有限公司），Allegra64R 高速離心機（美國BECKMAN COULTER 公司），Research 移液器（美國Eppendorf 公司）。

1.2 方法

1.2.1 含量測定條件研究色譜柱Hypersil GOLD Dim C18（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；流動相為乙腈B-水A（含0.1%甲酸），流速為0.3 mL/min，柱溫30℃，進樣10 μL，分析時間為5 min。

質(zhì)譜條件研究：電噴霧離子源（ESI），正離子方式檢測；噴霧電壓3.50 kV；毛細管溫度350℃；離子源溫度350℃；鞘氣和輔助氣分別為35 arb 和12 arb；S-lens RF 電壓為50 V；掃描方式采用正離子t-SIM 模式，分辨率（R） 70000FWHM，自動增益控制（AGC） 和離子注入時間（IT） 分別設(shè)為5e4 和200 ms；isolation window 設(shè)為4.0 m/z，選擇離子通道：PMH，[M-Cl]+，m/z 352.154 33；鹽酸小檗堿（IS），[M-Cl]+，m/z 336.12303。噴霧氣為氮氣，碰撞氣為高純氮氣。

1.2.2 試劑配制（1） PMH 對照品溶液的配制：分別精密稱取黃藤素對照品5.91、5.87 mg，至已校驗25 mL 容量瓶中，加乙腈溶解后定容至刻度，搖勻，得濃度分別為0.205 和0.204 g/L（濃度計算時以含量86.8%進行折算） 的黃藤素標準儲備液，同法配制兩份，其中濃度高的作為校正曲線用儲備液，另一份作為質(zhì)控用儲備液，2 ℃～8℃冰箱保存?zhèn)溆?。并進行配制重現(xiàn)性考察和2℃～8℃冷藏70 d 穩(wěn)定性考察，結(jié)果顯示配制重現(xiàn)性符合要求，此條件下PMH 穩(wěn)定。臨用前，校正曲線儲備液用乙腈按比例稀釋制成濃度分別為0.525、1.05、2.62、6.56、16.4 和41.0 mg/L 系列PMH 標準工作液；質(zhì)控儲備液同法制成濃度分別為0.832、5.20和32.6 mg/L 系列質(zhì)控工作液；（2） 鹽酸小檗堿標準溶液配制：精密稱取內(nèi)標鹽酸小檗堿5.86 mg，轉(zhuǎn)至已校驗50 mL 容量瓶，加乙腈溶解后定容至刻度，搖勻，得濃度為0.102 g/L （濃度計算時以含量86.7%進行折算） 的內(nèi)標儲備液，取鹽酸小檗堿內(nèi)標儲備液10～1 000 mL 容量瓶中，加乙腈定容至刻度，混勻，得濃度為1.02 mg/L 的鹽酸小檗堿工作液，2℃～8℃冰箱保存?zhèn)溆茫唬?） 0.1%甲酸溶液配制：精確吸取甲酸1.0 mL，用超純水稀釋并且定容到1 L，0.22 μm 微孔濾膜抽濾后，超聲5 min 后再使用。

1.2.3 血漿樣品處理精密吸取食蟹猴血漿50 μL至對應(yīng)用記號筆標識的1.5 mL 離心管中，再精密加入400 μL 鹽酸小檗堿內(nèi)標工作液，渦旋2 min，于2～8 ℃，15 000 r/min 離心10 min，取上清液50 μL，加入乙腈950 μL 渦旋混勻，再從前述混勻液中取50 μL，加入乙腈950?L 渦旋混勻，于2～8℃，15 000 r/min 離心10 min，取出上清液適量至進樣瓶中，即得。

1.2.4 體內(nèi)藥物分析方法學(xué)驗證（1） 特異性 取食蟹猴空白血漿5 份、空白血漿+MPH+IS 1 份、預(yù)實驗中獲得的第1 批給藥后第1 個采血時間點任一樣品，按“1.2.3 血漿樣品處理”項下操作，比較各圖譜，考察方法特異性。（2） 殘留考察 按“1.2.3 血漿樣品處理”項下操作，制備5 份空白樣品、5 份標曲最低濃度點樣品及1 份標曲最高濃度點樣品，按照“高濃度-空白樣品”間隔進樣，計算每一空白血漿樣品中黃藤素峰面積與5 份標曲最低濃度點測定所得峰面積平均值的比值，應(yīng)小于20%；同時計算每一空白血漿樣品中IS 峰面積與5份標曲最低濃度點測定所得IS 峰面積平均值的比值，應(yīng)小于5%。（3） 基質(zhì)效應(yīng)考察 精密吸取5 μL 低、中、高濃度PMH（0.832、5.20 和32.6 mg/L） 質(zhì)控樣品溶液，再精密吸取“1.2.2（2） 鹽酸小檗堿標準溶液”項下1.02 mg/L 的鹽酸小檗堿工作液20 μL，常溫氮吹至干。取50 μL 空白食蟹猴血漿至另一1.5 mL 離心管中，精密加入400 μL乙腈，渦旋2 min，于2℃～8℃條件下15 000 r/min離心10 min，精密移取上清液225 μL 至前述1.5 mL 離心管中，后續(xù)按“1.2.3 血漿樣品處理”項下操作，各濃度平行5 份，分析測定得到的黃藤素峰面積（PS 有） 和鹽酸小檗堿峰面積（PIS 有）。以水代替空白食蟹猴血漿，精密吸取10 μL 低、中、高濃度PMH 質(zhì)控樣品溶液，按“1.2.3 血漿樣品處理”項下操作，各濃度平行5 份，分析測定得到的黃藤素峰面積（PS 無） 和鹽酸小檗堿內(nèi)標峰面積（PIS 無）。

黃藤素基質(zhì)效應(yīng)計算分公式：MFS%=PS 有/PS 無×100。

鹽酸小檗堿基質(zhì)效應(yīng)計算公式：MFIS%=PIS有/PIS 無×100。

同一樣品黃藤素的基質(zhì)效應(yīng)與內(nèi)標鹽酸小檗堿的基質(zhì)效應(yīng)的比值，即為歸一化基質(zhì)效應(yīng)因子。歸一化基質(zhì)效應(yīng)因子相對標準差應(yīng)小于15%。（4）線性關(guān)系考察 精密吸取濃度為0.525、1.05、2.62、6.56、16.4 和41.0 mg/L 系列PMH 標準工作液10?L，氮氣吹干后，按“1.2.3 血漿樣品處理”項下操作，以鹽酸巴馬汀峰面積（Ab） 和內(nèi)標峰面積（Ah） 的比值為縱坐標Y，鹽酸巴馬汀工作液濃度的1/5 為橫坐標X，用加權(quán)（1/X2） 最小二乘法擬合，不過原點，分別獲得每一批標準曲線回歸方程。方程相關(guān)系數(shù)r2應(yīng)不小于0.99。（5） 批內(nèi)與批間精密度考察 精密吸取10 μL 低、中、高濃度PMH（0.832、5.20 和32.6 mg/L） 質(zhì)控樣品溶液和0.525 mg/L 的PMH 校正溶液，按“1.2.3 血漿樣品處理”項下操作，各濃度平行5 份，連續(xù)測定3 批（每天一批），用隨行校正曲線計算質(zhì)控樣品的濃度，分別表示批內(nèi)與批間精密度，定量下限的RSD＜20%，其余濃度RSD＜15%。（6） 批內(nèi)與批間準確度考察 與前述“（5） 批內(nèi)與批間精密度考察”平行進行，用隨行校正曲線計算質(zhì)控樣品的濃度后，計算每一濃度測定的平均值與標示值的比值?100%，分別表示批內(nèi)與批間準確度，定量下限批內(nèi)與批間準確度應(yīng)在80%～120%，其余濃度應(yīng)在85%～115%范圍內(nèi)。（7） 穩(wěn)定性考察 進樣溶液穩(wěn)定性考察：精密吸取10 μL 低、中、高濃度PMH（0.832、5.20 和32.6 mg/L） 質(zhì)控樣品溶液，氮氣吹干后，按“1.2.3 血漿樣品處理”項下操作，制備成進樣溶液后，分別置室溫和2℃～8℃存放置2 d，每個濃度每個時間點平行5 份。

未處理血漿樣品穩(wěn)定性考察：精密吸取10 μL 低、中、高濃度PMH（0.832、5.20 和32.6 mg/L） 質(zhì)控樣品溶液，氮氣吹干后，加入50 μL 空白血漿，渦旋混勻后，分別于室溫放置1 d、-20℃存放35 d 室溫凍融3 次和-20℃存放1 d、10 d、35 d 的穩(wěn)定性。每個濃度每個時間點平行5份，后按“1.2.3 血漿樣品處理”項下操作。

隨行校正曲線計算質(zhì)控樣品的濃度后，計算每一濃度測定的平均值與標示值的比值×100%，應(yīng)在85%～115%范圍內(nèi)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

回歸方程及測定濃度為儀器工作站軟件“Thermo Xcalibur”處理，其余數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 統(tǒng)計學(xué)軟件進行處理，以均數(shù)±標準差（） 表示。

2 結(jié)果

2.1 含量測定色譜條件

黃藤素（PMH） 和鹽酸小檗堿（IS） 的保留時間分別為2.46 min 和2.47 min。洗脫條件見表1。

2.2 方法學(xué)驗證結(jié)果

2.2.1 特異性考察特異性樣品中雖然檢測到目標物PMH 及內(nèi)標鹽酸小檗堿，但目標物干擾組分影響率均小于20%，內(nèi)標干擾組分影響率均小于5%，說明空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)對樣品測定無干擾，見圖1。

2.2.2 殘留考察從測定結(jié)果可知，PMH 和內(nèi)標的殘留率分別為7.73%～10.37%、0.37%～0.97%，本方法的殘留量對定量下限的影響可以忽略不計。

2.2.3 基質(zhì)效應(yīng)考察黃藤素與內(nèi)標的歸一化基質(zhì)效應(yīng)因子相對標準偏差RSD%小于15%，符合要求，見表2。

2.2.4 線性關(guān)系考察以血藥濃度對峰面積比值建立回歸方程，得到血漿樣品中黃藤素的標準曲線，見表3。由表3 可知，血漿中黃藤素濃度在105.0～8 200 μg/L 內(nèi)濃度與峰面積之間有良好的線性關(guān)系（r2＞0.999）。

2.2.5 批內(nèi)與批間精密度考察批內(nèi)及批間精密度的RSD%均小于15%，檢測方法的精密度滿足要求，見表4。

2.2.6 批內(nèi)與批間準確度考察不同濃度批內(nèi)及批間準確度均在85%～115%范圍內(nèi)，檢測方法的準確度滿足要求，見表5。

2.2.7 穩(wěn)定性考察（1） 進樣溶液穩(wěn)定性考察（表6）：從表6 結(jié)果可知，進樣溶液在室溫和2～8℃存放置2 天穩(wěn)定性符合要求；（2） 未處理血漿樣品穩(wěn)定性考察：未處理血漿樣品在室溫放置1 d、-20℃存放35 d 室溫凍融3 次和-20℃存放1 d、7 d、35 d 的穩(wěn)定性符合要求，見表7。

表1 梯度洗脫條件Tab.1 Gradient elution conditions

圖1 血漿樣品的特異性考察（SIM）Fig.1 Inspection on specificity of monkey plasma sample(SIM)

表2 黃藤素與內(nèi)標基質(zhì)效應(yīng)［n=5，（）］Tab.2 Linear relationship of PMH and IS in monkey plasma ［n=5，（）］

表2 黃藤素與內(nèi)標基質(zhì)效應(yīng)［n=5，（）］Tab.2 Linear relationship of PMH and IS in monkey plasma ［n=5，（）］

表3 黃藤素在血漿中的線性關(guān)系Tab.3 Linear relationship of PMH in monkey plasma

表4 精密度實驗結(jié)果［n=5，（）］Tab.4 The results of precision ［n=5，（）］

表4 精密度實驗結(jié)果［n=5，（）］Tab.4 The results of precision ［n=5，（）］

表5 準確度實驗結(jié)果［n=5，（）］Tab.5 The results of accuracy［n=5，（）］

表5 準確度實驗結(jié)果［n=5，（）］Tab.5 The results of accuracy［n=5，（）］

表6 進樣溶液穩(wěn)定性考察結(jié)果［n=5，（）］Tab.6 The results of stability in injection solution ［n=5，（）］

表6 進樣溶液穩(wěn)定性考察結(jié)果［n=5，（）］Tab.6 The results of stability in injection solution ［n=5，（）］

3 討論

充分利用現(xiàn)代分析檢測設(shè)備，建立科學(xué)、靈敏、特異、快速的黃藤素檢測技術(shù)與方法，是進行黃藤素新產(chǎn)品研發(fā)的必要途徑，是實現(xiàn)藥品質(zhì)量可控性的有力保證，也是展開藥代動力學(xué)等更深層次研究的重要技術(shù)手段。本研究建立的UPLC/Q Exactive MS 快速測定食蟹猴體內(nèi)黃藤素的血藥濃度的方法，線性范圍寬，分析時間短，準確度好、靈敏度高、特異性強，適于黃藤素藥代及毒代動力學(xué)分析檢測。

實驗研究中發(fā)現(xiàn)，進樣溶液濃度在0.2625～20.50 μg/L 基礎(chǔ)上還可以降低20 倍，依然符合定量下限10 倍信噪比的要求，可為黃藤素藥代動力學(xué)研究提供參考。

表7 未處理血漿穩(wěn)定性考察結(jié)果［n=5，（）］Tab.7 The results of stability in injection solution ［n=5，（）］