射干麻黃湯對(duì)急性呼吸衰竭模型大鼠的干預(yù)效果及作用機(jī)制研究?

陳永昶 林 利 茆俊卿 王 謙 朱 佳△

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)揚(yáng)州附屬醫(yī)院，江蘇 揚(yáng)州 225000；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京210000；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210000）

急性呼吸衰竭主要是指機(jī)體肺功能、換氣功能出現(xiàn)嚴(yán)重異?；蚬δ苷系K，導(dǎo)致機(jī)體氣體交換無法正常進(jìn)行，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體生理功能異常以及代謝紊亂的癥狀[1-2]。隨著我國人口老齡化現(xiàn)象的不斷發(fā)展以及我國環(huán)境污染問題的日益嚴(yán)重，近年來我國急性呼吸衰竭發(fā)病率逐年上升，嚴(yán)重威脅患者的身體健康和生活質(zhì)量，因此尋找一種安全有效的治療手段具有重要意義[3-4]。射干麻黃湯常用于呼吸系統(tǒng)疾病的治療，但是關(guān)于其治療急性呼吸衰竭的臨床研究還鮮有報(bào)道。本研究中建立急性呼吸衰竭大鼠模型，使用射干麻黃湯進(jìn)行干預(yù)，旨在探究射干麻黃湯對(duì)急性呼吸衰竭模型大鼠的干預(yù)效果及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取40只SD健康雄性大鼠，由基爾頓生物科技（上海）有限公司提供，平均月齡（8.9±0.5）月，平均體質(zhì)量（230.2±10.3）g。在相對(duì)濕度30%～35%、溫度（23.8±1.5）℃的環(huán)境中喂養(yǎng)大鼠1周，光照12 h/d。本研究獲我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 藥物與試劑 射干麻黃湯：射干、麻黃、五味子、桔梗、款冬花、紫菀各12 g，黨參、制半夏、細(xì)辛、生姜各9 g，黃芪30 g，大棗5枚。藥材購于本院中藥房，將藥材于清水中浸泡30 min，加水后使用文火煎90 min，濃縮為1 mL含生藥3.84 g的藥汁。脂多糖（上海鼓臣生物技術(shù)有限公司）；兔抗大鼠白細(xì)胞介素-8（IL-8）、白細(xì)胞介素-17（IL-17）抗體（Sigma公司）；兔抗小鼠超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）抗體（Dako公司）；小鼠抗大鼠GSH-Px抗體（Invitrogen公司）；兔抗小鼠過氧化脂（LPO）抗體（Selleck公司）；大鼠抗小鼠丙二醛（MDA）抗體（Hyclone公司）；大鼠抗兔Bcl-2、Bax抗體（Gibco公司）；小鼠抗兔Caspase3抗體（BD公司）。硫酸阿托品注射液（成都第一藥業(yè)有限公司）；動(dòng)物肺功能儀（上海玉研科學(xué)儀器有限公司）；冰凍切片機(jī)（湖北孝感闊海醫(yī)療科技有限公司）；血?dú)夥治鰞x（北京普朗新技術(shù)有限公司）。

1.3 模型制備 參照耿維鳳等[5]建模方法，隨機(jī)選取30只大鼠建立急性呼吸衰竭模型：麻醉后將其在操作臺(tái)上固定，將大鼠支氣管暴露于術(shù)野之中，并進(jìn)行插管處理，之后將5 mg/kg大腸桿菌脂多糖滴入支氣管中，并根據(jù)血?dú)夥治鼋Y(jié)果確定建模成功情況：動(dòng)脈血二氧化碳分壓（PaCO2）<35 mmHg、動(dòng)脈血氧分壓（PaO2）<75 mmHg可判定為建模成功。建模過程中死亡1只，建模失敗3只，建模成功26只。

1.4 分組與給藥 將26只急性呼吸衰竭大鼠隨機(jī)分為模型組8只及西藥組、射干麻黃湯組各9只，其余10只未作處理大鼠為正常組。正常組、模型組大鼠使用3 mL 0.9%氯化鈉注射液進(jìn)行灌胃處理；西藥組大鼠腹腔注射0.1 mL硫酸阿托品注射液，每日1次；射干麻黃湯組大鼠灌胃射干麻黃湯，每日1次，每次3 mL。各組大鼠均連續(xù)干預(yù)7 d。

1.5 呼吸頻率及pH、PaCO2、PaO2水平檢測(cè) 連續(xù)干預(yù)7 d后使用動(dòng)物肺功能儀對(duì)各組大鼠呼吸頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，使用血?dú)夥治鰞x對(duì)各組大鼠pH、PaCO2、PaO2水平進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）肺組織病理學(xué)觀察。血?dú)庵笜?biāo)檢測(cè)結(jié)束后，采用斷頭法處死大鼠，取肺組織，置于冰凍切片機(jī)上進(jìn)行包埋處理，-26℃冷凍處理2.5 h后切片，厚度為10 μm，切片置于-20℃下保存。將切片烤干后進(jìn)行脫蠟處理，置入不同濃度酒精中復(fù)水3 min。使用蘇木精染色15 min后清洗3次，使用鹽酸酒精分化處理30 s，充分清洗之后使用1%伊紅染色，酒精脫水處理后進(jìn)行脫蠟處理，封片后使用顯微鏡進(jìn)行觀察。2）酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)IL-8、IL-17、hs-CRP水平。干預(yù)7 d后，取各組大鼠尾部靜脈血2 mL，2 000 r/min離心15 min，分離上清液，于-80℃保存。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)A450值，分析IL-8、IL-17、hs-CRP水平。3）免疫透射比濁法檢測(cè)GSH-Px、LPO、MDA水平。取已制備血清標(biāo)本，準(zhǔn)備3個(gè)試管并分別標(biāo)記為標(biāo)準(zhǔn)管、測(cè)定管及空白管，3個(gè)試管中均加入350 μL緩沖液，標(biāo)準(zhǔn)管中加入20 μL GSH-Px、LPO、MDA標(biāo)準(zhǔn)液，測(cè)定管中加入20 μL血清，空白管中加入20 μL蒸餾水，3個(gè)試管分別搖晃均勻，常溫環(huán)境靜置5～10 min后使用分光光度計(jì)進(jìn)行比色，在500 nm波長處以空白管調(diào)零，記錄吸光度，對(duì)GSH-Px、LPO、MDA水平進(jìn)行計(jì)算。4）Western blotting法檢測(cè)Bcl-2、Bax、Caspase3表達(dá)。取已制備好的肺組織切片標(biāo)本，使用PBS緩沖液對(duì)標(biāo)本沖洗之后裂解30 min，測(cè)定蛋白濃度。按20 μg/孔添加蛋白緩沖液后進(jìn)行電泳，10 min后將電轉(zhuǎn)膜置于10%的牛奶中浸泡，常溫環(huán)境下封閉90 min。之后結(jié)合一抗、稀釋，孵育1 d，取出后使用TBST液沖洗，結(jié)合二抗，60 min后清洗、顯色，對(duì)Bcl-2、Bax、Cas?pase3表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠呼吸頻率及pH、PaCO2、PaO2水平比較見表1。模型組、西藥組、射干麻黃湯組大鼠呼吸頻率顯著低于正常組，西藥組、射干麻黃湯組大鼠呼吸頻率高于模型組，且射干麻黃湯組大鼠呼吸頻率高于西藥組（均P＜0.05）；模型組、西藥組、射干麻黃湯組大鼠pH、PaCO2、PaO2水平顯著低于正常組，西藥組、射干麻黃湯組大鼠pH、PaCO2、PaO2水平高于模型組，且射干麻黃湯組大鼠pH、PaCO2、PaO2水平高于西藥組（P＜0.05）。

表1 各組大鼠呼吸頻率及pH、PaCO2、PaO2水平比較（±s）

表1 各組大鼠呼吸頻率及pH、PaCO2、PaO2水平比較（±s）

與正常組比較，?P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與西藥組比較，△P＜0.05。下同

組別正常組模型組西藥組射干麻黃湯組n 1093.8 39.9 79.986.呼吸頻率（次/min）35±6.58 11±3.06*12±5.62*#22±6.01*#△pH 7.40±0.11 7.03±0.06*7.18±0.07*#7.29±0.09*#△PaCO2（mmHg）43.02±2.19 30.26±1.35*38.51±1.62*#41.12±1.95*#△PaO2（mmHg）81.67±3.26 53.26±2.34*65.99±2.87*#74.66±3.12*#△

2.2 各組大鼠IL-8、IL-17、hs-CRP水平比較 見表2。模型組、西藥組、射干麻黃湯組大鼠IL-8、IL-17、hs-CRP水平高于正常組（P＜0.05）；西藥組、射干麻黃湯組大鼠IL-8、IL-17、hs-CRP水平低于模型組，且射干麻黃湯組大鼠IL-8、IL-17、hs-CRP水平低于西藥組（P＜0.05）。

表2 各組大鼠IL-8、IL-17、hs-CRP水平比較（±s）

表2 各組大鼠IL-8、IL-17、hs-CRP水平比較（±s）

組別正常組模型組西藥組射干麻黃湯組n 102 8 6 9 3 93 IL-8（pg/mL）6.35±3.12 2.29±5.98*5.09±4.12*#1.22±3.61*#△IL-17（ng/L）8.26±1.42 27.51±3.42*13.97±2.13*#11.59±1.98*#△hs-CRP（ng/mL）4.11±0.71 13.25±2.46*8.22±1.23*#6.15±0.85*#△

2.3 各組大鼠GSH-Px、LPO、MDA水平比較 見表3。模型組、西藥組、射干麻黃湯組大鼠GSH-Px水平低于正常組，LPO、MDA水平高于正常組（P＜0.05）；西藥組、射干麻黃湯組大鼠GSH-Px水平高于模型組，LPO、MDA水平低于模型組，且射干麻黃湯組大鼠GSH-Px水平高于西藥組，LPO、MDA水平低于西藥組（P＜0.05）。

表3 各組大鼠GSH-Px、LPO、MDA水平比較（±s）

表3 各組大鼠GSH-Px、LPO、MDA水平比較（±s）

組別正常組模型組西藥組射干麻黃湯組n 1081.5 8 52.3 9 65.1 973.5 GSH-Px（U/L）2±7.66 9±4.60*1±5.72*#1±6.97*#△LPO（U/mg）0.06±0.01 0.22±0.05*0.13±0.02*#0.08±0.01*#△MDA（μmol/L）19.56±2.08 37.30±3.72*27.59±2.67*#23.51±2.32*#△

2.4 各組大鼠Bcl-2、Bax、Caspase3表達(dá)比較 見表4、圖1。模型組、西藥組、射干麻黃湯組大鼠Bcl-2、Caspase3表達(dá)均高于正常組，Bax表達(dá)低于正常組（P＜0.05）；西藥組、射干麻黃湯組大鼠Bcl-2、Caspase3表達(dá)均低于模型組，Bax表達(dá)均高于模型組，且射干麻黃湯組大鼠Bcl-2、Caspase3表達(dá)低于西藥組，Bax表達(dá)高于西藥組（P＜0.05）。

表4 各組大鼠Bcl-2、Bax、Caspase3表達(dá)比較（±s）

表4 各組大鼠Bcl-2、Bax、Caspase3表達(dá)比較（±s）

組別正常組模型組西藥組射干麻黃湯組n 10 8 9 9 Bcl-2 0.96±0.13 1.68±0.31*1.32±0.18*#1.10±0.15*#△Bax 1.20±0.16 0.41±0.03*0.88±0.09*#1.05±0.12*#△Caspase3 1.06±0.10 1.73±0.29*1.34±0.17*#1.19±0.12*#△

圖1 各組Bcl-2、Bax、Caspase3表達(dá)條帶

2.5 各組大鼠肺組織病理學(xué)觀察 見圖2。正常組肺泡大小均勻、結(jié)構(gòu)完整，肺泡間隔一致，無增厚現(xiàn)象；支氣管上皮組織未出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象。模型組肺泡間隔增加，肺泡毛細(xì)血管壁發(fā)現(xiàn)充血，有炎性細(xì)胞浸潤，有部分肺泡出現(xiàn)水腫。射干麻黃湯組肺泡腔內(nèi)干凈，細(xì)胞間隔未見增厚，炎性細(xì)胞浸潤程度明顯下降，未見肺泡水腫、毛細(xì)血管充血情況。

圖2 各組大鼠肺組織病理學(xué)觀察圖（HE染色，100倍）

3 討論

目前臨床常使用西醫(yī)治療手段對(duì)急性呼吸衰竭患者進(jìn)行治療，但是臨床治療效果并不理想，因此大多數(shù)專家學(xué)者開始致力于中醫(yī)藥治療急性呼吸衰竭的研究[6]。中醫(yī)學(xué)將急性呼吸衰竭癥狀歸于“肺脹”范疇，主要表現(xiàn)為肺氣虧虛。射干麻黃湯由射干、麻黃、黨參、黃芪、五味子、桔梗、款冬花、生姜等組成。射干、麻黃具有開郁、宣肺、化痰、平喘的功效；黨參、黃芪等具有滋陰、潤肺、益氣的功效；以五味子、桔梗、款冬花、生姜等相佐，能夠起到較為理想的健脾、宣肺、益氣、平喘、化痰的功效[7-8]。

急性呼吸衰竭癥狀的發(fā)生發(fā)展會(huì)使機(jī)體pH、PaCO2、PaO2等血?dú)庵笜?biāo)水平出現(xiàn)明顯的異常，對(duì)pH、PaCO2、PaO2水平進(jìn)行檢測(cè)，能夠?qū)毙院粑ソ甙Y狀嚴(yán)重程度以及臨床治療效果進(jìn)行較為準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)[9-10]。本研究結(jié)果顯示，相比正常大鼠，急性呼吸衰竭大鼠呼吸頻率以及pH、PaCO2、PaO2水平較低，使用射干麻黃湯對(duì)急性呼吸衰竭大鼠進(jìn)行干預(yù)，大鼠呼吸頻率及pH、PaCO2、PaO2水平明顯上升而趨于正常水平，說明使用射干麻黃湯進(jìn)行干預(yù)能夠改善急性呼吸衰竭大鼠呼吸功能及血?dú)庵笜?biāo)水平。

大量實(shí)驗(yàn)研究表明，急性呼吸衰竭癥狀的發(fā)生發(fā)展伴隨著機(jī)體炎癥反應(yīng)[11-12]。IL-8、IL-17、hs-CRP是廣譜的炎性指標(biāo)。IL-8能夠吸引、激活中性粒細(xì)胞，誘發(fā)機(jī)體局部炎癥反應(yīng)，對(duì)機(jī)體組織細(xì)胞造成損傷[13]。IL-17是一種致炎因子，由活化的T細(xì)胞產(chǎn)生，能夠促進(jìn)IL-6、IL-8等炎癥因子的生成，進(jìn)而誘發(fā)炎癥反應(yīng)[14]。hs-CRP主要由肝臟組織合成，是一種廣譜的機(jī)體炎癥反應(yīng)標(biāo)志物[15]。本研究結(jié)果顯示，相比正常大鼠，急性呼吸衰竭大鼠IL-8、IL-17、hs-CRP水平明顯較高，說明急性呼吸衰竭大鼠肺組織存在較為嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。使用射干麻黃湯進(jìn)行干預(yù)后IL-8、IL-17、hs-CRP水平明顯下降，說明射干麻黃湯干預(yù)能夠抑制IL-8、IL-17、hs-CRP水平，減輕大鼠肺組織炎癥反應(yīng)，從而起到肺保護(hù)作用。

呼吸衰竭癥狀的發(fā)生發(fā)展與機(jī)體氧化應(yīng)激損傷具有密切聯(lián)系[16-17]。GSH-Px、LPO、MDA是臨床較為常用的評(píng)價(jià)機(jī)體抗氧化能力的指標(biāo)，其表達(dá)水平的變化與機(jī)體氧化應(yīng)激損傷嚴(yán)重程度密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，相比正常大鼠，急性呼吸衰竭大鼠GSH-Px水平較低，LPO、MDA水平較高，說明急性呼吸衰竭癥狀的發(fā)生發(fā)展伴隨著肺組織細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，使用射干麻黃湯進(jìn)行干預(yù)的急性呼吸衰竭大鼠GSH-Px水平上升，LPO、MDA水平下降，說明射干麻黃湯能夠調(diào)控GSH-Px、LPO、MDA水平，減輕大鼠肺組織氧化應(yīng)激損傷，從而起到較為理想的肺保護(hù)作用。

呼吸衰竭癥狀的發(fā)生發(fā)展與機(jī)體肺組織細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。Bcl-2、Bax、Caspase3表達(dá)的變化與細(xì)胞凋亡能力密切相關(guān)。Bcl-2、Bax是線粒體細(xì)胞凋亡通路中的重要基因，二者表達(dá)水平的變化與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[18-19]。Caspase家族與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，Cas?pase3是Caspase家族的重要一員[20]。本研究結(jié)果顯示，使用射干麻黃湯對(duì)急性呼吸衰竭大鼠進(jìn)行干預(yù)，Bcl-2、Caspase3表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)，Bax表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)，說明射干麻黃湯能夠調(diào)控Bcl-2、Bax、Caspase3表達(dá)，抑制急性呼吸衰竭大鼠肺組織細(xì)胞凋亡，從而起到肺保護(hù)作用。

綜上所述，使用射干麻黃湯對(duì)急性呼吸衰竭大鼠進(jìn)行干預(yù)，能夠改善大鼠呼吸頻次及血?dú)馑剑瑴p輕大鼠炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激損傷，抑制肺組織細(xì)胞凋亡，從而起到一定的肺保護(hù)作用，為急性呼吸衰竭的臨床治療提供參考依據(jù)。