G 蛋白偶聯(lián)受體激酶5 與非小細(xì)胞肺癌的臨床相關(guān)性

陳本超，李 恒，劉 超，王書廷，李高峰

（昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院胸外二科，云南昆明 650100）

肺癌全球高發(fā)，嚴(yán)重威脅人民健康，肺癌的發(fā)病率和死亡率居所有惡性腫瘤之首[1]。根據(jù)組織病理學(xué)特性，非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC） 是肺癌的一個(gè)類別，在肺癌中NSCLC 占其中85%的比例[2-3]。雖然目前極大的推廣了肺癌的早診早治理念，但仍有大部分NSCLC患者確診時(shí)已屬于晚期，目前對(duì)于晚期肺癌的主要治療方法仍以內(nèi)科治療為主[4]。但伴隨近年來腫瘤分子靶向治療和免疫治療的潛入研究，靶向藥物以其局部殺傷的高效性及安全性備受關(guān)注，對(duì)于有基因突變的晚期NSCLC 患者，靶向治療已逐漸成為一線用藥的首選[5]。然而部分患者通過基因檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)相應(yīng)靶基因突變，對(duì)于這部分患者臨床上仍然以傳統(tǒng)的放化療為主要治療方式，因此探求一種新的相對(duì)廣譜的靶點(diǎn)已成為目前治療肺癌的熱點(diǎn)研究。

G 蛋白偶聯(lián)受體激酶5（G protein-coupled receptor kinases 5，GRK5） 是GRKs 家族其中一種亞型，其通常分布于身體各個(gè)器官組織，尤其在肺和心臟中有較高表達(dá)，有研究表明GRK5 是多種疾病以及惡性腫瘤的調(diào)控蛋白[6-7]。雖然GRK5 在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，但是GRK5 在非小細(xì)胞肺癌中的作用機(jī)制研究鮮有報(bào)道。本研究擬利用免疫組織化學(xué)法探究NSCLC 中GRK5 的表達(dá)情況，并研究其與NSCLC 患者臨床關(guān)聯(lián)性，以期能為臨床NSCLC 的治療提供新的藥物靶點(diǎn)和新的預(yù)后指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 一般資料收集昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院（云南省腫瘤醫(yī)院） 胸外二科2017年8月至2018年12月176例手術(shù)切除的NSCLC 癌巢組織蠟塊及其癌旁組織蠟塊。蠟塊對(duì)應(yīng)患者基本臨床信息見表1，本課題已通過倫理委員會(huì)審查，所有患者術(shù)前均已簽署知情同意書。

1.1.2 主要試劑GRK5 抗體（NO.ab64943，abcam 公司，英國），動(dòng)物非免疫血清（羊） （SP KIT-B3，邁新公司，福州），ABC 抗鼠/兔通用型免疫組化檢測(cè)試劑盒（NO.K5007，Dako 公司，丹麥）

1.2 方法

免疫組化檢測(cè)NSCLC 中GRK5 的表達(dá)將組織蠟塊用輪片切片機(jī)切成4 μm 制成病理切片，嚴(yán)格按照烤片、二甲苯脫蠟、各級(jí)濃度乙醇水化、3%過氧化氫溶液處理、5%羊血清封閉、GRK5 一抗（濃度1:1 000） 孵育過夜、ABC 法染色、蘇木素復(fù)染、各級(jí)濃度乙醇脫水、中性樹膠進(jìn)行封片等免疫組化實(shí)驗(yàn)步驟。由兩位副主任病理醫(yī)師對(duì)組織標(biāo)本的免疫組化染色切片分別在顯微鏡下參照標(biāo)準(zhǔn)Fromowitz 方法進(jìn)行評(píng)估，如果對(duì)同一病理切片的病理評(píng)價(jià)結(jié)果有差異，則由兩位醫(yī)師同時(shí)在雙頭顯微鏡下進(jìn)行再次評(píng)估和商議后，確定最終結(jié)果。

表1 非小細(xì)胞肺癌患者臨床病例特征［n（%）］Tab.1 Clinical characteristics of patients with non-small cell lung ［n（%）］

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，以α=0.05 作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，其中率的比較進(jìn)行卡方檢驗(yàn)（Chi-Square test），多組間比較用單因素方差分析，兩組間比較作獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。生存分析采用Kaplan-Meier 數(shù)據(jù)庫（http://kmplot.com） 進(jìn)行分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GRK5 在NSCLC 癌巢及癌旁組織中的表達(dá)情況

在176例NSCLC 患者癌巢中，其中92例GRK5 陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率52.27%，84例陰性表達(dá)，陰性表達(dá)率47.73%；在患者癌旁肺組織中，其中64例GRK5 陽性表達(dá)，陽性率36.36%，112例陰性表達(dá)，陰性表達(dá)率63.64% （圖1），GRK5在NSCLC 癌巢中的陽性表達(dá)率相較于癌旁肺組織高，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析P=0.003，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

圖1 GRK5 在NSCLC 癌巢及癌旁組織中表達(dá)結(jié)果Fig.1 GRK5 expression in tumor nests and adjacent tissues of NSCLC

表2 GRK5 在NSCLC 癌巢及癌旁組織中的表達(dá)情況［n（%）］Tab.2 Expression of GRK5 in tumor nests and adjacent tissue of NSCLC ［n（%）］

2.2 GRK5 在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)與臨床的關(guān)聯(lián)性

在176例NSCLC 患者中，共有124例肺腺癌，其中72例陽性表達(dá)，陽性率58.06%，52例陰性表達(dá)，陰性表達(dá)率41.94%；共有52例肺鱗癌，其中20例GRK5 陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率38.46%，32例陰性表達(dá)，陰性表達(dá)率61.54%，GRK5 在肺腺癌中的陽性表達(dá)率較鱗癌高，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.018），見表3。而本研究中GRK5 的表達(dá)與NSCLC 患者的年齡、性別、病理分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移等無臨床關(guān)聯(lián)性（P＞0.05）。

2.3 GRK5 在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)聯(lián)性

通過Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫對(duì)1 926例肺癌患者進(jìn)行生存分析，結(jié)果顯示GRK5 高表達(dá)患者中位生存時(shí)間為63 個(gè)月，而GRK5 低表達(dá)患者中位生存時(shí)間為77.77 個(gè)月，高表達(dá)患者總生存時(shí)間（overall survival，OS） 顯著低于低表達(dá)患者OS，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001，HR 1.24，95%CI 1.09～1.4）。同時(shí)在肺腺癌中GRK5 高表達(dá)也提示不良預(yù)后（P=0.000 3），而在鱗癌中GRK5 的表達(dá)與預(yù)后無相關(guān)性（P=0.65），見圖2。

表3 GRK5 在NSCLC 組織中的表達(dá)與組織學(xué)類型的臨床關(guān)系［n（%）］Tab.3 The clinical relationship between GRK5 expression and histological types in NSCLC ［n（%）］

圖2 GRK5 在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)與總生存期的相關(guān)性Fig.2 The correlation between GRK5 expression and overall survival in NSCLC

3 討論

GRK5 是GRKs 家族其中一種亞型，其通常分布于身體各個(gè)器官組織，主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)膜上，尤其在肺和心臟中有較高表達(dá)，在其他實(shí)體組織器官中也可檢測(cè)到微量GRK5 表達(dá)[12]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，GRK5 可以直接或間接調(diào)節(jié)G 蛋白偶聯(lián)受體及其下游蛋白信號(hào)分子從而參與相關(guān)疾病或腫瘤的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[13]。在GRK5 基因敲除小鼠中，p53 的蛋白水平以及DNA 損傷導(dǎo)致的胸腺細(xì)胞凋亡均有升高[14-15]，這些研究表明，GRK5 不僅與心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展有相關(guān)性[16]，同時(shí)在腫瘤的增殖、分化中可能具有重要的作用。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，GRK5 主要在NSCLC癌巢及癌旁肺組織的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，而信號(hào)調(diào)節(jié)通路中的關(guān)鍵蛋白往往位于細(xì)胞膜，且已有研究表明GRK5 可以調(diào)控前列性腫瘤、腎細(xì)胞癌以及膠質(zhì)瘤的生長[17-18]，由此筆者分析GRK5 可能是肺癌增殖、分化等相關(guān)調(diào)節(jié)信號(hào)通路中的重要蛋白。在本實(shí)驗(yàn)176例NSCLC 中，GRK5 在NSCLC 癌巢中的表達(dá)顯著高于癌旁肺組織，同時(shí)通過生存分析結(jié)果顯示GRK5 高表達(dá)肺癌患者OS 顯著低于低表達(dá)患者，該生存分析結(jié)果與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，由此可以分析GRK5 可能促進(jìn)NSCLC 細(xì)胞的異常分化、增殖等。有研究表明，這可能與GRK5 能夠抑制p53 依賴的細(xì)胞凋亡和G1 期阻滯有關(guān)[15，19]。在與臨床特征關(guān)聯(lián)性分析中發(fā)現(xiàn)，GRK5 在腺癌中的表達(dá)高于鱗癌，而與其他臨床特征無相關(guān)性，生存分析結(jié)果顯示在肺腺癌中GRK5 高表達(dá)提示不良預(yù)后，而在鱗癌中GRK5 的表達(dá)與預(yù)后無相關(guān)性。綜上筆者可以得出結(jié)論，GRK5 在NSCLC 中可能是一個(gè)促癌因子，NSCLC 的增殖、分化等可能與它的過表達(dá)有關(guān)，尤其是在肺腺癌中。筆者的研究結(jié)果與已有相關(guān)研究結(jié)果相一致[20]。因此未來筆者有望將GRK5 作為肺腺癌的特異性腫瘤分子標(biāo)志物或藥物靶點(diǎn)，從而為肺腺癌的診斷和治療提供新的分子標(biāo)志物和靶點(diǎn)。

雖然本研究探討了GRK5 在NSCLC 中的表達(dá)與臨床及預(yù)后的相關(guān)性，但筆者需要更大樣本免疫組化驗(yàn)證以及進(jìn)一步的細(xì)胞學(xué)和動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)探索其在NSCLC 的分化、增殖、凋亡中的作用及其內(nèi)在機(jī)制。因此，本研究的意義在于為進(jìn)一步研究GRK5 在NSCLC 中的發(fā)病機(jī)制提供了基礎(chǔ)方向，為NSCLC 的診斷、治療和預(yù)后提供了潛在的新靶點(diǎn)。