柔肝通絡(luò)湯對(duì)MCAO大鼠內(nèi)源性干細(xì)胞表達(dá)的影響?

及曉夢(mèng) 龍華君 劉 雨 張珊珊 帥文昊 楊 穎 伍大華

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；2.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，湖南 長沙410006）

缺血性腦血管病（ICD）約占全部腦血管疾病的60%～80%[1]。缺血性中風(fēng)后阻礙腦組織血液供應(yīng)情況，神經(jīng)元因缺血缺氧發(fā)生炎癥水腫、變性以致壞死，最終導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)信息傳遞功能、整合功能受到破壞甚至缺失。內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）主要分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少量少突膠質(zhì)細(xì)胞，具有高度增殖、自我更新以維持自身數(shù)目恒定的能力，在神經(jīng)發(fā)育和修復(fù)受損神經(jīng)中發(fā)揮重要的作用[2-3]，被認(rèn)為是修復(fù)損傷的基礎(chǔ)[4]?，F(xiàn)已證明，在成年哺乳動(dòng)物中，嗅球、大腦皮質(zhì)、紋狀體、海馬齒狀回、室管膜下區(qū)、側(cè)腦室下區(qū)、脊髓、視網(wǎng)膜等部位均存在NSCs[5-6]。各項(xiàng)研究表明，成年人大腦內(nèi)NSCs保持靜止?fàn)顟B(tài)[7]，在缺血性中風(fēng)等急性損傷因素的影響下，機(jī)體自身的NSCs可被激活，并在多種細(xì)胞因子、基因的調(diào)控下發(fā)生增殖、分化等，進(jìn)而遷移至神經(jīng)受損區(qū)域，替換損傷壞死的神經(jīng)元，發(fā)揮其代償和修復(fù)功能[8-9]。

柔肝通絡(luò)湯是湖南省名老中醫(yī)周慎教授通過總結(jié)數(shù)十年的臨床經(jīng)驗(yàn)，所創(chuàng)制的治療中風(fēng)的經(jīng)驗(yàn)方。臨床證明該方具有改善中風(fēng)患者神經(jīng)功能、減少后遺癥，降低致殘率、改善生活質(zhì)量等作用[10]。故本實(shí)驗(yàn)擬通過大腦中動(dòng)脈阻塞（MCAO）所致缺血再灌注模型，檢測(cè)各組各時(shí)間點(diǎn)內(nèi)大鼠腦組織BrdU、BrdU/NeuN、Br?dU/GFAP陽性細(xì)胞數(shù)，觀察柔肝通絡(luò)湯對(duì)缺血性腦損傷大鼠內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化的影響，探討其治療腦卒中的潛在作用途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 120只健康SD雄性大鼠，體質(zhì)量250～300 g，鼠齡為8周，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SYXK（湘）2015-0003。飼養(yǎng)于湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，室溫18～20℃，濕度65%～70%，自由飲水進(jìn)食。適應(yīng)性進(jìn)食1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 試藥與儀器 柔肝通絡(luò)湯組方：制首烏15 g，桑椹15 g，枸杞子30 g，丹參30 g，葛根30 g，當(dāng)歸尾10 g，赤芍10 g，地龍10 g，山楂10 g。藥材均購自湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，熬制成膏狀（含生藥2 g/mL）備用。10%水合氯醛、4%多聚甲醛、5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU粉末）（武漢BOSTER公司）、Anti-BrdU Mouse mAb、Anti-GFAP Rabbit pAb、Anti-NeuN Rabbit pAb、CY3標(biāo)記驢抗兔IgG、Alexa488標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（武漢Servicebio公司）。RM2016病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司）、YD-A組織攤片機(jī)（浙江省金華市益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司）、NIKON ECLIPSE TI-SR倒置熒光顯微鏡（日本尼康）、TYXH-II渦旋混合器（天悅電子）。

1.3 分組與給藥 120只大鼠隨機(jī)進(jìn)行編號(hào)并分成4組，即空白組、假手術(shù)組、模型組、柔肝通絡(luò)湯組，根據(jù)缺血2 h再灌注后6 h、1 d、3 d、7 d、14 d分為5個(gè)亞組。各組大鼠數(shù)量均為6只。柔肝通絡(luò)湯組予柔肝通絡(luò)湯（2.8 g/100 g生藥含量[11]），其藥物劑量按大鼠14 mL/kg灌胃量用蒸餾水配制（當(dāng)于50 kg成年人等效計(jì)量的2倍），分別按照5個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每日2次灌胃直至大鼠處死。其余組用1.4 mL/100 g蒸餾水灌胃，不添加任何藥物。BrdU注射：將BrdU按照50 mg/kg的劑量，10 mg/mL的質(zhì)量濃度溶于0.9%氯化鈉注射液中，每天腹腔注射2次，其中3 d組、7 d組及14 d組于手術(shù)后連續(xù)注射3 d，而6 h組、1 d組均在處死前3 d注射。

1.4 模型制備 手術(shù)前24 h禁食、不禁水。采用改良Longa法[12]制作大鼠MCAO模型。用10%水合氯醛（0.30 mL/100 g）腹腔注射麻醉大鼠并將其固定在操作臺(tái)上。切開頸部正中部皮膚，依次剝離出右頸總動(dòng)脈（CCA）、頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA）、頸外動(dòng)脈（ECA）。用線結(jié)扎右頸總動(dòng)脈（CCA）近心端和頸外動(dòng)脈（ECA），動(dòng)脈夾夾住頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA），在動(dòng)脈夾和頸總動(dòng)脈近心端結(jié)扎之間用眼科剪剪一“V”型小口，將線栓從CCA小口中插入，在分叉處沿著ICA方向向顱腦內(nèi)上方走行，直至遇到阻力為止。當(dāng)線栓插入深度約（18.5±0.5）mm時(shí)，說明線栓到達(dá)大腦前動(dòng)脈，并成功阻斷大腦中動(dòng)脈。然后扎緊CCA處備線，記錄大腦中動(dòng)脈阻斷時(shí)間，消毒并縫合皮膚，外留10 mm線栓。于術(shù)后2 h輕輕拔出栓線約10 mm，即再灌注模型形成。術(shù)中溫度始終保持在27℃左右，100 W白熾燈照明維持肛溫37～38℃。假手術(shù)組大鼠術(shù)中操作同上述過程，線栓只插入10 mm左右，此深度不足以阻斷大腦中動(dòng)脈。大鼠蘇醒后，按照缺血再灌注5個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)，采用Longa[12]神經(jīng)功能缺損評(píng)分法進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分1～3分為造模成功。

1.5 神經(jīng)功能缺損評(píng)分 以再灌注6 h、1 d、3 d、7 d、14 d這5個(gè)時(shí)間點(diǎn)，按照Longa[12]神經(jīng)功能缺損評(píng)分法進(jìn)行評(píng)分。0分：無神經(jīng)損傷癥狀。1分：不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪。2分：向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈。3分：向?qū)?cè)傾倒。4分：不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。大鼠評(píng)分越高代表神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。0分和4分模型不符合實(shí)驗(yàn)要求予以剔除。

1.6 標(biāo)本采集與檢測(cè) 造模缺血2 h后，按再灌注6 h、1 d、3 d、7 d、14 d時(shí)間點(diǎn)取腦。步驟如下：用10%的水合氧醛（0.30 mL/l00 g）腹腔注射大鼠深度麻醉后將其固定在桌面，開胸，游離出心臟。用止血鉗夾住大鼠腹主動(dòng)脈及下腔靜脈，經(jīng)左心室插入灌流針并固定，切開右心耳，灌注0.9%氯化鈉注射直到大鼠肝肺兩臟和四肢變白，右心房流出澄清液體，需立即改換灌注4%多聚甲醛PBS 100 mL。斷頭取腦，將標(biāo)本放置多聚甲醛中浸泡固定24 h后備用。采用免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)BrdU、BrdU/NeuN、BrdU/GFAP免疫陽性細(xì)胞。石蠟切片脫蠟至水，置于抗原修復(fù)液（pH9.0）中。PBS洗滌3次，每次5 min。加用3%BSA室溫封閉30 min。滴加鼠兔一抗，Anti-BrdU（1∶200稀釋）、Anti-GFAP（1∶500稀釋）、Anti-NeuN（1∶100稀釋），置于4℃濕盒內(nèi)孵育過夜。加熒光二抗Cy3驢抗兔IgG（1∶300稀釋）、Alexa488標(biāo)記山羊抗小鼠IgG，避光室溫孵育50 min。滴加DAPI染液，避光室溫孵化10 min。加入抗熒光淬滅封片劑封片。倒置熒光顯微鏡下觀察，每張切片選取5個(gè)400倍高倍鏡視野并采集圖像。采用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)軟件（Image-pro plus6.0）計(jì)數(shù)腦缺血再灌注損傷后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)大腦皮質(zhì)缺血區(qū)域BrdU、BrdU/NeuN、BrdU/GFAP陽性細(xì)胞。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS24.0進(jìn)行分析，所有計(jì)量資料以（±s）進(jìn)行描述，采用多組間單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni法檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況 大鼠腦缺血再灌注后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的活動(dòng)較空白組和假手術(shù)組減少，體質(zhì)量減輕，飲食減少。假手術(shù)組術(shù)中及術(shù)后死亡2只，替補(bǔ)2只；模型組死亡5只，失敗4只，替補(bǔ)9只；柔肝通絡(luò)湯組死亡6只，失敗3只，替補(bǔ)9只。

2.2 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較 見表1。空白組和假手術(shù)組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分均為0分。與空白組和假手術(shù)組比較，造模后大鼠6 h、1 d、3 d、7 d、14 d的神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，柔肝通絡(luò)湯大鼠6 h、1 d神經(jīng)功能缺損評(píng)分無顯著差異（P＞0.05），3 d、7 d、14 d的神經(jīng)功能缺損評(píng)分較模型組降低（P＜0.05）。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)肢體神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較（分，±s）

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)肢體神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較（分，±s）

與同時(shí)間點(diǎn)的模型組比較，?P＜0.05；與空白組、假手術(shù)組同時(shí)間點(diǎn)比較，△P＜0.01

組別空白組假手術(shù)組模型組柔肝通絡(luò)湯組n 6 6 6 6 6 h 1 d 3 d 7 d 14 d 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3.000±0.000△2.667±0.817△2.833±0.408△2.667±0.516△2.333±0.516△1.333±0.516△2.167±0.408△1.167±0.408△2.000±0.632△1.000±0.000△

2.3 各組大鼠大腦皮質(zhì)缺血區(qū)Brdu、Brdu/Neun、Brdu/GFAP鏡下表達(dá)比較 BrdU陽性細(xì)胞呈紅色（圖中顯示白色），代表增殖細(xì)胞，綠色（圖中顯示暗灰色）代表神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞，BrdU/NeuN、BrdU/GFAP雙標(biāo)陽性細(xì)胞均顯示呈橘紅色（圖中顯示淺灰色），代表新生的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞。見圖1～圖3。

圖3 BrdU/GFAP陽性細(xì)胞表達(dá)（400倍）

2.4 各組大鼠BrdU單標(biāo)免疫陽性細(xì)胞數(shù)比較 見表2，圖1?？瞻捉M和假手術(shù)組在各時(shí)間點(diǎn)均可見一定量的BrdU陽性表達(dá)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組比較，柔肝通絡(luò)湯組大鼠在3、7、14 d的BrdU陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)增加（P＜0.05），尤以3、7 d更顯著（P＜0.01），在術(shù)后第7日BrdU陽性細(xì)胞數(shù)達(dá)到峰值，隨后呈下降趨勢(shì)，但仍高于模型組。

表2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)BrdU陽性細(xì)胞表達(dá)的影響比較（±s）

表2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)BrdU陽性細(xì)胞表達(dá)的影響比較（±s）

與同時(shí)間點(diǎn)空白組和假手術(shù)組比較，#P＜0.01；與同時(shí)間點(diǎn)的模型組比較，?P＜0.05；與本組術(shù)后其他時(shí)間點(diǎn)比較，△P＜0.01。下同

14 d 35.83±4.02 33.67±4.27 96.50±7.26#117.17±10.83#*組別空白組假手術(shù)組模型組柔肝通絡(luò)湯組n 6 6 6 6 6 h 34.33±4.27 34.67±1.97 36.83±4.40 39.17±4.54 1 d 35.17±2.40 35.83±4.02 55.17±6.77#65.67±12.80#3 d 33.33±2.16 34.50±6.34 74.00±9.10#94.17±9.47#*7 d 36.00±2.68 34.83±7.68 127.50±5.61#△141.17±6.91#*△

2.5 各組大鼠BrdU/NeuN雙標(biāo)免疫陽性細(xì)胞數(shù)比較見表3，圖2。各時(shí)間點(diǎn)空白組、假手術(shù)組大腦皮質(zhì)區(qū)均可見少量的BrdU/NeuN表達(dá)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組比較，柔肝通絡(luò)湯組在6 h、1 d的BrdU/NeuN免疫陽性細(xì)胞數(shù)均無顯著差異（P＞0.05），術(shù)后3、7、14 d的BrdU/NeuN免疫陽性細(xì)胞數(shù)均明顯增加（P＜0.05）。其中第3～7天增殖迅速，隨后增殖緩慢。

表3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)BrdU/NeuN陽性細(xì)胞表達(dá)比較（±s）

表3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)BrdU/NeuN陽性細(xì)胞表達(dá)比較（±s）

組別空白組假手術(shù)組模型組柔肝通絡(luò)湯組n 6 6 6 6 6 h 14.50±1.64 14.00±2.53 16.33±1.75 16.50±1.76 1 d 15.83±1.83 14.50±3.21 24.00±2.10#26.50±3.21#3 d 15.00±1.79 15.00±1.79 32.83±3.31#37.33±3.08#*7 d 15.67±3.20 14.17±2.14 43.67±2.58#△53.50±3.45#*△14 d 13.50±1.38 15.67±2.25 37.00±4.00#53.83±4.36#*

2.6 大鼠BrdU/GFAP雙標(biāo)免疫陽性細(xì)胞數(shù)比較 見表4，圖3。各時(shí)間點(diǎn)空白組、假手術(shù)組均可見少量BrdU/GFAP免疫陽性細(xì)胞表達(dá)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組比較，柔肝通絡(luò)湯組大鼠在術(shù)后1、3、7、14 d的BrdU/GFAP免疫陽性細(xì)胞數(shù)均減少（P＜0.05），但仍高于空白組和假手術(shù)組。

表4 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)BrdU/GFAP陽性細(xì)胞表達(dá)比較（±s）

表4 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)BrdU/GFAP陽性細(xì)胞表達(dá)比較（±s）

組別空白組假手術(shù)組模型組柔肝通絡(luò)湯組n 6 6 6 6 6 h 21.17±3.92 21.33±3.32 23.00±3.52 21.17±3.66 1 d 21.00±2.10 21.17±2.64 30.83±3.49#26.00±2.61#*3 d 21.17±2.14 20.83±1.83 41.17±3.49#32.67±1.63#*7 d 22.17±1.83 22.67±3.01 58.67±3.39#△40.83±2.86#*△14 d 20.83±1.72 20.67±2.66 46.50±3.94#27.83±2.86#*

3 討論

BrdU是一種胸腺嘧啶核苷類似物，NSCs發(fā)生分裂增殖時(shí)，它能夠代替胸腺嘧啶（T）滲入正在復(fù)制的DNA分子中，利用抗BrdU單克隆抗體，經(jīng)過ICC染色，顯示活性增殖細(xì)胞，用以標(biāo)記腦內(nèi)增殖細(xì)胞。既往研究證明，Brdu所標(biāo)記的陽性細(xì)胞中，具有自我更新和分化能力的NSCs占據(jù)90%，剩余10%是沒有分化能力的神經(jīng)祖母細(xì)胞[13]。所以采用BrdU標(biāo)記的陽性細(xì)胞可表達(dá)NSCs增殖情況。

NeuN是一種表達(dá)在大多數(shù)神經(jīng)元胞核和胞漿中的一種特異性蛋白質(zhì)，是新生神經(jīng)元的標(biāo)記物；GFAP是一種中間絲蛋白，主要存在于星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物[14]。神經(jīng)元具有聯(lián)絡(luò)和整合輸入信息并傳遞信息的作用，是構(gòu)成神經(jīng)系統(tǒng)最基本的結(jié)構(gòu)和功能單位[15]。研究證明，在發(fā)生急性損傷如缺血性中風(fēng)時(shí)，可以激活內(nèi)源性干細(xì)胞增殖分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少量少突膠質(zhì)細(xì)胞，分化的新神經(jīng)元能替代和修復(fù)受損的神經(jīng)元，從而改善神經(jīng)功能[16-17]。星形膠質(zhì)細(xì)胞是腦組織膠質(zhì)細(xì)胞中數(shù)量最多、具有重要功能的細(xì)胞。其不僅具有營養(yǎng)支持和保護(hù)神經(jīng)元的作用，同時(shí)在維持突觸周圍環(huán)境穩(wěn)態(tài)、參與信息傳遞等方面發(fā)揮功能[18]。但星形膠質(zhì)細(xì)胞在促進(jìn)神經(jīng)元再生方面具有“雙重”作用，在缺血早期，通過抑制炎癥因子的擴(kuò)散，促進(jìn)神經(jīng)再生，但在缺血后期，膠質(zhì)細(xì)胞大量增殖重疊，形成膠質(zhì)疤痕，形成不可逆性組織重構(gòu)，不僅影響正常局部神經(jīng)回路，還阻礙神經(jīng)再生[19]。

缺血性腦血管疾病在中醫(yī)學(xué)屬“中風(fēng)”范疇，本病起病急，變化快，臨床癥狀變化多端，多以突然神昏撲倒地、半身不遂、肢體麻木、口舌歪斜、言語不利，甚者神志不清等為主要表現(xiàn)。中風(fēng)病位在腦，其主要致病因素歸結(jié)于風(fēng)、火、痰、瘀、虛諸端，肝腎虧虛或氣血虧虛為其致病根本。周老認(rèn)為中風(fēng)之虛主要在于肝腎陰虛，中風(fēng)之實(shí)主要?dú)w于瘀血阻滯。方中制首烏為君藥，桑葚、枸杞二者同歸肝腎經(jīng)，為臣藥，協(xié)助均藥滋肝補(bǔ)腎陰、養(yǎng)血益精。赤芍、丹參、當(dāng)歸尾、葛根、地龍、山楂均為佐藥，共通活血散瘀通絡(luò)，全方共奏滋補(bǔ)肝腎、育陰息風(fēng)、活血通絡(luò)之功效。研究表明，柔肝通絡(luò)湯經(jīng)過多年臨床療效觀察，柔肝通絡(luò)湯對(duì)于改善中風(fēng)患者肢體神經(jīng)功能有顯著療效[11]。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，說明柔肝通絡(luò)湯可以促進(jìn)缺血性腦損傷后內(nèi)源性干細(xì)胞的增殖分化為成熟神經(jīng)元，抑制膠質(zhì)細(xì)胞的過度增殖，從而促進(jìn)神經(jīng)再生。