5歲以下兒童4種病毒性腹瀉流行特征

劉 晨 馮 雪 邵冬華 何美琳 梁國(guó)威

嬰幼兒急性腹瀉病是我國(guó)兒童的常見(jiàn)病之一[1]。而輪狀病毒(rotavirus, RV)、諾如病毒(norovirus, NORV)、腸道腺病毒(enteric adenoviruses, EADV)和人星狀病毒(human astrovirus, HASTV)等是引起嬰幼兒急性腹瀉的主要病原體[2～5]。病毒性腹瀉感染力強(qiáng)、傳播較快、潛伏期短，極易造成疾病的流行。社會(huì)經(jīng)濟(jì)水平的提高、水質(zhì)和衛(wèi)生條件的改善并不能降低其發(fā)生率，需要醫(yī)務(wù)人員盡早對(duì)疾病做出診斷[6]。而相關(guān)腹瀉病毒的流行特征對(duì)于臨床防治嬰幼兒急性腹瀉具有重要的指導(dǎo)意義。

基于上述研究背景和目前的研究現(xiàn)狀，筆者對(duì)北京市航天中心醫(yī)院及周邊社區(qū)5歲以下兒童糞便中4種主要的腹瀉病毒RV、NORV、EADV和HASTV感染和混合病毒感染進(jìn)行為期1年全面的調(diào)查統(tǒng)計(jì)，使用熒光免疫法對(duì)上述4種腹瀉病毒進(jìn)行檢測(cè)，分析其流行病學(xué)情況；同時(shí)用PCR法檢測(cè)EADV進(jìn)行方法學(xué)比對(duì)試驗(yàn)，為制定5歲以下兒童病毒性腹瀉的預(yù)防控制策略提供科學(xué)依據(jù)。

對(duì)象與方法

1.研究對(duì)象:選取航天中心醫(yī)院和永定路社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心2017年1～12月連續(xù)1年在門診因急性腹瀉就診的5歲以下兒童。急性腹瀉定義標(biāo)準(zhǔn)：①大便性狀較平時(shí)改變，呈水樣或蛋花樣，無(wú)黏液和膿血，次數(shù)較平時(shí)增多，或24h內(nèi)稀便≥3次，伴或不伴嘔吐和發(fā)熱；②病程不超過(guò)14天。門診患兒入選需符合以下標(biāo)準(zhǔn)：①因?yàn)榧毙愿篂a就診；②大便鏡檢：WBC<5/HPF，并且無(wú)巨噬細(xì)胞。收集上述研究對(duì)象糞便標(biāo)本、人口學(xué)資料及流行病學(xué)資料。本研究中受試者監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書(shū)，本研究得到航天中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)同意(批件文號(hào)：20150311-YNKS-05)。

2.標(biāo)本采集及處理：取患兒新鮮糞便樣本約3～5g或水樣便3～5ml，分為兩份。一份置于PBS混懸液中混勻3000r/min離心10min，上清液作為標(biāo)本直接用熒光免疫法進(jìn)行檢測(cè)；另一份于-80℃冷凍保存，用于DNA的提取。DNA提取方法是將0.1g或0.1ml糞便樣本置于1ml 0.9%NaCl注射液中，混勻制成10%的糞便懸液，8000r/min離心5min，吸取上清液提取糞便中的DNA。采用病毒核酸提取試劑盒(中國(guó)臺(tái)灣地區(qū)Geneaid公司)提取DNA，操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

3.檢測(cè)方法:腹瀉病毒4項(xiàng)(RV、NORV、EADV和HASTV)抗原檢測(cè)采用熒光免疫法，由北京博暉創(chuàng)新光電技術(shù)股份有限公司提供的聯(lián)合檢測(cè)試劑盒(試劑批號(hào):20170101)及其配套檢測(cè)儀器(BH400-Ⅱ熒光免疫層析分析儀)。針對(duì)EADV病毒hexon基因片段，采用的特異性上游引物為5′-TTCCCCATGGCICAYAACAC-3′；下游引物為5′-CCCTGGTAKCCRATRTTGTA-3′[7]。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度482bp，PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)有無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物條帶進(jìn)行鑒定，詳見(jiàn)圖1。

圖1 EADV病毒hexon基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖M.DL2000 DNA Marker；1，2.EADV病毒hexon基因PCR產(chǎn)物

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：使用SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間率的比較采用χ2檢驗(yàn)；EADV抗原熒光免疫法與PCR法檢出率比較采用配對(duì)χ2檢驗(yàn)，并以Kappa值作為兩種檢測(cè)方法一致性好壞的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(Kappa≥0.75 一致性佳，0.40

結(jié) 果

1.4種病毒抗原熒光免疫法檢出情況:1398例腹瀉患兒糞便標(biāo)本中共檢出陽(yáng)性699例(50.00%)，其中661例(47.28%)為單病毒感染，38例(2.72%)為混合病毒感染，詳見(jiàn)圖2。在單病毒感染中，RV、NORV、EADV和HASTV的陽(yáng)性病例依次為422例(30.19%)、138例(9.87%)、60例(4.29%)和41例(2.93%)；在混合病毒感染中，最為常見(jiàn)的是RV和NORV同時(shí)感染為24例，其次是RV和EADV同時(shí)感染11例，而RV、NORV和EADV 3種病毒同時(shí)感染檢測(cè)出3例。

圖2 4種病毒抗原熒光免疫法檢出情況

在1398例標(biāo)本中，單病毒感染和混合感染合計(jì)的RV、NORV、EADV和HASTV的陽(yáng)性分別為460例(32.90%)、165例(11.80%)、74例(5.29%)和41例(2.93%)，4種病毒的陽(yáng)性構(gòu)成比依次為62.16%、22.30%、10.00%和5.54%。

2.每月總例數(shù)及總陽(yáng)性率檢出情況：檢測(cè)總例數(shù)及總陽(yáng)性率檢出情況按照自然月分布顯示詳見(jiàn)圖3，1月送檢總例數(shù)最多為148例，12月份病毒性腹瀉患病例數(shù)最多為120例，12月份檢出陽(yáng)性率最高為84.50%。8月份送檢總例數(shù)和病毒性腹瀉患病例數(shù)均為最少，分別為84例和23例，陽(yáng)性率也最低為27.38%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。總之，秋、冬季節(jié)送檢總例數(shù)、病毒性腹瀉患病例數(shù)及陽(yáng)性率均高于春、夏季節(jié)。

圖3 每月總例數(shù)及總陽(yáng)性率檢出情況

3.不同性別、年齡患兒4種病毒抗原檢出情況：1398例腹瀉患兒糞便標(biāo)本中，男性729例，女性669例，其中，4種單病毒感染和混合病毒感染的男性、女性患兒例數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。月齡分組顯示，RV、NORV、HASTV和混合病毒感染在7～12、13～24和25～36月齡組患兒中陽(yáng)性率均比其他月齡組高，EADV在7～12月齡組的陽(yáng)性率比其他月齡組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，詳見(jiàn)表1。

4.不同時(shí)間患兒4種病毒抗原檢出情況:4種單病毒感染和混合病毒感染情況按照自然月分布進(jìn)行分析顯示(圖4)，RV在1～2月份和10～12月份，也就是秋、冬季節(jié)陽(yáng)性率最高，與3～9月份比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；NORV陽(yáng)性率在4～5月份和12月份出現(xiàn)雙峰升高，與1～3月份和6～11月份比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；EADV在5～8月份，也就是夏季陽(yáng)性率最高，與1～4月份和9～12月份比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；HASTV陽(yáng)性率在9～11月份明顯升高，與1～8月份和12月份比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而對(duì)于混合病毒感染，各季節(jié)感染率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 不同性別、年齡患兒腹瀉病毒陽(yáng)性檢出情況[n(%)]

圖4 不同時(shí)間患兒4種病毒抗原檢出情況

5.EADV抗原熒光免疫法與PCR法檢出率比較：采用配對(duì)資料的χ2檢驗(yàn)對(duì)熒光免疫法和PCR法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，熒光免疫法抗原檢出74例，PCR法檢出88例。PCR法檢出率占總檢出率的88.89%(88/99)，熒光免疫法檢出率占總檢出率的74.75%(74/99)，兩種方法檢出共同陽(yáng)性63例，一致陽(yáng)性率為63.60%(63/99)。配對(duì)χ2檢驗(yàn)顯示，PCR法檢出率高于熒光免疫法抗原檢出率，陽(yáng)性檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=823.397，P=0.029)，但Kappa=0.764，顯示兩種方法仍具有一致性，詳見(jiàn)表2。

表2 熒光免疫法與PCR法對(duì)腸道腺病毒的檢出情況(n)

討 論

病毒性腹瀉屬于《中華人民共和國(guó)傳染病防治法》中規(guī)定的丙類傳染病，對(duì)各年齡人群特別是5歲以下兒童的身體健康有極大威脅，這其中主要包括了RV、NORV、EADV和HASTV等多種腹瀉病毒。本研究對(duì)航天中心醫(yī)院及周邊社區(qū)5歲以下兒童門診病例中常見(jiàn)的4種腹瀉病毒及混合病毒感染情況進(jìn)行了調(diào)查統(tǒng)計(jì)，檢出腹瀉病毒的標(biāo)本陽(yáng)性率為50.00%，這與近年來(lái)報(bào)道的兒童腹瀉病毒陽(yáng)性率為24.05%～58.42%相符，而且檢測(cè)方法不同、研究地區(qū)不同也會(huì)造成結(jié)果的差別[8～10]。其中RV(30.19%)是導(dǎo)致腹瀉最主要的病毒，NORV(9.87%)、EADV(4.29%)和HASTV(2.93%)感染陽(yáng)性率相對(duì)較低，此外還有38例為混合病毒感染。

RV在世界范圍內(nèi)是引起嬰幼兒急性和重癥腹瀉最常見(jiàn)的病原體。最近監(jiān)測(cè)顯示我國(guó)因腹瀉入院檢查的5歲以下兒童中RV陽(yáng)性率高達(dá)68.60%，也是目前相關(guān)研究最深入的腹瀉病毒和唯一有疫苗能夠預(yù)防的腹瀉病毒[11]。NORV屬單股正鏈RNA病毒，是第一個(gè)被證實(shí)可引起人類急性胃腸炎的病毒，極易發(fā)生抗原變異，被稱為“胃腸道流感病毒”。已有研究證實(shí)NORV與12%的輕、中度腹瀉患者有關(guān)，是嬰幼兒腹瀉僅次于RV的病毒性致病原[12]。EADV是一種雙鏈DNA病毒，感染呈全球性分布，在嬰幼兒急性腹瀉中EADV的檢出率為1.1%～12.0%，但值得注意的是，在無(wú)癥狀兒童的糞便標(biāo)本中也可以檢測(cè)出EADV，也就是說(shuō)EADV可能會(huì)引起隱性感染[7,13]。HASTV屬于單股正鏈RNA病毒，世界各地均有報(bào)道感染，己經(jīng)確認(rèn)可感染各個(gè)年齡段人群，但主要感染兒童、老年人和免疫缺陷人群。世界各地的感染發(fā)生率報(bào)道有所差別，其中北京兒童醫(yī)院調(diào)查得出的結(jié)論是9.0%[14]。

秋、冬季節(jié)送檢總例數(shù)、病毒性腹瀉患病例數(shù)及陽(yáng)性率均高于春、夏季節(jié)。4種單病毒感染及混合病毒感染均無(wú)性別差異，但是在7～36月齡為病毒性腹瀉的高發(fā)月齡。這可能與兒童的生理免疫狀態(tài)特點(diǎn)有關(guān)，6個(gè)月及以下嬰幼兒從母體乳汁中獲得了大量的抗體，尤其是sIgA抗體，有很強(qiáng)的免疫保護(hù)作用；而6個(gè)月以上兒童由于母乳喂養(yǎng)的結(jié)束、母乳中抗體量顯著減少且自身的免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟、消化系統(tǒng)功能薄弱，因此容易感染各種病原體[15]。3歲以上兒童隨著自身免疫功能的逐漸完善，血清及小腸分泌特異性免疫球蛋白的增加，抗感染能力增強(qiáng)。由于樣本量有限、調(diào)查年限較短，統(tǒng)計(jì)結(jié)果可能有一定的誤差，但對(duì)總體趨勢(shì)無(wú)明顯影響。在時(shí)間分布特征上，4種單病毒感染及混合病毒感染也表現(xiàn)出了明顯的差別，RV秋、冬季節(jié)比春季高發(fā)，NORV春季和秋、冬季節(jié)高發(fā)，EADV在夏季高發(fā)，HASTV的陽(yáng)性率在秋季明顯升高。而對(duì)于混合病毒感染的樣本，由于例數(shù)較少，其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

除此以外，筆者還對(duì)熒光免疫法和PCR法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較分析，PCR法檢出率高于熒光免疫法抗原檢出率，兩種方法的陽(yáng)性檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。采用Kappa值作為兩種檢測(cè)方法一致性好壞的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，為0.764≥0.750一致性佳。其中PCR法對(duì)EADV的陽(yáng)性檢出率更高。造成陽(yáng)性檢出率差異的原因可能為：(1)腺病毒是雙鏈DNA病毒，含52種血清型，根據(jù)其生物學(xué)特點(diǎn)將其分為A～F 6個(gè)亞類[4]。其中EADV 就是指F亞類中的F40、F41，是引起兒童急性胃腸炎的主要血清型。而PCR法中針對(duì)腺病毒hexon基因片段的引物是針對(duì)所有亞型腺病毒的，包括但不僅限于EADV，在以后的研究中，筆者還會(huì)對(duì)腺病毒的基因分型進(jìn)行進(jìn)一步分析。(2)在無(wú)癥狀兒童的糞便標(biāo)本中也可以檢測(cè)到EADV，表明EADV有引起隱性感染的可能性。(3)熒光免疫法敏感度較高，也就是說(shuō)假陽(yáng)性率可能會(huì)偏高[16]。經(jīng)過(guò)方法學(xué)的比較，不難看出快速的篩查方法對(duì)輔助診斷病毒性腹瀉很重要。目前腹瀉病毒的檢測(cè)多采用PCR檢測(cè)，操作步驟多、耗時(shí)長(zhǎng)，多重病毒聯(lián)合PCR檢測(cè)由于假陽(yáng)性率較高應(yīng)用并不廣泛，且篩查相對(duì)費(fèi)時(shí)、費(fèi)力[17]。而熒光免疫法實(shí)驗(yàn)過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單、耗時(shí)短，且一次實(shí)驗(yàn)?zāi)芡瑫r(shí)檢測(cè)4種病毒，更好地適應(yīng)了臨床需求，但假陽(yáng)性率高，更適合初篩，進(jìn)一步確認(rèn)還是需要做PCR檢測(cè)[16]。而兩種檢測(cè)方法聯(lián)合檢測(cè)，能大大提高腸道腺病毒的陽(yáng)性檢出率，減少漏診率。

綜上所述，通過(guò)本項(xiàng)研究筆者對(duì)航天中心醫(yī)院及周邊社區(qū)5歲以下兒童的病毒性腹瀉病原譜有了基本了解，4種腹瀉病毒在陽(yáng)性檢出率、年齡分布、時(shí)間分布上均有一定的特征，這為病毒性腹瀉的預(yù)防控制、疾病監(jiān)測(cè)方面提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，但本研究對(duì)各病毒基因型的構(gòu)成情況未深入研究。為提高檢出率、減少漏診率、滿足臨床日益增長(zhǎng)的檢測(cè)需求，檢測(cè)相關(guān)腹瀉病毒時(shí)，建議采用抗原陽(yáng)性檢出率較高、檢測(cè)工效較高的實(shí)驗(yàn)方法比如熒光免疫法作為初步篩查，同時(shí)在必要情況下結(jié)合PCR法以防止漏檢，為臨床治療提供及時(shí)、有效的實(shí)驗(yàn)信息。