TAK1/NF-κB在小鼠心肌肥厚中的變化及意義

周 恒 唐其柱 沈滌非 嚴(yán) 玲 卞洲艷 袁 園

心肌肥厚是心臟負(fù)荷增加或遭受損傷時的一種代償性反應(yīng)，雖然在早期可以減輕心室壁壓力和維持心排出量，但長期持續(xù)的心肌肥厚會發(fā)展為失代償，導(dǎo)致心室功能障礙，最終發(fā)生心力衰竭[1]。壓力負(fù)荷是心肌肥厚最常見的原因之一，高血壓、主動脈瓣狹窄等疾病均會導(dǎo)致左心室壓力負(fù)荷的升高，促進(jìn)心肌肥厚發(fā)生。心肌肥厚涉及心肌細(xì)胞增大和功能障礙、間質(zhì)纖維化等多種病理生理反應(yīng)，參與心肌肥厚的分子機(jī)制也非常復(fù)雜，目前尚未完全闡明。雖然針對神經(jīng)體液機(jī)制的治療能夠在一定程度上改善心肌肥厚，但是仍有相當(dāng)數(shù)量的心肌肥厚與心力衰竭患者療效不佳[2]。探索心肌肥厚的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，尋找潛在的防治靶點(diǎn)，對于減少高血壓等心血管疾病的并發(fā)癥、遏制心力衰竭的發(fā)展具有重要意義。

近年來研究顯示，炎性反應(yīng)與心肌肥厚及心力衰竭關(guān)系密切，可能成為調(diào)節(jié)心肌肥厚進(jìn)程的新靶點(diǎn)[3]。轉(zhuǎn)化生長因子活化激酶1(transforming growth factor-β activated kinase 1, TAK1)是促炎細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵分子，能夠激活下游的核因子(nuclear factor, NF)-κB，促進(jìn)炎性細(xì)胞因子釋放，介導(dǎo)炎性反應(yīng)發(fā)生[4]。然而，TAK1在心肌肥厚中的作用尚不明確。本研究擬通過胸主動脈縮窄術(shù)(aortic banding, AB)建立壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚模型，檢測心肌組織中TAK1/NF-κB與炎性反應(yīng)水平，以探索TAK1/NF-κB介導(dǎo)的炎性反應(yīng)在心肌肥厚中的作用，為防治心肌肥厚與心力衰竭提供新的潛在分子靶點(diǎn)。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動物：以8～10周齡、體質(zhì)量23.5～27.5g的雄性野生型C57BL/6J小鼠為研究對象。小鼠飼養(yǎng)于SPF級動物中心的獨(dú)立送回風(fēng)凈化籠具(IVC)中，飲用水經(jīng)高壓處理，飼料經(jīng)60Co照射滅菌。系統(tǒng)溫度維持于22～24℃，濕度為50%～60%， 12h明暗交替。小鼠隨機(jī)分為兩組：假手術(shù)對照(Sham)組與心肌肥厚模型(AB)組。

2.心肌肥厚模型的建立：采用胸主動脈縮窄術(shù)建立小鼠心肌肥厚模型。腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，沿第2～3肋間水平切開皮膚，分離肌肉及軟組織，游離胸主動脈，以7-0手術(shù)縫線橫穿主動脈下方，將去尖的26G(小鼠體質(zhì)量25.0～27.5g)或27G(小鼠體質(zhì)量23.5～25.0g)注射器針頭平行放置于血管上方，針頭連同主動脈一起結(jié)扎，隨后立即抽出針頭，使用超聲多普勒檢測評估主動脈狹窄程度，以確定手術(shù)造成了主動脈約70%狹窄[5]。對照組在分離出主動脈后，只掛線不結(jié)扎，其余手術(shù)步驟與AB組相同。術(shù)后8周進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測。

3.超聲心動圖：異氟烷(1.5%～2.0%)持續(xù)吸入麻醉，麻醉狀態(tài)穩(wěn)定后，小鼠左側(cè)臥位，采用高頻超聲診斷儀，頻率為15MHz。取胸骨旁左心室乳頭肌水平短軸切面，測量舒張期室間隔厚度(IVSD)、舒張期左心室后壁厚度(LVPWD)、左心室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)以及短軸縮短率(FS)等指標(biāo)。

4.心臟取材：稱量小鼠體質(zhì)量，采用頸椎脫臼法處死小鼠，立即取出心臟，稱量心臟質(zhì)量。取材完成后半數(shù)心臟放至-80℃冰箱保存，用于Western blot法與RT-PCR法檢測。其余心臟放入4%甲醛溶液中固定，用于病理學(xué)與免疫熒光檢測。

5.病理學(xué)檢測：將固定后的小鼠心臟橫切，進(jìn)行脫水、透明、浸蠟，包埋入石蠟塊。制備出4～5μm厚的組織切片，進(jìn)行常規(guī)HE與天狼猩紅染色，顯微鏡下觀察、拍照。使用圖像分析軟件(Image Pro-Plus 6.0)計(jì)算心肌細(xì)胞橫截面積與心肌組織膠原容積分?jǐn)?shù)。

6.免疫熒光：組織切片采用檸檬酸鹽高壓修復(fù)法進(jìn)行抗原修復(fù)，10%羊血清37℃孵育60min進(jìn)行封閉。CD68一抗4℃孵育過夜，綠色熒光標(biāo)記的二抗?jié)窈兄?7℃孵育60min。滴加含有DAPI的封片劑封片，放置5min左右后，在熒光顯微鏡下觀察、拍照。拍照時在同一視野下分別拍攝綠色激發(fā)熒光與藍(lán)色激發(fā)熒光兩張圖片，并使用Image-pro plus 6.0軟件合成，計(jì)算各組CD68陽性細(xì)胞數(shù)。

7.實(shí)時定量RT-PCR法：TRIzol提取心肌組織總RNA，分光光度法檢測RNA純度及濃度。每個樣本取2μg總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(20μl反應(yīng)體系)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。得到的cDNA以LightCycler 480 SYBR Green 1 Master Mix反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增：95℃變性10min，隨后95℃ 15s進(jìn)行40個循環(huán)，GAPDH作為內(nèi)參。

8.Western blot法：使用RIPA裂解液研磨心肌組織，BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE進(jìn)行分離，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，于封閉液中封閉2h。繼以待測蛋白的一抗4℃孵育過夜，熒光標(biāo)記的二抗室溫孵育1h，置于雙通道熒光掃描儀中掃膜，計(jì)算機(jī)分析結(jié)果。

結(jié) 果

1.超聲心動圖與心臟質(zhì)量：AB術(shù)后8周的模型組小鼠左心室室壁厚度與室腔大小明顯增加，而短軸縮短率明顯下降，出現(xiàn)了明顯的左心室結(jié)構(gòu)異常與心功能障礙(表1)。心肌肥厚模型組小鼠心臟質(zhì)量/體質(zhì)量(HW/BW, mg/g)較對照組明顯增加(4.07±0.12mg/g vs 8.07±0.45mg/g,P<0.05)。

表1 兩組小鼠超聲心動圖檢測結(jié)果

與Sham組比較，*P<0.05

2.病理學(xué)檢測結(jié)果：HE染色顯示，模型組小鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，橫截面積較對照組明顯增大，出現(xiàn)了明顯的心肌肥厚(圖1)。PSR染色顯示，模型組小鼠組織間隙染為紅色的膠原成分明顯增多，心肌組織膠原沉積、纖維化(圖2)。

圖1 心肌組織HE染色結(jié)果(×400)A.Sham組；B.AB組

圖2 心肌組織PSR染色結(jié)果(×400)A.Sham組；B.AB組

3.肥厚心肌組織中炎性反應(yīng)增加：通過CD68免疫熒光標(biāo)記單核-吞噬細(xì)胞，檢測心肌組織炎性浸潤情況。心肌肥厚模型組小鼠心肌組織中CD68陽性細(xì)胞數(shù)明顯多于對照組(圖3)。此外，RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，心肌組織腫瘤壞死因子-α(TNF-α)與白介素-1β(IL-1β)等炎性反應(yīng)標(biāo)志物的mRNA表達(dá)水平在模型組中明顯升高(圖4)。

圖3 心肌組織CD68免疫熒光檢測(×400)

4.肥厚心肌組織中TAK1/NF-κB通路激活：Western blot法檢測結(jié)果顯示，心肌肥厚模型組小鼠心肌組織中TAK1、κB抑制蛋白激酶β(IKKβ)與κB抑制蛋白α(IκBα)的磷酸化水平較對照組明顯上調(diào)，IκBα總蛋白水平降低，NF-κB p65磷酸化水平增加，TAK1/NF-κB信號通路的激活(圖5)。

圖4 心肌組織炎性反應(yīng)標(biāo)志物表達(dá)結(jié)果A.TNF-α；B.IL-1β

圖5 肥厚心肌組織中TAK1/NF-κB信號通路的激活

討 論

心肌肥厚是心力衰竭的關(guān)鍵性臨床階段，是多種心血管疾病向心力衰竭發(fā)展的共有病理生理過程，涉及心肌細(xì)胞增大、排列紊亂和功能障礙、間質(zhì)纖維化等多種病理改變。本研究通過主動脈縮窄術(shù)成功建立了壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚模型，并使用超聲心動圖、HE與PSR染色進(jìn)行評估，在術(shù)后8周觀察了模型組小鼠心肌肥厚、室腔擴(kuò)大、心功能不全以及各種病理學(xué)表現(xiàn)。

然而，參與心肌肥厚的分子機(jī)制非常復(fù)雜，迄今尚未完全闡明。近年來，炎性反應(yīng)及其相關(guān)信號通路在心肌肥厚中的作用逐漸受到重視。臨床研究顯示，左心室肥厚患者體內(nèi)存在系統(tǒng)性炎性反應(yīng)，其血清中的炎性反應(yīng)標(biāo)志物 CRP 以及促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β與IL-6的表達(dá)均明顯升高[6]。另外，心肌組織中包括心肌細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞能夠分泌炎性細(xì)胞因子，并表達(dá)炎性細(xì)胞因子受體；心臟既是炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生的場所，也是其作用的靶器官[7]。因此，炎性反應(yīng)不僅僅是心肌肥厚與心力衰竭的標(biāo)志物與預(yù)后指標(biāo)，同時參與了心肌肥厚的進(jìn)程，與心肌細(xì)胞肥大與心肌間質(zhì)纖維化等病理過程密切相關(guān)[8]。本研究顯示，心肌肥厚模型組小鼠心肌組織中CD68陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多，TNF-α與IL-1β等炎性反應(yīng)標(biāo)志物的mRNA表達(dá)水平也明顯升高，提示心肌出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤與促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。

NF-κB是調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞生長、增殖、凋亡和細(xì)胞外基質(zhì)重塑等多種病理生理過程中也發(fā)揮重要作用[9]。NF-κB二聚體(經(jīng)典組合為p65和p50)通過與NF-κB抑制劑(IκBs)結(jié)合而失活，IκBs在靜息狀態(tài)的細(xì)胞胞質(zhì)維持NF-κB的穩(wěn)定[10]。而在應(yīng)激情況下，IκBs可被IκB激酶(IKKs，如IKKβ)磷酸化，導(dǎo)致IκBs的泛素化并降解，解除IκBs對NF-κB的抑制，進(jìn)而引起NF-κB的釋放和活化[11]。已有研究發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞中，NF-κB可被多種肥厚刺激物激活，包括血管緊張素Ⅱ、苯腎上腺素和內(nèi)皮素-1[12]。本研究結(jié)果顯示，AB組IKKβ與IκBα的磷酸化水平較對照組明顯上調(diào)，IκBα總蛋白水平降低，NF-κB p65磷酸化水平增加，進(jìn)一步證實(shí)NF-κB信號通路可在壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚中激活。

但是，NF-κB在心肌肥厚中的作用尚存爭議。過表達(dá)NF-κB會促進(jìn)肥厚刺激引起的心房利鈉肽的表達(dá)和心肌細(xì)胞的增大，而超抑制型IκBα突變體或顯性負(fù)性IKKβ突變體的表達(dá)會抑制NF-κB并減輕這些肥厚[12]。小鼠心臟特異性p65缺失可緩解壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚，改善病理性心肌重構(gòu)，增強(qiáng)心臟收縮功能[13]。以sh-p65 RNA轉(zhuǎn)染心臟，抑制NF-κB，可減輕Myo轉(zhuǎn)基因小鼠的自發(fā)性心肌肥厚[14]。這些發(fā)現(xiàn)提示NF-κB具有促進(jìn)心肌肥厚的作用，然而，也有一些研究存在相反的結(jié)果。Hikoso等[15]報道，心臟特異性敲除IKKβ會降低NF-κB活性，但卻加重了壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚、心室擴(kuò)張以及心功能障礙。NF-κB必須調(diào)節(jié)蛋白(NF-κB-essential modulator, NEMO)是IKK復(fù)合物的調(diào)節(jié)亞基，通過其心臟特異性缺失可抑制NF-κB通路，并促進(jìn)壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚與心力衰竭[16]。這些結(jié)果則提示NF-κB通路對心肌肥厚也具有保護(hù)作用。NF-κB在心肌肥厚中作用不一致的原因可能是由于模型構(gòu)建的不同、實(shí)驗(yàn)環(huán)境的不同、NF-κB作用靶點(diǎn)的多樣性以及NF-κB上游調(diào)控分子的多樣性所導(dǎo)致的。

TAK1是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，能夠被轉(zhuǎn)化生長因子-β、Toll樣受體、NOD樣受體等多種因素激活，是NF-κB信號通路關(guān)鍵的上游調(diào)節(jié)因子[17]。TAK1可以使IKK磷酸化，激活I(lǐng)KK復(fù)合物，促進(jìn)IκB的磷酸化與降解，致使NF-κB的游離及活化入核，誘導(dǎo)TNF-α等促炎性細(xì)胞因子表達(dá)[18,19]。但是，心肌肥厚過程中TAK1的作用及其與NF-κB和炎性反應(yīng)的關(guān)系，尚不明確。本研究在心肌肥厚小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，TAK1的磷酸化水平較對照組明顯增加，與NF-κB p65的變化趨勢一致，同時伴有心肌組織炎性浸潤，提示TAK1可能作為上游分子激活NF-κB以及炎性反應(yīng)，并參與心肌肥厚的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，本研究在壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的小鼠心肌肥厚模型中，發(fā)現(xiàn)了TAK1/NF-κB通路的激活與心肌組織炎性浸潤，提示TAK1/NF-κB及其介導(dǎo)的炎性反應(yīng)參與了心肌肥厚的發(fā)生、發(fā)展，為探索心肌肥厚的分子機(jī)制與尋找潛在的防治靶點(diǎn)提供了一定的理論基礎(chǔ)。