脂聯(lián)素對膿毒癥小鼠腦損傷的保護作用及機制

張占琴 王 強

膿毒癥是一種由機體對感染的反應(yīng)失調(diào)引發(fā)危及生命的多器官功能障礙的致死性疾病[1]。據(jù)流行病學(xué)報道，膿毒癥患者約占總住院患者的2%，在重癥監(jiān)護病房(intensive care unit，ICU)中其所占比例為30.2%，病死率高達55.7%[2]。膿毒癥患者常常出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，其與患者疾病的嚴(yán)重性和預(yù)后密切相關(guān)[3]。膿毒癥腦病(sepsis-associated encephalopathy，SAE)是膿毒癥最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，目前SAE的發(fā)生率尚無定論，國外有研究報道其發(fā)生率可高達70%[4]。SAE可發(fā)生在膿毒癥的任何階段，主要臨床常表現(xiàn)為精神活動的延遲，注意力、定向力受損等，臨床統(tǒng)計顯示腦功能損傷和患者預(yù)后呈正相關(guān)， 轉(zhuǎn)入ICU時存在昏迷的膿毒癥患者病死率高達60%，SAE是預(yù)測患者病死率的獨立風(fēng)險因素，合并SAE顯著增加膿毒癥的治療難度[5]。此外，Iwashyna等[6]對膿毒癥存活患者進行長達3年的隨訪，發(fā)現(xiàn)依然有17%患者發(fā)生中、重度認知功能障礙。因此積極治療SAE對降低膿毒癥患者病死率及改善預(yù)后具有重要意義。

有研究表明，脂聯(lián)素缺乏增加促炎性細胞因子表達，血清中低脂聯(lián)素濃度與膿毒癥的嚴(yán)重程度具有負相關(guān)性，然而脂聯(lián)素是否具有改善膿毒癥腦損傷的作用尚未可知[7]。脂聯(lián)素可引起肌細胞線粒體數(shù)量增加，膿毒癥患者普遍存在線粒體抗氧化能力下降和活性氧、自由基過度產(chǎn)生，最終導(dǎo)致線粒體氧化還原平衡失衡，而脂聯(lián)素對膿毒癥腦損傷的保護作用是否與改善線粒體功能有關(guān)，這一問題仍有待研究[8，9]。本研究應(yīng)用脂聯(lián)素對膿毒癥模型小鼠進行干預(yù)，探討脂聯(lián)素治療對膿毒癥腦損傷發(fā)揮的效應(yīng)，以期為脂聯(lián)素應(yīng)用于SAE患者提供實驗理論依據(jù)。

材料與方法

1.實驗動物：6～8周齡SPF級雄性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量22～25g，購自西安交通大學(xué)動物實驗中心，購買后適應(yīng)性喂養(yǎng)3天，予自由飲食飲水。所有動物實驗遵循國家所制定的有關(guān)實驗動物保護和使用的指南，并經(jīng)西安交通大學(xué)實驗動物倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)通過。

2.主要試劑：脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)(Escherichia Coli O55：B5，美國Sigma 公司)；脂聯(lián)素(以色列ProSpec公司)；活性氧(reactive oxygen species，ROS)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide diamutase，SOD)檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；凋亡相關(guān)蛋白B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)蛋白(B-cell lymphoma 2-Associated X，Bax)、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cleaved caspase-3)和β-actin一抗(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)。

3.分組、模型制備和標(biāo)本采集：168只SPF級雄性C57BL/6小鼠，采用數(shù)字表法隨機分為空白對照組(CON組)、脂聯(lián)素對照組(APN組)、膿毒癥模型組(LPS組)、脂聯(lián)素干預(yù)組(LPS + APN組)。參照文獻[10]方法采用腹腔注射LPS 15mg/kg制備膿毒癥腦病模型，CON組腹腔注射等量0.9%氯化鈉注射液，LPS組側(cè)腦室注射等量0.9%氯化鈉注射液，LPS+APN組造模后30min給予側(cè)腦室注射APN 0.1μg/g。一部分小鼠(每組10只)造模24h后于麻醉下斷頭取大腦，迅速分離大腦組織，取左側(cè)大腦海馬切面置于40g/L多聚甲醛溶液中固定，右側(cè)海馬組織液氮速凍后轉(zhuǎn)于-80℃ 冰箱保存待用。其余小鼠(每組16只)造模后2周采用曠場實驗和跳臺實驗對小鼠進行行為學(xué)實驗，實驗完畢后處死小鼠。本研究中動物處置方法符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

4.曠場實驗：取一個長50cm×50cm×50cm的曠場，箱底劃分為25個方格，造模后2周將小鼠(n=16)放入曠場中心方格內(nèi)，在曠場上方安置攝像機，記錄5min內(nèi)小鼠跨格數(shù)和站立次數(shù)。每次實驗后清理小鼠留在曠場中的糞便。共進行為期2天的測試，第1天為訓(xùn)練期，第2天為試驗期。由于動物對于再次進入同一個熟悉場景具有適應(yīng)性的特性，該測試對跨格數(shù)和站立次數(shù)的統(tǒng)計分析主要用來評估訓(xùn)練期的運動表現(xiàn)和試驗期的非空間學(xué)習(xí)記憶能力。

5.跳臺實驗：造模后2周進行為期2天的跳臺實驗(n=16)，訓(xùn)練期將小鼠放入跳臺反射箱，適應(yīng)3min后將其移上安全臺，然后底部電柵欄通電，小鼠被電擊2s后取出，并記錄其從平臺跳下來的時間，訓(xùn)練期內(nèi)如果該動物未跳下平臺則棄之不用。試驗期(24h后)將動物再次放在平臺上，觀察3min，記錄小鼠從平臺跳下所需的時間，即跳臺潛伏期。如果動物跳下平臺時受到電擊，再次放置于平臺后動物可形成記憶而不跳下平臺，跳臺潛伏期常被用來作為評價學(xué)習(xí)記憶能力的重要指標(biāo)。

6.蘇木精-伊紅(hemotoxylin and eosin，HE)染色觀察皮質(zhì)病理改變： 造模24h后分離大腦組織(n=5)，取左側(cè)大腦海馬切面經(jīng)40g/L多聚甲醛固定后，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋，海馬組織切片后行HE染色，正置顯微鏡下采集數(shù)據(jù)并拍照。

7.海馬線粒體ROS、MDA、SOD檢測：造模24h后取右側(cè)海馬組織(n=5)，按先前方法提取線粒體，裂解液重懸后BCA法測定蛋白水平后備用[11]。將線粒體懸液稀釋至蛋白質(zhì)量濃度為1mg/ml，取50μl線粒體懸液加入反應(yīng)液，酶標(biāo)儀行定量檢測，按相應(yīng)的說明書步驟操作，酶標(biāo)儀讀取吸光度值，按公式計算出數(shù)值后分別除以相應(yīng)蛋白濃度即得各樣本ROS、MDA、SOD水平。

8.海馬Bcl-2、Bax、cyt-c、cleaved caspase-3蛋白表達的檢測: 造模24h后取右側(cè)海馬組織(n=5)，提取海馬總蛋白制備上樣樣品，聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將蛋白電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1h。相繼孵育相應(yīng)的一抗和二抗之后，經(jīng)Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)掃描獲得圖像。

結(jié) 果

1.各組小鼠行為學(xué)特征：造模后2周采用曠場實驗(n=16)和跳臺實驗(n=16)對4組小鼠進行行為學(xué)實驗。在曠場實驗中，跨格數(shù)和站立次數(shù)的統(tǒng)計用來反應(yīng)動物開發(fā)新環(huán)境的運動能力。訓(xùn)練期各組小鼠間的跨格數(shù)和站立次數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與訓(xùn)練期比較，試驗期CON組和APN組跨格數(shù)和站立次數(shù)顯著減少(P<0.01)，表明小鼠具有良好的記憶能力。與訓(xùn)練期比較，LPS組小鼠跨格數(shù)和站立次數(shù)并未有明顯改變，脂聯(lián)素干預(yù)(LPS+APN組)后，小鼠跨格數(shù)和站立次數(shù)減少(P<0.01)。在跳臺實驗中，訓(xùn)練期各組小鼠從跳臺跳下來的時間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與訓(xùn)練期比較，試驗期CON組和APN組跳臺潛伏期顯著延長(P<0.01)，同樣表明小鼠具有良好的記憶能力。在試驗期，與CON組比較，LPS組跳臺潛伏期延遲顯著降低，提示記憶受損(P<0.01)；與LPS組比較，脂聯(lián)素干預(yù)(LPS+APN)組可顯著延長潛伏期(P<0.05)，詳見圖1。

圖1 4組小鼠曠場實驗和跳臺實驗行為學(xué)特征(n=16)A.曠場實驗；B.跳臺實驗；與訓(xùn)練期比較，#P<0.01

2.各組小鼠海馬形態(tài)學(xué)改變：選取海馬CA1區(qū)進行形態(tài)學(xué)觀察,CON組和APN組小鼠神經(jīng)細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰，細胞排列規(guī)則致密，神經(jīng)元胞質(zhì)豐富，胞核大而圓，核仁清楚(圖2中A、B)；LPS組可見細胞結(jié)構(gòu)不清，神經(jīng)元數(shù)量減少，神經(jīng)元空泡樣改變，核固縮、深染(圖2C)；與LPS組比較，LPS+APN組多數(shù)細胞結(jié)構(gòu)清晰，神經(jīng)元數(shù)量明顯增多，發(fā)生空泡樣變、核固縮以及深染的神經(jīng)元減少(圖2D)。

圖2 4組小鼠海馬形態(tài)學(xué)改變(n=5，HE染色，×400)A.CON組；B.APN組；C.LPS組；D.LPS+APN組

3.各組小鼠海馬氧化損傷情況：與CON組比較，LPS組小鼠海馬線粒體ROS和MDA水平升高，SOD活力下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(ROS：P<0.05；MDA：P<0.01；SOD：P=0.000)；與LPS組比較，LPS+APN組線粒體ROS和MDA水平下降，SOD活力增強，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(ROS：P<0.05；MDA：P<0.05；SOD：P=0.000)，詳見表1。

表1 4組小鼠海馬線粒體ROS、MDA和SOD表達情況

與CON組比較，*P<0.05，**P<0.01,***P=0.000;與LPS組比較，#P<0.05,##P=0.000

4.各組小鼠海馬凋亡相關(guān)蛋白的表達情況：造模24h后取右側(cè)海馬組織檢測凋亡相關(guān)蛋白表達，與CON組比較，LPS組小鼠海馬Bcl-2表達下降(P=0.000)，Bax和cleaved caspase-3表達升高(Bax：P=0.000；cleaved caspase-3：P<0.01)；與LPS組比較，LPS+APN組小鼠海馬Bcl-2表達升高(P=0.000)，Bax和cleaved caspase-3表達下降(Bax：P<0.01；cleaved caspase-3：P<0.01)，詳見圖3和表2。

討 論

脂聯(lián)素是良好的胰島素增敏劑，抗炎調(diào)節(jié)劑和抗動脈粥樣硬化分子，脂聯(lián)素缺乏增加促炎性細胞因子表達，放大肥胖和膿毒癥中促炎表型，補充脂聯(lián)素后通過調(diào)控氧化/硝化應(yīng)激反應(yīng)減輕LPS所致膿毒癥炎癥性肺損傷和心肌損傷程度等，其可能成為改善膿毒癥相關(guān)臟器功能損傷以及預(yù)后的潛在治療靶點或藥物[12,13]。SAE發(fā)生率高，治療難度大，然而其病理生理機制尚不十分明確且未有突破性進展[5，14，15]。目前已經(jīng)公認腹腔注射LPS能夠普遍引起腦損傷，本研究采用腹腔注射LPS制備膿毒癥模型，探索脂聯(lián)素對膿毒癥腦損傷的作用及機制。結(jié)果顯示LPS組和LPS+APN組小鼠HE染色見空泡樣變、核固縮以及深染等病理改變，提示LPS可引起膿毒癥小鼠腦組織損傷。與LPS組比較，LPS+APN組空泡樣變、核固縮以及深染等病理改變有所減輕，且使用脂聯(lián)素干預(yù)后LPS+APN組小鼠在曠場和跳臺實驗中表現(xiàn)出的學(xué)習(xí)記憶能力有所改善，表明脂聯(lián)素對膿毒癥小鼠腦組織損傷具有一定的保護作用。

圖3 4組小鼠海馬內(nèi)Bcl-2、cleaved caspase-3和Bax蛋白表達

表2 各組細胞中Bcl-2、cleaved caspase-3和Bax蛋白表達

與CON組比較，*P<0.05，**P<0.01,***P=0.000;與LPS組比較，#P<0.01,##P=0.000

已有研究表明ROS生成增多、氧化應(yīng)激和細胞凋亡等與SAE的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[9,16]。線粒體作為細胞的能量工廠，不僅參與細胞能量供應(yīng)、鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)、氧化應(yīng)激、凋亡等生理過程，更為重要的是，匯聚于線粒體的各種細胞信號通路以及線粒體釋放的各種關(guān)鍵因子，是決定細胞存活的最終通路[17]。脂聯(lián)素通過脂聯(lián)素受體1誘導(dǎo)細胞外Ca2+內(nèi)流、激活Ca2+/CaMKKβ、AMPK和SIRT1和減少PGC-1α乙?；?，最終引起肌細胞線粒體數(shù)量增加，這些研究結(jié)果提示脂聯(lián)素在改善線粒體功能方面具有重要作用[8]。本研究結(jié)果顯示，膿毒癥小鼠海馬線粒體中ROS和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA生成增多，而抗氧化酶SOD活力下降，提示膿毒癥腦組織損傷發(fā)生時線粒體氧化應(yīng)激明顯增強。APN干預(yù)后，海馬線粒體中ROS和MDA水平降低，而SOD活力增強，說明脂聯(lián)素可減少膿毒癥小鼠海馬線粒體氧化應(yīng)激，從而發(fā)揮抗氧化保護作用。

線粒體是過量ROS產(chǎn)生后的主要促凋亡靶點，ROS大量產(chǎn)生引起線粒體膜脂質(zhì)過氧化、線粒體膜上蛋白質(zhì)和線粒體DNA氧化損傷，隨后線粒體膜通透性增加和線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放使Ca2+、Cyt-c、凋亡誘導(dǎo)因子AIF等大量釋放，激活pro-caspase-9進而觸發(fā)caspases級聯(lián)效應(yīng)引起細胞凋亡[18]。過量的活性氧也可使線粒體電子傳遞鏈解偶聯(lián)，下調(diào)ATP產(chǎn)生水平，上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達水平，最后使線粒體外膜破裂，導(dǎo)致細胞凋亡[19，20]。在本研究中，膿毒癥小鼠海馬凋亡細胞明顯增多，且Bcl-2表達減少，而Bax和cleaved caspase-3表達增加，提示膿毒癥腦損傷發(fā)生與線粒體凋亡通路激活有關(guān)，這與先前的其他研究結(jié)果一致[21,22]。雖然目前有相當(dāng)多的證據(jù)表明脂聯(lián)素及其受體在大腦中廣泛表達，只有少數(shù)研究關(guān)注了脂聯(lián)素在腦功能紊亂中的作用以及修飾脂聯(lián)素信號通路的藥物的治療潛力，它們在腦疾病中的確切作用仍不十分清楚。本研究發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素干預(yù)后，Bcl-2表達上調(diào)，而Bax和cleaved caspase-3表達減少，提示脂聯(lián)素可通過抑制線粒體促凋亡通路激活在膿毒癥腦損傷中發(fā)揮抗凋亡作用。

綜上所述，本研究顯示線粒體功能障礙和線粒體促凋亡通路激活可能參與了膿毒癥腦損傷的發(fā)病過程，而脂聯(lián)素則通過減少膿毒癥小鼠海馬線粒體氧化應(yīng)激抑制線粒體促凋亡通路激活，從而在膿毒癥腦損傷中發(fā)揮保護作用，為臨床運用脂聯(lián)素治療SAE提供了實驗依據(jù)。本研究只針對脂聯(lián)素進行了探討，而海馬脂聯(lián)素受體及其參與脂聯(lián)素作用的具體分子機制仍不明確，有待于進一步研究。