紅景天對間歇低氧致大鼠腦組織神經(jīng)因子表達(dá)異常的干預(yù)作用

焦 婷 吳茂蘭 曹 慧 劉維英

睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(obstructive sleep apnea hypopnea syndrome，OSAHS)患者夜間睡眠中反復(fù)發(fā)生的呼吸暫停和低通氣造成間歇低氧，是引發(fā)或加重心腦血管疾病及代謝紊亂的重要致病因素。OSAHS可能引起的腦部病變包括腦血栓、腦出血、癲癇發(fā)作、癡呆、精神異常、焦慮、抑郁、認(rèn)知障礙、性格改變等，具體機(jī)制尚不明確[1]。紅景天(Rhodiola rosea)為景天科植物，研究表明紅景天中含有紅景天甙元、紅景天甙、沒食子酸、二苯甲基六氫吡啶、β-谷甾醇等多種有效成分，對減輕心肌梗死損傷、降低心肌氧耗、增加冠脈血流、抑制心臟、肝臟過氧化等具有明顯作用，對大腦損傷的保護(hù)作用及機(jī)制尚不明確[2～4]。為此筆者模擬睡眠呼吸暫?；颊咭归g間歇低氧狀態(tài)，應(yīng)用大鼠模型，研究間歇低氧引起的氧化應(yīng)激及慢性缺氧對大腦神經(jīng)生長因子表達(dá)的影響，并應(yīng)用紅景天進(jìn)行干預(yù)，探討紅景天對大腦的保護(hù)作用[5,6]。

材料與方法

1.動物分組：4周齡雄性大鼠45只(蘭州大學(xué)動物實驗中心，實驗動物合格證號：NO.62000800000260)，體質(zhì)量100±20g， 隨機(jī)分為5組，即常氧對照組(non-specific control group，NC組)、間歇低氧組(IH組)、間歇低氧低劑量紅景天干預(yù)組(IH+Low-dose SI組)、間歇低氧中劑量紅景天干預(yù)組(IH+ medium-dose SI組)、間歇低氧高劑量紅景天干預(yù)組(IH+ high-dose SI組)，每組9只。

2.實驗設(shè)備：間歇低氧裝置(專利號：ZL 2016 2 0084607.7)、醫(yī)用氮氣氧氣(蘭州光華物資公司)、CY-12C測氧儀(浙江建德市新安江分析儀器二廠)。

3.動物模型：將實驗組大鼠置入間歇低氧艙內(nèi)，艙內(nèi)間斷充入氮氣、氧氣及壓縮空氣，每循環(huán)120s[7]。低氧期氮氣持續(xù)充入30s，維持10s，使艙內(nèi)最低氧濃度保持在6%～7%，復(fù)氧期氧氣持續(xù)充入20s，使氧濃度回升至20%～21%；后持續(xù)充入壓縮空氣60s，使艙內(nèi)氧濃度保持在20%～21%；對照組持續(xù)充入壓縮空氣，艙內(nèi)氧濃度保持在20%～21%，實驗時間每天8:00～16:00時，共8h，期間大鼠自由攝食飲水，其他時間常規(guī)條件飼養(yǎng)。第16天開始，IH+Low-dose SI組腹腔注射紅景天注射液(吉林省通化玉圣藥業(yè)有限公司)0.5ml/(kg·d)，IH+ medium-dose SI組腹腔注射紅景天注射液1ml/(kg·d)，IH+high-dose SI組腹腔注射紅景天注射液2ml/(kg·d)，均使用0.9%氯化鈉溶液配制為1ml溶液，間歇低氧組及常氧對照組腹腔注射0.9%氯化鈉溶液1ml,共30天。

4.指標(biāo)檢測：實驗結(jié)束后，以10%水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，經(jīng)腹主動脈取血處死，在冰床上快速解剖分離大鼠大腦，-80℃凍存，檢測以下指標(biāo)。

(1)腦組織一氧化氮(nitric oxide，NO)、超氧化物岐化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量：采用比色法檢測，取試驗品及對照品同時操作，然后依次加入等量的相應(yīng)試劑，并用同樣方法處理。在規(guī)定的波長處測定對照品和供試品溶液的吸收度后,按紫外分光光度法項下對照品比較法的計算式計算供試品濃度。當(dāng)吸收度和濃度關(guān)系不呈線性時，取數(shù)份梯度量的對照品溶液，用溶劑補(bǔ)充至同一體積，顯色后測定各份溶液的吸收度，然后以吸收度與相應(yīng)的濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)供試品的吸收度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出其含量。實驗標(biāo)本檢測儀器為A6半自動生化儀(北京松上技術(shù)有限公司),操作按照試劑盒說明進(jìn)行。

(2)腦組織促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)、缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxic induction factor-1α，HIF-1α)含量:采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測，腦組織離心后取上清液，滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氫體由無色的還原型變成有色的氧化型，出現(xiàn)顏色反應(yīng)。因此，可通過底物的顏色反應(yīng)來判定有無相應(yīng)的免疫反應(yīng)，顏色反應(yīng)的深淺與標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原的量呈正比。實驗標(biāo)本檢測儀器為華衛(wèi)朗德DR-200BS酶標(biāo)分析儀(無錫華衛(wèi)德朗儀器有限公司)，操作按照試劑盒說明進(jìn)行。

(3)腦組織腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factors，BDNF)、神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)基因表達(dá)：采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法檢測，以GAPDH為內(nèi)參照，采用RT-PCR檢測。按試劑盒說明書提取總RNA，將所需mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增、檢測。BDNF：上游引物5′-TGTCGCACGGTCCCCATT-3′、下游引物5′-CCCGGTCTCATCAAAGCCTG-3′，擴(kuò)增片段101bp。NGF：上游引物5′-TCGCTCTCCTTCACAGAGTTTT-3′、下游引物5′-ACACTGAGGTGAGCTTGGGT-3′，擴(kuò)增片段84bp。反應(yīng)條件：94℃ 2min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，循環(huán)30次，72℃ 5min。擴(kuò)增：預(yù)變性 95℃ 10min，循環(huán)40次，95℃ 15s→60℃ 60s；溶解曲線 75℃→95℃，每20s升溫1℃。結(jié)果分析采用ΔΔCT法，A=CT(目的基因，待測樣本)- CT(內(nèi)標(biāo)基因，待測樣本)，B=CT(目的基因，對照樣本)-CT(內(nèi)標(biāo)基因，對照樣本)，K=A-B，表達(dá)倍數(shù)=2-K。

結(jié) 果

1.各組腦組織氧化應(yīng)激水平比較:與NC組比較，IH組NO、SOD濃度明顯降低，MAD濃度明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(NO:P=0.010；SOD：P=0.000；MDA：P=0.000)；各劑量紅景天干預(yù)組與IH組比較,NO、SOD濃度均有不同程度升高，MAD濃度均有不同程度降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(IH+Low-dose SI組：NO：P=0.015；SOD：P=0.002；MDA：P=0.017；IH+ medium-dose SI組：NO:P= 0.001；SOD：P=0.000；MDA：P=0.002；IH+ high-dose SI組：NO：P=0.001；SOD：P=0.000；MDA：P=0.000)，以IH+ high-dose SI組改善最為明顯(表1)。

表1 各組大鼠腦組織勻漿中NO、SOD、MDA變化

與NC組比較,*P<0.01；與IH組比較,#P<0.05,##P<0.01

2.各組腦組織缺氧反應(yīng)程度比較:與NC組比較，IH組HIF-1α、EPO濃度明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(HIF-1α:P=0.000；EPO：P=0.000)；各劑量紅景天干預(yù)組與IH組比較，HIF-1α、EPO濃度均有不同程度降低，除IH+low-dose SI組HIF-1α差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.077)，其他各組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(IH+ Low-dose SI組：EPO：P=0.000；IH+Medium-dose SI組：HIF-1α:P=0.000；EPO：P=0.001；IH+ High-dose SI組：HIF-1α:P=0.000；EPO：P=0.000)，以IH+ High-dose SI組改善最為明顯(表2)。

表2 各組大鼠腦組織勻漿中HIF-1α、EPO變化

與NC組比較,*P<0.01；與IH組比較,#P<0.01

3.各組腦組織神經(jīng)因子基因表達(dá)水平比較:與NC組比較，IH組NGF、BDNF濃度明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(NGF:P=0.000；BDNF:P=0.000)；各劑量紅景天干預(yù)組與IH組比較,NGF、BDNF濃度均有不同程度降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(IH+Low-dose SI組：NGF:P=0.004；BDNF:P=0.000；IH+Medium-dose SI組：NGF:P=0.000；BDNF:P=0.000；IH+High-dose SI組：NGF:P=0.000；BDNF:P=0.000)，以IH+High-dose SI組改善最為明顯(表3)。

表3 各組大鼠腦組織勻漿中NGF、BDNF變化

與NC組比較,*P<0.01；與IH組比較,#P<0.01

4.腦組織神經(jīng)因子基因表達(dá)與氧化應(yīng)激水平相關(guān)性分析:IH大鼠大腦NO濃度與NGF水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.333,P=0.047)，SOD濃度與NGF水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.805,P=0.000)，MDA濃度與NGF水平呈正相關(guān)(r=0.565,P=0.000)，NO濃度與BDNF水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.516,P=0.001)，SOD濃度與BDNF水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.861,P=0.000)，MDA濃度與NGF水平呈正相關(guān)(r=0.490,P=0.002,圖1、圖2)。

圖1 NGF與氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)分析

圖2 BDNF與氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)分析

5.腦組織神經(jīng)因子基因表達(dá)與低氧反應(yīng)程度相關(guān)性分析：間歇低氧大鼠大腦EPO濃度與NGF水平呈正相關(guān)(r=0.711，P=0.000)，HIF-1α濃度與NGF水平呈正相關(guān)(r=0.786，P=0.000)，EPO濃度與BDNF水平呈正相關(guān)(r=0.702，P=0.000)，HIF-1α濃度與BDNF水平呈正相關(guān)(r=0.697,P=0.000,圖3、圖4)。

圖3 NGF與缺氧相關(guān)指標(biāo)分析

圖4 BDNF與缺氧相關(guān)指標(biāo)分析

討 論

氧化應(yīng)激廣泛參與OSAHS的發(fā)生、發(fā)展，并與多種并發(fā)癥相關(guān)[8～10]。Lena[11]報道OSAHS反復(fù)缺氧后再復(fù)氧，氧自由基過量生成和(或)細(xì)胞內(nèi)抗氧化能力下降，產(chǎn)生過量活性氧(ROS)和(或)活性氮(RNS)，RNS的過量產(chǎn)生可消耗NO，造成NO減少，舒張血管能力減弱。氧自由基的生成超過機(jī)體的清除能力，導(dǎo)致細(xì)胞生物膜的過氧化而產(chǎn)生MDA等產(chǎn)物。MDA主要反映機(jī)體氧化應(yīng)激程度，間接反映細(xì)胞膜損傷的程度[12]。機(jī)體清除過多活性氧的主要抗氧化酶系統(tǒng)包括SOD、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶。SOD在組織中的含量常作為清除氧自由基能力的主要指標(biāo)[13]。本實驗中IH組大鼠腦組織MDA含量明顯升高，NO、SOD含量明顯降低，提示IH對大鼠大腦存在嚴(yán)重氧化應(yīng)激改變，SOD明顯降低，MDA升高，提示氧自由基生成增多，清除減少，可能導(dǎo)致細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷。

HIF-1α作為一種參與低氧調(diào)控的核轉(zhuǎn)錄因子，可通過激活一系列編碼葡萄糖和能量代謝、血管生成、血管反應(yīng)和重構(gòu)的基因來減少缺氧的影響，從而產(chǎn)生缺氧的適應(yīng)性反應(yīng)。同時相關(guān)研究表明，由HIF-1α活性介導(dǎo)的內(nèi)皮素系統(tǒng)的激活是慢性間歇低導(dǎo)致高血壓、血管損傷及其相關(guān)心血管后果的原因[14]。促紅細(xì)胞生成素(EPO)為HIF-1α的下游基因，它的增多導(dǎo)致紅細(xì)胞增多和血紅蛋白含量增高是間歇低氧引起的血液系統(tǒng)主要代償性反應(yīng)之一[15]。研究發(fā)現(xiàn)低氧狀態(tài)下神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞也可產(chǎn)生EPO，在腦損傷動物模型中，EPO能減輕損傷后腦結(jié)構(gòu)破壞并改善腦功能,可能與EPO在多個層面上協(xié)同作用，包括限制活性氧的產(chǎn)生和減少細(xì)胞凋亡[16]。本實驗中IH組大鼠腦組織HIF-1α、EPO濃度較常氧對照組明顯增高，缺氧誘導(dǎo)基因反應(yīng)增強(qiáng)，存在明顯的缺氧損傷。

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子是腦細(xì)胞生成和分泌的一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分布廣泛，有促進(jìn)神經(jīng)元分化、再生及影響學(xué)習(xí)和記憶方面的突觸可塑性的作用，在嚴(yán)重間歇低氧引起腦細(xì)胞損傷時呈現(xiàn)高表達(dá)，具有抵抗傷害性刺激及修復(fù)損傷作用[17,18]。其機(jī)制可能是通過增加Trk-B的產(chǎn)生并提高它的活性，同時降低p75的表達(dá)水平來發(fā)揮預(yù)防性作用。其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是以受體酪氨酸磷酸化起始，激發(fā)下游Ras-MAPK通路來完成[19]。神經(jīng)生長因子NGF是神經(jīng)系統(tǒng)最重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子之一，是一種多亞基蛋白組成的靶組織源性修復(fù)細(xì)胞因子，它通過與神經(jīng)細(xì)胞上的高親和力受體Trk-A結(jié)合，誘導(dǎo)神經(jīng)纖維定向生長，控制神經(jīng)細(xì)胞存活數(shù)量和分化，促進(jìn)損傷神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)，減緩神經(jīng)細(xì)胞的凋亡過程，對維持損傷神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)、促進(jìn)神經(jīng)生長和修復(fù)具有重要作用。本實驗中神經(jīng)因子BDNF、NGF與氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)NO、SOD、MDA及缺氧相關(guān)指標(biāo)EPO、HIF-1α均呈相關(guān)性，缺氧指標(biāo)相關(guān)性更顯著，可能與缺氧誘導(dǎo)神經(jīng)因子受體表達(dá)增多有關(guān)。紅景天干預(yù)組較HI組BDNF和NGF明顯降低，且降低程度與紅景天劑量呈正比，是機(jī)體啟動防御和修復(fù)機(jī)制的結(jié)果，對防止神經(jīng)功能損失以及促進(jìn)受損神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)至關(guān)重要。但紅景天下調(diào)BDNF和NGF的機(jī)制尚不明確，有待于進(jìn)一步研究,可能與激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、活化星形細(xì)胞等有關(guān)。

紅景天為景天科紅景天屬多年生草本植物，主產(chǎn)于我國云南西北部、西藏等地。紅景天注射液是由紅景天經(jīng)微波技術(shù)輔助提取分離、純化、膜過濾而制成的中藥新藥注射液，其主要有效成分是紅景天苷，此外的化學(xué)成分還有酪醇、丁香酸等化合物。紅景天主要功效為祛瘀活血，現(xiàn)代藥理學(xué)證實大株紅景天具有促進(jìn)機(jī)體氧代謝、增強(qiáng)機(jī)體抗缺氧能力、抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗疲勞、心肌保護(hù)、改善認(rèn)知功能等藥理作用，因此臨床上主要將其應(yīng)用于心腦血管疾病、氣虛血瘀等適應(yīng)證。在本實驗中，經(jīng)紅景天干預(yù)后，間歇低氧大鼠血清NO、SOD濃度明顯增高，MDA、HFI-1α、EPO濃度降低，NGF、BDNF表達(dá)減少,高劑量組改善最明顯，各組改善程度與紅景天劑量呈正相關(guān)。紅景天通過抑制促氧化物產(chǎn)生和提高抗氧化物水平，緩解間歇低氧誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷，減輕慢性缺氧損傷，提高腦神經(jīng)營養(yǎng)因子的活性，從而可能預(yù)防神經(jīng)損傷、促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)，減輕間歇低氧對腦細(xì)胞的損傷作用。其詳細(xì)機(jī)制還有待進(jìn)一步深入探討。