Box-Behnken響應面法優(yōu)化虎杖苷的提取工藝及體外活性評價?

鄭燕飛 郭 瑩

（浙江中醫(yī)藥大學，浙江 杭州 310053）

虎杖（Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.）為蓼科植物虎杖的干燥根及根莖，味微苦、藥性平，歸肝、膽、肺經，虎杖藥用歷史悠久，入藥始見于《雷公炮炙論》[1]?；⒄溶眨≒olydatin，PD）是從虎杖的干燥根莖中提取的單體，它是虎杖的重要生物活性成分之一[2]?，F代研究表明，虎杖具有抗炎、抗病毒、抗菌、抗血栓、抗氧化等多種藥理作用[3]。本實驗采用乙醇提取虎杖中的虎杖苷，在單因素試驗基礎上考察影響虎杖苷得率的主要提取因素，通過響應面法優(yōu)化虎杖苷的提取工藝，并對虎杖提取物進行體外抗氧化和抑菌活性評估，以期為虎杖中活性成分的進一步研究奠定物質基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器

FA2104N電子分析天平：上海菁海儀器有限公司；TU-1900雙光束紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；RE-5298旋轉蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；Spectra Max M3酶標儀：美國MD公司；超凈工作臺：SW-CT-2G型，凈化儀器有限公司；手提式壓力蒸汽滅菌鍋：YXQ-LH-18SI型，北京迅博儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱：SBX-250B-Z型，博迅醫(yī)療設備有限公司。

1.2 材料

虎杖：浙江中醫(yī)藥大學中藥飲片有限公司，批號180301；虎杖苷對照品：上海源葉生物科技有限公司，批號ZM0530LA14，純度7.18%；大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌（浙江中醫(yī)藥大學生命科學學院發(fā)酵工程實驗室提供）；LB培養(yǎng)基為實驗室自制，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 虎杖苷含有量測定

2.1.1 供試品溶液制備[4]精密稱取虎杖粗粉4.0 g（過50目篩），采用乙醇回流法于不同因素下提取，趁熱過濾，濾液旋蒸后加入甲醇溶劑定容至50 mL，紫外分光光度計于305 nm處檢測其吸光值。

2.1.2 標準曲線制備 精密稱取虎杖苷對照品3.0 mg，定容至50 mL，充分混勻，得到0.06 mg/mL的原液，稀釋成不同質量濃度，測量得到標準曲線：Y=0.0747X+0.0877，R2=0.9995，在1.5～24 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.2 單因素試驗[5]

2.2.1 乙醇體積分數 取虎杖粉末4.0 g，固定提取時間1 h，液料比10 mL/g，溫度為60℃，分別加入50%、60%、70%、80%、90%、95%乙醇，測定虎杖苷含有量，結果可知，乙醇體積分數在50%～95%時，溶液中虎杖苷含有量基本保持不變，在70%時達到最大值，隨后有所下降至基本不變。

2.2.2 提取溫度 取虎杖粉末4.0 g，固定提取時間1 h，液料比10 mL/g，乙醇體積分數60%，分別于50℃、60℃、70℃、80℃、90℃水浴中提取，測定虎杖苷含有量，結果可知，在50～90℃時，隨溫度的升高，溶液中虎杖苷含有量有所增加，直至溫度升高至70℃后基本保持不變。

2.2.3 料液比 取虎杖粉末4.0 g，固定提取時間1 h，乙醇體積分數60%，提取溫度為60℃，料液比分別為5、10、15、20、25 mL/g提取，測定虎杖苷含有量，結果可知，溶液中虎杖苷含有量隨著乙醇量的增加表現為先增加后減小，其中在液料比為15 mL/g時達到最大值。

2.2.4 提取時間 取虎杖粉末4.0 g，固定乙醇體積分數60%，提取溫度為60℃，料液比1∶10，提取時間為0.5、1、1.5、2、2.5 h，測定虎杖苷含有量，結果可知，溶液中虎杖苷含有量隨著提取時間的增加略微有所增加，隨后有所下降至基本不變。

2.3 Box-Behnken響應面法

由單因素試驗可知提取溫度（因素A）、時間（因素B）、料液比（因素C）這3個因素對虎杖苷的提取得率影響較大，因此選用這3個因素進行工藝的優(yōu)化，在乙醇體積分數為60%的條件下，以虎杖苷含有量（Y）為評價指標，設計三因素三水平試驗，采用Design-Expert軟件對實驗數據進行分析[5]，由Y=0.0747X+0.0877方程計算出虎杖苷含有量。因素水平見表1，結果見表2。

表1 響應面優(yōu)化試驗因素水平表

表2 響應面優(yōu)化試驗設計結果

表3 方差分析

通過Design-Expert軟件對表2數據進行分析，得到方程Y=+44.99-0.059A-1.05B+2.08C+2.58AB+0.19AC-1.53BC-2.97A2-2.77B2-3.42C2，方差分析見表3，由表可知，模型P＜0.0001，差異極顯著，具有統(tǒng)計學意義；失擬項P＞0.05，表明模型擬合度良好；B、C、AB、BC、A2、B2、C2差異顯著（P＜0.05），其他項不顯著（P＞0.05），各因素影響程度依次為C>B>A。

響應面分析見圖1～圖3，由圖可知，溫度與液料比的響應面的曲面較陡，表明其交互作用對虎杖苷含有量的影響顯著，而與提取時間、液料比與溫度的響應面的曲線較平滑，表明其交互作用對虎杖苷含有量的影響較小，可知液料比和提取溫度之間交互作用有明顯影響。

圖1 溫度與時間對虎杖苷含有量影響的響應面圖（a）與等高線圖（b）

圖2 液料比與時間對虎杖苷含有量影響的響應面圖（a）與等高線圖（b）

圖3 液料比與溫度對虎杖苷含有量影響的響應面圖（a）與等高線圖（b）

2.4 最優(yōu)提取工藝

通過Design-Expert軟件分析得最佳提取工藝為：提取溫度77.54℃、提取時間1.54 h、液料比16.53 mL/g以及乙醇濃度60%。

2.5 虎杖提取物體外抗氧化活性實驗[6]

精密移取20 mg/mL虎杖提取物，分別稀釋至8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.25、0.125 mg/mL，取各提取液20 μL于96孔板中，加入180 μL 0.1 g/mL DPPH溶液，以60%乙醇作空白對照，Vit c作陽性對照，避光反應30 min，于517 nm處測量吸光度，并計算清除率。重復實驗3次，結果如圖4所示。可知虎杖提取物質量濃度在0.125～4 mg/mL時，其對DPPH自由基的清除率隨質量濃度的增加而增大，當質量濃度達到4 mg/mL后，對DPPH自由基的清除率基本保持不變，可達90%。

圖4 不同質量濃度虎杖提取物DPPH清除率實驗結果

2.6 虎杖提取物體外抑菌活性實驗

2.6.1 最小抑菌濃度（MIC）測定 參照文獻[7]方法。采用二倍比稀釋法將虎杖提取物稀釋成系列梯度濃度，取10 μL菌液（約1×107cfu/mL）均勻涂布在90 mm LB瓊脂培養(yǎng)基上，每板放置牛津杯，各孔加入100 μL的藥液，以青霉素鈉作陽性對照，60%乙醇為空白對照，37℃恒溫培養(yǎng)18 h，觀察測量抑菌圈直徑，并判斷MIC，完全沒有抑菌直徑的最低藥物質量濃度即為MIC。多次實驗結果取平均值，結果見表4、圖5。由圖可知，優(yōu)化工藝下得到的虎杖提取物對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌均有抑制作用，隨著虎杖提取物質量濃度的提高抑菌圈直徑逐漸增大，且金黃色葡萄球菌的抑菌圈大于枯草芽孢桿菌，對大腸桿菌抑制效果不明顯。

表4 不同質量濃度虎杖提取物對細菌的抑制作用（mm，±s）

表4 不同質量濃度虎杖提取物對細菌的抑制作用（mm，±s）

菌種陰性對照金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌大腸桿菌n 3 3 3 MIC（mg/mL）15.625 15.625-虎杖提取物（mg/mL）500 17.47±1.38 15.83±0.56-250 17.25±1.13 15.54±0.65-125 15.38±1.63 14.13±1.51-陽性對照37.31±1.59 37.14±0.42 15.81±1.93- - -

圖5 虎杖提取液對細菌的抑制作用

2.6.2 細菌生長抑制量-時曲線 參照文獻[8]方法。在含2MIC、MIC、1/2MIC的含藥培養(yǎng)基中接種1%（體積分數）對數期菌液，以不含藥的相應培養(yǎng)基接種1%（體積分數）對數期菌液作為空白對照，37℃，180 r/min搖床培養(yǎng)。4 h后，每隔1小時測菌液吸光度；以時間（h）為橫坐標，波長600 nm處菌液吸光度，A600nm為縱坐標繪制細菌生長曲線，結果見圖6。由圖可知，對照組中的兩個菌株表現出典型的正常細菌生長曲線，不同質量濃度虎杖提取物對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌生長表現出不同程度的抑制作用，但兩種菌的總體生長周期并無明顯變化，其中2MIC虎杖提取液對兩種菌株的生長有明顯的抑制作用，使其無法進入對數生長期，生長曲線趨于平緩。

圖6 不同質量濃度虎杖提取物對細菌生長曲線的影響

3 討論

虎杖是一味傳統(tǒng)中藥，具有清熱解毒、活血化瘀的功效，主要成分包括二苯乙烯類、蒽醌類、黃酮類、酚類等，虎杖苷是白藜蘆醇與葡萄糖結合的產物，也稱為白藜蘆醇苷，具有良好的穩(wěn)定性，其藥理作用與白藜蘆醇類似，兩者可在體內相互轉化[9]。本實驗通過響應面法優(yōu)化得到虎杖苷最佳回流提取條件：溫度77.54℃，乙醇體積分數60%，液料比16.53 mL/g，提取時間1.54 h。單因素實驗結果顯示，乙醇濃度過高，溶液中虎杖苷含有量并未增加，這可能由于乙醇濃度過高使植物細胞失水，有效成分不易擴散，從而降低虎杖苷的提取率[10]；同時液料比過高或過低都不利于虎杖苷的提取，可能通過影響虎杖細胞的移動和虎杖苷從細胞中釋放，使溶解度下降，降低虎杖苷的得率[11]。

在抗氧化實驗中，虎杖提取物表現出良好的抗氧化能力，當質量濃度為4 mg/mL時，對DPPH的清除率可達到90%，與其他中藥相比，具有明顯優(yōu)勢[12]。近期研究表明[13]，虎杖苷在腦缺血、動脈粥樣硬化、非酒精性脂肪肝等疾病的治療中發(fā)揮一定作用，具有減輕機體脂質過氧化、降低氧化損傷的作用。虎杖苷具有3個酚羥基，也提示其具有抗氧化活性，可通過進一步分析虎杖提取物中的組分探究其發(fā)揮抗氧化作用的主要活性物質，為相關疾病的治療提供物質基礎。

在抑菌實驗中，虎杖提取物對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均有一定抑制作用，并呈劑量依賴性，對大腸桿菌的抑制作用不明顯。金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌為革蘭氏陽性菌，兩者屬于常見的致病菌，大腸桿菌為革蘭氏陰性菌，屬于條件致病菌。研究表明，虎杖中的虎杖苷、大黃素等具有抗菌活性，其可通過抑制細菌神經氨酸酶活性，阻斷細菌細胞壁、細胞膜的形成，破壞膜的完整性從而抑制細菌的生長[14-15]。虎杖提取物對于大腸桿菌并不敏感，這可能與革蘭氏陰性菌表面多層結構的細胞壁有關，阻礙了藥物通過外膜到達作用靶點，也可能與提取物未進一步純化有關。細菌生長抑制曲線是動態(tài)衡量抗菌藥物抗菌活性的定量指標，可以反映抗菌藥物作用于細菌不同時間后細菌的生長情況。結果顯示虎杖提取物在MIC和2 MIC條件下，分別對兩種菌株的生長有不同的抑制作用，其可能通過破壞細胞膜的結構或功能影響細菌的正常代謝活性和生理功能，阻斷細菌進入對數期所需核酸和蛋白質的合成，從而抑制其生長[16]。

中藥具有成分復雜、作用靶點多等特點，且毒副作用相對小，虎杖中含有多種活性成分，藥理作用廣泛，其多組分之間是否存在協同起效的可能，虎杖提取物中發(fā)揮抗氧化作用的主要有效成分是什么，抑菌的具體作用機制如何，藥物進入體內發(fā)揮藥理作用效果是否與體外一致，有待進一步研究。