異源細(xì)胞質(zhì)對(duì)小麥雄性不育系主要農(nóng)藝性狀、花粉粒核分裂及花藥絨氈層降解的影響

羅 茜 周雨馨 馬 瑞 蔣韞博 張改生 劉明宇 牛 娜 宋瑜龍

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院/國(guó)家楊凌農(nóng)業(yè)生物技術(shù)育種中心/國(guó)家小麥改良中心楊凌分中心/小麥育種教育部工程研究中心/陜西省作物雜種優(yōu)勢(shì)研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100；2 旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100)

小麥(Tritiaum aestivum)是世界上總產(chǎn)量?jī)H次于玉米的第二大糧食作物，同時(shí)也是我國(guó)三大主糧之一。我國(guó)大部分人口以小麥為主食，使得我國(guó)既是世界范圍內(nèi)最大的小麥生產(chǎn)國(guó)，也是最大的消費(fèi)國(guó)，小麥高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)對(duì)保障我國(guó)糧食安全和社會(huì)穩(wěn)定具有非常重要的意義[1]。 近年來(lái)，隨著城市化建設(shè)速度的加快和退耕還林工程的實(shí)施，我國(guó)耕地面積逐年減少，加之農(nóng)業(yè)主管部門(mén)雙減(減肥減藥)項(xiàng)目的實(shí)施，大幅度提高小麥單位面積產(chǎn)量，對(duì)保障國(guó)內(nèi)糧食市場(chǎng)穩(wěn)定和口糧安全顯得非常重要[2-3]。 小麥雜種優(yōu)勢(shì)利用技術(shù)是大幅度提高小麥單產(chǎn)的重要途徑之一[4-6]，而雄性不育系的選擇則是實(shí)現(xiàn)小麥雜種優(yōu)勢(shì)利用提高單產(chǎn)和品質(zhì)的關(guān)鍵。 小麥雄性不育系主要有三類(lèi):一是遺傳型不育系，二是光溫敏雄性不育系，三是化學(xué)雜交劑誘導(dǎo)的生理型雄性不育系[7]。 光溫敏雄性不育系的育性轉(zhuǎn)換易受環(huán)境影響[8-9]，化學(xué)雜交劑制種成本較高，這極大地限制了小麥光溫敏雄性不育系和化學(xué)誘導(dǎo)的生理型雄性不育系的利用，使得越來(lái)越多的研究逐漸轉(zhuǎn)向遺傳型不育系，以期實(shí)現(xiàn)小麥雜種優(yōu)勢(shì)利用技術(shù)的大面積推廣[10]。

核質(zhì)互作雄性不育系屬遺傳型不育系的一類(lèi)。 近年來(lái)，核質(zhì)互作雄性不育的研究多集中在不育系花藥酶學(xué)特征分析[11]，絨氈層代謝與花粉粒敗育的關(guān)系[12-15]，以及敗育植株的生物學(xué)特性和細(xì)胞學(xué)特征分析[16-19]等方面，缺乏一定的系統(tǒng)性和完整性。 截止目前，關(guān)于異源細(xì)胞質(zhì)對(duì)花粉粒核分裂及絨氈層降解特征影響的研究尚鮮有報(bào)道。 因此，本研究以2 套小麥核(偃師9 號(hào)細(xì)胞核和90-110 細(xì)胞核)質(zhì)(K 型、B型、S 型、V 型和Ven 型細(xì)胞質(zhì)，均來(lái)自山羊草屬)互作雄性不育系及其保持系(偃師9 號(hào)細(xì)胞核和90-110細(xì)胞核，普通小麥細(xì)胞質(zhì))為材料，研究異源細(xì)胞質(zhì)對(duì)小麥主要農(nóng)藝性狀、花粉粒核分裂及花藥絨氈層降解特征的影響，以期進(jìn)一步揭示小麥核質(zhì)互作雄性不育機(jī)理，為更好地利用異源核質(zhì)互作雄性不育系提供堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試小麥材料為2 套核質(zhì)互作雄性不育系及其對(duì)應(yīng)的保持系(表1)，其中，偃師9 號(hào)細(xì)胞核屬1B/1R類(lèi)型，90-110 細(xì)胞核屬非1B/1R 類(lèi)型，均由西北農(nóng)林科技大學(xué)張改生教授提供。 上述材料種植于西北農(nóng)林科技大學(xué)試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)，每份材料種植3 行，每行長(zhǎng)2 米，單行播15 株，日常管理同大田。

表1 供試材料Table 1 Experiment almaterials in present study

1.2 取樣與材料固定

待上述2 套核質(zhì)互作雄性不育系及其保持系材料發(fā)育至單核早期、單核晚期、二核期和三核期時(shí)，分別取10 個(gè)長(zhǎng)勢(shì)一致的穗子放入冰盒，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，剝?nèi)∥挥谒胫胁康? 個(gè)小花中的1 枚花藥置于干凈的載玻片上，滴加1.5%醋酸洋紅，用鑷子將花藥夾碎，于顯微鏡下確定花粉粒發(fā)育時(shí)期。 隨后摘取該小花中剩余的2 枚花藥分別投入裝有卡諾氏固定液和FAA(formalin-aceto-alcohol)固定液的1.5 mL 離心管中(每個(gè)材料各時(shí)期2 種固定液中各固定10 枚花藥)，并對(duì)其進(jìn)行抽真空處理，最后轉(zhuǎn)至4℃冰箱保存。

1.3 農(nóng)藝性狀調(diào)查

待小麥發(fā)育至揚(yáng)花期，分別在每份材料中隨機(jī)抽樣取18 株，進(jìn)行株高、穗長(zhǎng)、穗下節(jié)間長(zhǎng)和分蘗數(shù)等農(nóng)藝性狀的調(diào)查。 上述農(nóng)藝性狀調(diào)查方法均參考《農(nóng)作物品種區(qū)域試驗(yàn)技術(shù)規(guī)程 小麥》[20]。

1.4 花粉粒核分裂觀察

從卡諾氏固定液中取1 枚花藥置于干凈的載玻片上，滴加1.5%醋酸洋紅染色，并置于光學(xué)顯微鏡下觀察，同時(shí)選取3 個(gè)視野進(jìn)行拍照。 各材料不同時(shí)期(單核早期、單核晚期、二核期和三核期)分別取3 枚花藥，進(jìn)行染色。 用1% KI-I2對(duì)各材料三核期的花粉粒進(jìn)行染色，并于光學(xué)顯微鏡下觀察，鑒定敗育類(lèi)型。

1.5 石蠟切片制備與花藥絨氈層觀察

參照胡麗芳等[21]、豆麗萍等[22]的石蠟制片方法，用FAA 固定4 d 后，將花藥轉(zhuǎn)移至70%乙醇，于4℃冰箱中保存，以備制作石蠟切片。 取上述花藥分別經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟滲透、包埋和修蠟后，用輪式切片機(jī)切片，厚度為11 μm，隨后展片10 min，置于40℃恒溫箱中保存3 d。 待切片粘合牢固后，進(jìn)行脫蠟、復(fù)水和番紅-固綠復(fù)染，最后封片。

普通光學(xué)顯微鏡下觀察不同材料各時(shí)期(單核早期、單核晚期、二核期和三核期)3 個(gè)花藥橫截面，每個(gè)花藥截面選代表性視野拍照4 張，合計(jì)12 張，隨后用Image-Pro Plus 6.0 軟件(https:/ /cloud.tencent.com/developer/news/16116)將所采集的不同材料各時(shí)期花藥橫截面絨氈層細(xì)胞面積轉(zhuǎn)化為數(shù)值。

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用IBM SPSS Statistics 20 軟件對(duì)株高、穗長(zhǎng)、穗下節(jié)間長(zhǎng)、分蘗數(shù)和絨氈層面積分別進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)[23]，同時(shí)采用Duncan 多重比較檢驗(yàn)法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05 表示數(shù)據(jù)間存在顯著差異。 所得數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 異源細(xì)胞質(zhì)對(duì)小麥農(nóng)藝性狀的影響

S-偃師9 號(hào)和Ven-偃師9 號(hào)株高顯著高于偃師9 號(hào)保持系、K-偃師9 號(hào)、B-偃師9 號(hào)與V-偃師9 號(hào)，但S-偃師9 號(hào)與Ven-偃師9 號(hào)株高間無(wú)顯著差異，且偃師9 號(hào)保持系、K-偃師9 號(hào)、B-偃師9 號(hào)與V-偃師9 號(hào)株高間也無(wú)顯著差異。 K-90-110 株高顯著低于90-110 保持系，S-90-110 株高顯著低于90-110保持系、B-90-110 和V-90-110，Ven-90-110 株高顯著低于90-110 保持系、K-90-110、B-90-110 和V-90-110，但90-110 保持系、B-90-110 與V-90-110株高間無(wú)顯著差異，K-90-110、B-90-110 與V-90-110 株高間無(wú)顯著差異，K-90-110 與S-90-110 以及S-90-110 與Ven-90-110 株高間也無(wú)顯著差異。 比較同質(zhì)異核不同材料株高發(fā)現(xiàn)，偃師9 號(hào)保持系株高顯著低于90-110 保持系，同時(shí)，K-偃師9 號(hào)、B-偃師9 號(hào)與V-偃師9 號(hào)株高也分別顯著低于K-90-110、B-90-110 與V-90-110，但S-偃師9 號(hào)和Ven-偃師9號(hào)株高分別與S-90-110 和Ven-90-110 間無(wú)顯著差異(圖1-A)。 上述結(jié)果表明，小麥核質(zhì)互作雄性不育系細(xì)胞核為1B/1R 類(lèi)型或非1B/1R 類(lèi)型時(shí)，與保持系比較，B 型和V 型細(xì)胞質(zhì)對(duì)小麥株高均無(wú)顯著影響；而K 型、S 型和Ven 型細(xì)胞質(zhì)對(duì)小麥株高的影響與細(xì)胞核1B/1R 類(lèi)型有關(guān)，其中S 型和Ven 型細(xì)胞質(zhì)在非1B/1R 類(lèi)型細(xì)胞核存在時(shí)可顯著降低株高，而在1B/1R 類(lèi)型細(xì)胞核存在時(shí)可顯著增加株高，而K 型細(xì)胞質(zhì)在非1B/1R 類(lèi)型細(xì)胞核存在時(shí)可顯著降低株高。在1B/1R 類(lèi)型細(xì)胞核體存在時(shí)，對(duì)株高無(wú)顯著影響。

B-偃師9 號(hào)穗長(zhǎng)顯著高于偃師9 號(hào)保持系，且S-偃師9 號(hào)穗長(zhǎng)顯著高于偃師9 號(hào)保持系、K-偃師9號(hào)、V-偃師9 號(hào)和Ven-偃師9 號(hào)，但偃師9 號(hào)保持系、K-偃師9 號(hào)、V-偃師9 號(hào)和Ven-偃師9 號(hào)穗長(zhǎng)間無(wú)顯著差異，K-偃師9 號(hào)、B-偃師9 號(hào)、V-偃師9 號(hào)和Ven-偃師9 號(hào)穗長(zhǎng)間也無(wú)顯著差異，B-偃師9 號(hào)與S-偃師9 號(hào)穗長(zhǎng)間同樣無(wú)顯著差異。 K-90-110 和B-90-110 穗長(zhǎng)顯著高于90-110 保持系和V-90-110，但90-110 保持系、S-90-110、V-90-110 和Ven-90-110 穗長(zhǎng)間無(wú)顯著差異，K-90-110、B-90-110、S-90-110 和Ven-90-110 穗長(zhǎng)間也無(wú)顯著差異。 比較同質(zhì)異核不同材料穗長(zhǎng)發(fā)現(xiàn)，S-偃師9 號(hào)和V-偃師9 號(hào)穗長(zhǎng)分別顯著高于S-90-110 和V-90-110，但偃師9 號(hào)保持系、K-偃師9 號(hào)、B-偃師9 號(hào)和Ven-偃師9 號(hào)穗長(zhǎng)分別與90-110 保持系、K-90-110、B-90-110 和Ven-90-110 間無(wú)顯著差異(圖1-B)。 上述結(jié)果表明，兩種類(lèi)型細(xì)胞核存在時(shí)，V 型和Ven 型細(xì)胞質(zhì)對(duì)小麥穗長(zhǎng)均不存在顯著影響，但B 型細(xì)胞質(zhì)均可顯著增加小麥穗長(zhǎng)。 此外，K 型細(xì)胞質(zhì)在非1B/1R 類(lèi)型細(xì)胞核存在時(shí)可顯著增加小麥穗長(zhǎng)，與之相似，S 型細(xì)胞質(zhì)在1B/1R 類(lèi)型細(xì)胞核存在時(shí)同樣可顯著增加穗長(zhǎng)。

不同異源細(xì)胞質(zhì)類(lèi)型偃師9 號(hào)穗下節(jié)間長(zhǎng)均無(wú)顯著差異。 S-90-110 和V-90-110 穗下節(jié)間長(zhǎng)顯著低于90-110 保持系、K-90-110 和B-90-110，且Ven-90-110 穗下節(jié)間長(zhǎng)顯著低于90-110 保持系，但90-110 保持系、K-90-110 和B-90-110 穗下節(jié)間長(zhǎng)無(wú)顯著差異，K-90-110、B-90-110 和Ven-90-110 穗下節(jié)間長(zhǎng)無(wú)顯著差異，S-90-110、V-90-110 和Ven-90-110 穗下節(jié)間長(zhǎng)也無(wú)顯著差異。 比較同質(zhì)異核不同材料穗下節(jié)間長(zhǎng)發(fā)現(xiàn)，相同異源細(xì)胞質(zhì)類(lèi)型偃師9 號(hào)穗下節(jié)間長(zhǎng)均顯著高于相應(yīng)的90-110(圖1-C)。 上述結(jié)果表明，K 型和B 型細(xì)胞質(zhì)無(wú)論是在1B/1R 類(lèi)型細(xì)胞核存在時(shí)還是非1B/1R 類(lèi)型細(xì)胞核存在時(shí)，對(duì)小麥穗下節(jié)間長(zhǎng)均無(wú)顯著影響；而S 型、V 型和Ven 型細(xì)胞質(zhì)在非1B/1R 類(lèi)型細(xì)胞核存在時(shí)可顯著降低小麥穗下節(jié)間長(zhǎng)。

B-偃師9 號(hào)、S-偃師9 號(hào)和V-偃師9 號(hào)分蘗數(shù)顯著高于偃師9 號(hào)保持系、K-偃師9 號(hào)和Ven-偃師9號(hào)，但偃師9 號(hào)保持系、K-偃師9 號(hào)和Ven-偃師9 號(hào)分蘗數(shù)間無(wú)顯著差異，B-偃師9 號(hào)、S-偃師9 號(hào)和V-偃師9 號(hào)分蘗數(shù)間也無(wú)顯著差異。 B-90-110 分蘗數(shù)顯著高于S-90-110 和V-90-110，但90-110 保持系、K-90-110、S-90-110、V-90-110 和Ven-90-110 分蘗數(shù)間無(wú)顯著差異，且90-110 保持系、K-90-110、B-90-110 和Ven-90-110 分蘗數(shù)間也無(wú)顯著差異。 比較同質(zhì)異核不同材料分蘗數(shù)發(fā)現(xiàn)，S-偃師9 號(hào)和V-偃師9 號(hào)分蘗數(shù)分別顯著高于S-90-110 和V-90-110，但偃師9 號(hào)保持系、K-偃師9 號(hào)、B-偃師9 號(hào)和Ven-偃師9 號(hào)分蘗數(shù)分別與90-110 保持系、K-90-110、B-90-110 和Ven-90-110 無(wú)顯著差異(圖1-D)。上述結(jié)果表明，無(wú)論小麥核質(zhì)互作雄性不育系細(xì)胞核為1B/1R 類(lèi)型還是非1B/1R 類(lèi)型，K 型和Ven 型細(xì)胞質(zhì)對(duì)小麥分蘗數(shù)均無(wú)顯著影響，而B(niǎo) 型、S 型和V 型細(xì)胞質(zhì)在1B/1R 類(lèi)型細(xì)胞核存在時(shí)會(huì)顯著增加小麥分蘗數(shù)。

圖1 異源細(xì)胞質(zhì)對(duì)小麥農(nóng)藝性狀的影響Fig.1 Effects of alloplasmic cytoplasm on agronomic traits in wheat

2.2 異源細(xì)胞質(zhì)對(duì)偃師9 號(hào)核型和90-110 核型小麥不育系花粉粒核分裂的影響

用1.5%醋酸洋紅對(duì)不同發(fā)育時(shí)期偃師9 號(hào)核質(zhì)互作雄性不育系及其保持系花粉粒進(jìn)行染色，觀察核分裂特征，結(jié)果顯示:單核早期，偃師9 號(hào)保持系花粉粒核位于花粉粒中央，至單核晚期時(shí)，受中央液泡膨脹影響，花粉粒核被擠壓至花粉粒一側(cè)，此時(shí)期又稱(chēng)單核靠邊期(圖2-a1、a2)；花粉粒進(jìn)一步發(fā)育至二核期，花粉粒內(nèi)有2 個(gè)點(diǎn)狀核，分別是營(yíng)養(yǎng)核和生殖核，隨著生殖核的進(jìn)一步分裂，形成三核期花粉粒，此時(shí)花粉粒內(nèi)有1 個(gè)點(diǎn)狀的營(yíng)養(yǎng)核和2 個(gè)魚(yú)狀的精核(圖2-a3、a4)。與偃師9 號(hào)保持系相比，K-偃師9 號(hào)單核早期和單核晚期花粉粒核型與偃師9 號(hào)保持系的核型一致，發(fā)育正常(圖2-a1、b1、a2、b2)，而至二核期和三核期時(shí)，K-偃師9 號(hào)花粉粒核不能正常分裂，具體表現(xiàn)為二核期核分裂遲緩(圖2-a3、b3)，三核期花粉粒中既有單核又有不正常的二核和三核(非魚(yú)狀精核)(圖2-a4、b4)；B-偃師9 號(hào)花粉粒核在單核早期、單核晚期和二核期發(fā)育正常(圖2-a1、c1、a2、c2、a3、c3)，而三核期花粉粒核不能正常形成1 個(gè)營(yíng)養(yǎng)核和2 個(gè)呈魚(yú)狀的精核(圖2-a4、c4)；S-偃師9 號(hào)單核早期花粉粒呈不規(guī)則球形，且有部分花粉粒表現(xiàn)出無(wú)核現(xiàn)象(圖2-a1、d1)，至單核晚期時(shí)，同一視野下，無(wú)核花粉粒占比明顯增加(圖2-a2、d2)，至二核期和三核期時(shí)，S-偃師9 號(hào)花粉粒均呈無(wú)核的橢圓形或多邊形(圖2-a3、d3、a4、d4)；V-偃師9 號(hào)單核早期和單核晚期花粉粒核發(fā)育正常(圖2-a1、e1、a2、e2)，而二核期至三核期發(fā)育遲緩，具體表現(xiàn)為大多數(shù)花粉粒僅含1 個(gè)核或3 個(gè)點(diǎn)狀核(圖2-a3、e3、a4、e4)；Ven-偃師9 號(hào)花粉粒在單核早期核發(fā)育正常(圖2-a1、f1)，而單核晚期至二核期時(shí)，出現(xiàn)少量無(wú)核花粉粒(圖2-a2、f2、a3、f3)，至三核期，Ven-偃師9 號(hào)花粉粒核異常分裂，部分花粉粒表現(xiàn)出多核現(xiàn)象(圖2-a4、f4)。

用1%KI-I2對(duì)偃師9 號(hào)核質(zhì)互作雄性不育系及其保持系成熟期花粉粒進(jìn)行染色，結(jié)果顯示:偃師9 號(hào)保持系花粉粒因淀粉積累飽滿(mǎn)而呈藍(lán)黑色(圖2-a5)，而K-偃師9 號(hào)、B-偃師9 號(hào)和V-偃師9 號(hào)花粉粒雖呈深藍(lán)色，但因淀粉積累不充分其邊緣未染色或染色較淺，屬于典型的染敗類(lèi)型(圖2-b5、c5、e5)，S-偃師9號(hào)成熟花粉粒因其內(nèi)部不存在淀粉積累，表現(xiàn)為黃褐色，加之核型在單核早期異常，屬于典型的典敗類(lèi)型(圖2-d5)，Ven-偃師9 號(hào)成熟花粉粒少量未著色且形狀不規(guī)則，但仍有部分花粉粒染色呈淺藍(lán)色，且其邊緣未染色，屬于典染雜合型敗育類(lèi)型(圖2-f5)。

用1.5%醋酸洋紅對(duì)不同時(shí)期90-110 核質(zhì)互作雄性不育系及其保持系花粉粒進(jìn)行染色，觀察核分裂特征，結(jié)果顯示:單核早期，90-110 保持系花粉粒核位于花粉粒中央，至單核晚期，因中央液泡膨脹，細(xì)胞核被擠壓至花粉粒的一側(cè)(圖3-a1、a2)，至二核期，花粉粒核分裂為1 個(gè)營(yíng)養(yǎng)核和1 個(gè)生殖核(圖3-a3)，進(jìn)一步發(fā)育到三核期時(shí)，營(yíng)養(yǎng)核不再分裂，生殖核正常有絲分裂形成2 個(gè)魚(yú)狀精核(圖3-a4)。 單核早期，K-90-110 花粉粒與90-110 保持系花粉粒核型一致，發(fā)育正常，至單核晚期時(shí)，出現(xiàn)少量無(wú)核且形狀不規(guī)則的花粉粒(圖3-a1、b1、a2、b2)，且二核期至三核期表現(xiàn)為大多數(shù)花粉粒中僅有1 個(gè)核或2 個(gè)核(圖3-a3、b3、a4、b4)；B-90-110 花粉粒核型在單核早期、單核晚期和二核期與90-110 保持系一致，發(fā)育正常(圖3-a1、c1、a2、c2、a3、c3)，而在三核期不能正常分裂為1 個(gè)營(yíng)養(yǎng)核和2 個(gè)魚(yú)狀的精核(圖3-a4、c4)；S-90-110 花粉粒核型僅在單核早期與90-110 保持系花粉粒核型一致(圖3-a1、d1)，發(fā)育至單核晚期時(shí)，部分花粉粒呈不規(guī)則球形或多邊形(圖3-a2、d2)，二核期出現(xiàn)了少量無(wú)核花粉粒(圖3-a3、d3)，最后至三核期時(shí)，S-90-110花粉粒核分裂異常，花粉粒中既有單核，又有不正常的二核和三核(未形成魚(yú)狀精核)(圖3-a4、d4)；V-90-110 在單核早期和單核晚期花粉粒核發(fā)育正常(圖3-a1、e1、a2、e2)，而二核期至三核期表現(xiàn)為大多數(shù)花粉粒僅含1 個(gè)核或2 個(gè)核(圖3-a3、e3、a4、e4)；Ven-90-110 的花粉粒在單核早期和單核晚期核發(fā)育正常(圖3-a1、f1、a2、f2)，與90-110 保持系花粉粒核型一致，而二核期花粉粒核發(fā)育遲緩，僅有1 個(gè)核(圖3-a3、f3)，至三核期時(shí)，大多數(shù)花粉粒僅含1 個(gè)核、2 個(gè)核或3 個(gè)點(diǎn)狀核(圖3-a4、f4)。

用1%KI-I2對(duì)90-110 核質(zhì)互作雄性不育系及其保持系成熟期花粉粒進(jìn)行染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn):90-110 保持系花粉粒淀粉積累飽滿(mǎn)，故染色呈藍(lán)黑色(圖3-a5)，而K-90-110、B-90-110 和V-90-110 因淀粉積累不充分，染色雖呈藍(lán)黑色，但邊緣未染色或染色較淺，屬于典型的染敗類(lèi)型(圖3-b5、c5、e5)；S-90-110因其內(nèi)部不存在淀粉積累，故染色呈黃褐色，但形狀大小接近正?；ǚ哿?，屬于典型的圓敗類(lèi)型(圖3-d5)；Ven-90-110 成熟期花粉粒中有少量未染色且形狀不規(guī)則，但部分花粉粒染色呈淺藍(lán)色，屬于典染雜合型敗育類(lèi)型(圖3-f5)。

上述結(jié)果表明，S-偃師9 號(hào)花粉粒核分裂異常發(fā)生在單核早期，屬典敗型；Ven-偃師9 號(hào)花粉粒核分裂異常發(fā)生在單核晚期，屬典染雜合型；K-偃師9 號(hào)和V-偃師9 號(hào)花粉粒核分裂異常發(fā)生在二核期，屬染敗型；B-偃師9 號(hào)花粉粒核分裂異常發(fā)生在三核期，屬染敗型。 同時(shí)，K-90-110 與S-90-110 花粉粒核分裂異常發(fā)生在單核晚期，分別屬染敗型和圓敗型；V-90-110 和Ven-90-110 花粉粒核分裂異常均發(fā)生在二核期，V-90-110 屬染敗型，Ven-90-110 屬典染雜合型；B-90-110 花粉粒核分裂異常發(fā)生在三核期，屬染敗型。

2.3 異源細(xì)胞質(zhì)對(duì)偃師9 號(hào)核型和90-110 核型不育系小麥絨氈層降解特征的影響

對(duì)偃師9 號(hào)核質(zhì)互作雄性不育系及其保持系各時(shí)期花藥進(jìn)行切片，觀察絨氈層降解特征。 由圖4 可知，單核早期至三核期，偃師9 號(hào)保持系花藥絨氈層細(xì)胞面積呈遞減趨勢(shì)，且各時(shí)期間大多呈顯著差異(圖5-a1～a4)。 K-偃師9 號(hào)絨氈層面積在單核早期和單核晚期與偃師9 號(hào)保持系無(wú)顯著差異，而在二核期和三核期分別顯著低于和高于偃師9 號(hào)保持系(圖5-b1 ～b4)；同時(shí)，B-偃師9 號(hào)絨氈層面積在單核早期、單核晚期和三核期與偃師9 號(hào)保持系無(wú)顯著差異，而在二核期顯著低于偃師9 號(hào)保持系(圖5-c1 ～c4)；S-偃師9 號(hào)絨氈層面積在單核早期、單核晚期和二核期均與偃師9 號(hào)保持系無(wú)顯著差異，而在三核期顯著高于偃師9 號(hào)保持系(圖5-d1～d4)；V-偃師9 號(hào)絨氈層面積在單核早期顯著低于偃師9 號(hào)保持系，而在單核晚期、二核期和三核期與偃師9 號(hào)保持系無(wú)顯著差異(圖5-e1～e4)；Ven-偃師9 號(hào)絨氈層面積在單核早期和晚期顯著低于偃師9 號(hào)保持系，在二核期與偃師9 號(hào)保持系無(wú)顯著差異，而在三核期顯著高于偃師9 號(hào)保持系(圖5-f1～f4)。

圖2 異源細(xì)胞質(zhì)對(duì)偃師9 號(hào)花粉粒核分裂的影響Fig.2 Effects of alloplasmic cytoplasm on pollen grains division inYanshi9

圖3 異源細(xì)胞質(zhì)對(duì)90-110 花粉粒核分裂的影響Fig.3 Effects of alloplasmic cytoplasm on pollen grains division in 90-110

上述結(jié)果表明，K-偃師9 號(hào)和B-偃師9 號(hào)絨氈層細(xì)胞代謝均在二核期開(kāi)始出現(xiàn)異常，而S-偃師9 號(hào)絨氈層細(xì)胞異常發(fā)生在三核期，具體表現(xiàn)為:K-偃師9號(hào)和B-偃師9 號(hào)均在單核晚期到二核期降解速度加快，K-偃師9 號(hào)絨氈層降解在二核期停滯，而S-偃師9 號(hào)絨氈層降解在三核期停滯。 同時(shí)，V-偃師9 號(hào)和Ven-偃師9 號(hào)絨氈層細(xì)胞則在單核早期開(kāi)始出現(xiàn)代謝異常，具體表現(xiàn)為:V-偃師9 號(hào)和Ven-偃師9 號(hào)絨氈層面積均在單核早期顯著低于偃師9 號(hào)保持系，且絨氈層降解在單核晚期停滯，二核期恢復(fù)，但Ven-偃師9 號(hào)在三核期時(shí)降解不充分，仍有絨氈層細(xì)胞殘留。

圖4 異源細(xì)胞質(zhì)對(duì)偃師9 號(hào)絨氈層降解的影響Fig.4 Effects of alloplasmic cytoplasm on tapetum degradation in Yanshi 9

對(duì)90-110 核質(zhì)互作雄性不育系及其保持系各時(shí)期花藥進(jìn)行切片，觀察絨氈層降解特征。 由圖6 可知，單核早期至三核期，90-110 保持系花藥絨氈層細(xì)胞面積呈遞減趨勢(shì)，且各時(shí)期之間均呈顯著差異(圖7-a1 ～a4)。 K-90-110 絨氈層面積在單核早期、二核期和三核期與90-110 保持系無(wú)顯著差異，僅在單核晚期顯著低于90-110 保持系(圖7-b1 ～b4)；B-90-110 絨氈層面積在單核早期和單核晚期顯著低于90-110 保持系，在二核期和三核期與90-110 保持系無(wú)顯著差異(圖7-c1～c4)；S-90-110 絨氈層面積在單核早期顯著低于90-110 保持系，而在單核晚期、二核期和三核期與90-110 保持系無(wú)顯著差異(圖7-d1 ～d4)；V-90-110 絨氈層面積在單核早期和三核期與90-110 保持系無(wú)顯著差異，而在單核晚期和二核期顯著低于和高于90-110 保持系(圖7-e1 ～e4)；Ven-90-110 絨氈層面積在單核早期和單核晚期顯著低于90-110 保持系，在二核期顯著高于90-110 保持系，而在三核期與90-110 保持系無(wú)顯著差異(圖7-f1～f4)。

上述結(jié)果表明，K-90-110 和V-90-110 絨氈層細(xì)胞代謝均在單核晚期開(kāi)始出現(xiàn)異常，具體表現(xiàn)為:K-90-110 和V-90-110 可能在單核早期到單核晚期降解速度過(guò)快，導(dǎo)致單核晚期絨氈層細(xì)胞面積顯著低于90-110 保持系，而V-90-110 絨氈層細(xì)胞降解可能在單核晚期到二核期間短暫停滯，隨后恢復(fù)，導(dǎo)致其絨氈層面積在二核期顯著高于90-110 保持系。 同時(shí)，B-90-110、S-90-110 和Ven-90-110 絨氈層細(xì)胞均在單核早期出現(xiàn)代謝異常，具體表現(xiàn)為:B-90-110 和Ven-90-110 絨氈層面積均在單核早期和單核晚期顯著低于90-110 保持系，而S-90-110 絨氈層面積僅在單核早期顯著低于90-110 保持系，其余時(shí)期與保持系均無(wú)顯著差異。 此外，Ven-90-110 絨氈層降解可能在單核晚期停滯，二核期后恢復(fù)正常。

3 討論

3.1 異源細(xì)胞質(zhì)對(duì)小麥農(nóng)藝性狀的影響

雄性不育系是實(shí)現(xiàn)作物雜種優(yōu)勢(shì)利用的基礎(chǔ)，除需具備較高的雄性不育率和配合力外，同時(shí)要求綜合農(nóng)藝性狀符合生產(chǎn)需求。 因此研究異源細(xì)胞質(zhì)對(duì)雄性不育系農(nóng)藝性狀的影響對(duì)篩選和創(chuàng)制農(nóng)藝性狀優(yōu)良的雄性不育系具有重要意義[10]。

本研究以2 套同核異質(zhì)雄性不育系為材料，探究同質(zhì)異核雄性不育系的遺傳效應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)K 型、B型、S 型、V 型和Ven 型細(xì)胞質(zhì)在不同類(lèi)型細(xì)胞核(1B/1R 類(lèi)型和非1B/1R 類(lèi)型)存在時(shí)對(duì)小麥不同農(nóng)藝性狀存在不同程度的影響。 上述研究結(jié)果與易自力等[24]以同質(zhì)異核小麥為材料，研究小麥屬和山羊草屬的細(xì)胞質(zhì)遺傳效應(yīng)的結(jié)論基本一致，說(shuō)明在不同核背景下同一異源細(xì)胞質(zhì)的遺傳效應(yīng)不同。 關(guān)于不同異源細(xì)胞質(zhì)在相同核背景下對(duì)普通小麥主要農(nóng)藝性狀的影響，徐乃瑜等[25]已進(jìn)行了較為全面和系統(tǒng)的研究，其結(jié)果發(fā)現(xiàn):中國(guó)春細(xì)胞核(非1B/1R 類(lèi)型)存在時(shí)，B型和Ven 型細(xì)胞質(zhì)可促進(jìn)植株高度和分蘗數(shù)增加，但與對(duì)照相比無(wú)明顯差異，同時(shí)對(duì)穗下節(jié)間長(zhǎng)和穗長(zhǎng)存在負(fù)調(diào)控效應(yīng)；與對(duì)照相比K 型細(xì)胞質(zhì)可降低株高、縮短穗下節(jié)長(zhǎng)和增加有效分蘗數(shù)，但無(wú)明顯差異，而對(duì)穗長(zhǎng)存在極顯著的負(fù)調(diào)控效應(yīng)；V 型細(xì)胞質(zhì)可極顯著降低株高和縮短穗下節(jié)間長(zhǎng)與穗長(zhǎng)，同時(shí)也減少有效分蘗數(shù)，但與對(duì)照相比無(wú)顯著差異。 上述部分研究結(jié)果在本研究中也得到了證實(shí)，對(duì)同核(非1B/1R 類(lèi)型)異質(zhì)核質(zhì)互作雄性不育系農(nóng)藝性狀調(diào)查及統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn):在非1B/1R 類(lèi)型細(xì)胞核存在時(shí)，K 型細(xì)胞質(zhì)對(duì)穗下節(jié)間比，B 型、V 型和Ven 型細(xì)胞質(zhì)對(duì)分蘗數(shù)的影響與徐乃瑜等[25]的研究結(jié)果完全一致，表明在同一核背景下不同異源細(xì)胞質(zhì)對(duì)小麥不同農(nóng)藝性狀的影響程度不同。 表明同質(zhì)異核和同核異質(zhì)材料不同農(nóng)藝性狀的遺傳效應(yīng)不同，核質(zhì)互作雄性不育系各農(nóng)藝性狀的遺傳效應(yīng)是核質(zhì)相互作用的結(jié)果。 該結(jié)論在水稻[26]、葉用芥菜[27]和玉米[28]等作物中也得到了證實(shí)。

與此同時(shí)，在本研究中非1B/1R 類(lèi)型細(xì)胞核存在時(shí)，K 型和V 型細(xì)胞質(zhì)對(duì)株高，B 型、V 型和Ven 型細(xì)胞質(zhì)對(duì)穗下節(jié)間長(zhǎng)的影響，與徐乃瑜等[25]研究發(fā)現(xiàn)的影響趨勢(shì)相同，但顯著性均存在不同程度的差異。 此外，非1B/1R 類(lèi)型細(xì)胞核存在時(shí)，B 型和Ven 型細(xì)胞質(zhì)對(duì)株高，K 型、B 型、V 型和Ven 型細(xì)胞質(zhì)對(duì)穗長(zhǎng)，K型細(xì)胞質(zhì)對(duì)分蘗數(shù)的影響，與前人研究結(jié)果不一致。導(dǎo)致上述顯著性和影響趨勢(shì)差異的原因可能是試驗(yàn)材料及播種環(huán)境(地域及氣候)不同，說(shuō)明同一異源細(xì)胞質(zhì)在不同遺傳背景和環(huán)境條件下可能對(duì)同一性狀產(chǎn)生不同程度的影響。 本研究分析了異源細(xì)胞質(zhì)對(duì)小麥株高、穗長(zhǎng)、穗下節(jié)間長(zhǎng)和分蘗數(shù)的影響，至于異源細(xì)胞質(zhì)對(duì)其他農(nóng)藝性狀的影響以及不同細(xì)胞核1B/1R 類(lèi)型、細(xì)胞質(zhì)和環(huán)境(如:光照、溫度、濕度等)之間的互作模式對(duì)農(nóng)藝性狀的影響還有待進(jìn)一步研究。

3.2 異源細(xì)胞質(zhì)對(duì)小麥花粉粒核分裂的影響

前人研究表明，小麥花粉粒發(fā)生敗育的時(shí)期主要有減數(shù)分裂期、單核早期、單核晚期、二核期和三核期等，進(jìn)一步研究表明，敗育發(fā)生的時(shí)期越早，花粉粒敗育越徹底，雄性不育率越高[29]。 目前，關(guān)于來(lái)自山羊草屬不同種的異源細(xì)胞質(zhì)對(duì)小麥花粉粒核分裂影響的研究已有報(bào)道。 李傳友等[30]研究發(fā)現(xiàn)K 型不育系花粉核分裂異常發(fā)生在二核期或三核期，屬淺染敗型或深染敗型；Ven 型不育系花粉核分裂異常發(fā)生在單核晚期至二核期，屬圓敗型或淺染敗型。 王小利等[31]在對(duì)兩類(lèi)二角山羊草細(xì)胞質(zhì)小麥雄性不育系的研究發(fā)現(xiàn)B 型核質(zhì)互作雄性不育系在1B/1R 類(lèi)型細(xì)胞核和非1B/1R 類(lèi)型細(xì)胞核存在時(shí)花粉粒核分裂異常均發(fā)生在三核期，屬染敗型和圓敗型。 本研究中，K 型、B 型和Ven 型核質(zhì)互作不育系花粉粒核分裂發(fā)生異常的時(shí)期和花粉敗育類(lèi)型，與前人研究結(jié)果基本一致。 本研究以2 套同核異質(zhì)小麥為材料，較為系統(tǒng)地研究了K 型、B 型、S 型、V 型和Ven 型細(xì)胞質(zhì)對(duì)小麥花粉粒核分裂的影響，在印證前人結(jié)論的同時(shí)發(fā)現(xiàn)不同異源細(xì)胞質(zhì)在相同核背景下對(duì)不育系花粉粒核分裂的影響不同，這與李鳳霞等[32]對(duì)煙草2 種同核異質(zhì)不育系小孢子發(fā)育進(jìn)行細(xì)胞學(xué)觀察后得出的結(jié)論一致。

本研究還發(fā)現(xiàn)同一異源細(xì)胞質(zhì)在不同核背景下對(duì)小麥花粉粒核分裂及敗育類(lèi)型的影響不完全相同，如在1B/1R 和非1B/1R 類(lèi)型細(xì)胞核存在時(shí)，K 型、S 型、V 型和Ven 型核質(zhì)互作雄性不育系花粉粒核分裂發(fā)生異常的時(shí)期和敗育類(lèi)型均存在不同程度的差異。 因此，可將上述5 種小麥核質(zhì)互作雄性不育系分為以下三大類(lèi)型:1)花粉粒核分裂異常發(fā)生的時(shí)期以及敗育類(lèi)型與細(xì)胞核1B/1R 類(lèi)型(1B/1R 類(lèi)型和非1B/1R類(lèi)型)無(wú)關(guān)，包括B 型和V 型；2)花粉粒核分裂異常發(fā)生的時(shí)期與細(xì)胞核1B/1R 類(lèi)型(1B/1R 類(lèi)型和非1B/1R 類(lèi)型)有關(guān)，但敗育類(lèi)型與細(xì)胞核1B/1R 類(lèi)型(1B/1R 類(lèi)型和非1B/1R 類(lèi)型)無(wú)關(guān)，包括K 型和Ven 型；3)花粉粒核分裂異常發(fā)生的時(shí)期以及敗育類(lèi)型均與細(xì)胞核1B/1R 類(lèi)型(1B/1R 類(lèi)型和非1B/1R 類(lèi)型)有關(guān)，包括S 型。 綜上，同核異質(zhì)與同質(zhì)異核材料的敗育機(jī)理不完全相同，核質(zhì)互作雄性不育系的花粉敗育與異源細(xì)胞質(zhì)和不同1B/1R 類(lèi)型細(xì)胞核的互作模式有關(guān)，即核質(zhì)互作雄性不育系的花粉敗育是核質(zhì)互作的結(jié)果，與韓笑冰等[33]對(duì)小麥不同細(xì)胞質(zhì)不育系花粉敗育進(jìn)行細(xì)胞學(xué)比較研究后得出的結(jié)論完全一致。

3.3 異源細(xì)胞質(zhì)對(duì)小麥絨氈層降解特征的影響

圖7 異源細(xì)胞質(zhì)對(duì)90-110 絨氈層降解的影響(石蠟切片)Fig.7 Effects of alloplasmic cytoplasm on tapetum degradation in 90-110 (paraffin section)

絨氈層是小麥花藥壁最內(nèi)層細(xì)胞，其在降解過(guò)程中向藥室釋放大量用于花粉粒發(fā)育的結(jié)構(gòu)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[34-36]。 張鵬飛等[12]對(duì)小麥S 型1376 不育系及其保持系絨氈層發(fā)育過(guò)程進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，絨氈層降解代謝發(fā)生紊亂，致使花粉粒發(fā)育過(guò)程中物質(zhì)供應(yīng)不足，使花粉粒核分裂出現(xiàn)異常，這是導(dǎo)致花粉敗育的主要原因。 上述結(jié)果在本研究中也得到了證實(shí)，如2 套核質(zhì)互作雄性不育系不同時(shí)期花藥絨氈層細(xì)胞降解均與其對(duì)應(yīng)保持系存在不同程度的差異，而其花粉粒核分裂均在不同發(fā)育階段出現(xiàn)不同程度的異常。 花藥絨氈層降解被認(rèn)為是一種典型的細(xì)胞程序化死亡過(guò)程，劉子涵等[37]研究表明，小麥絨氈層細(xì)胞程序化死亡的延遲啟動(dòng)是花粉敗育的細(xì)胞學(xué)原因。 這一結(jié)論在本研究中也得到了證實(shí)，如K-偃師9 號(hào)絨氈層降解在二核期停滯，與偃師9 號(hào)保持系絨氈層降解相比存在顯著延遲，導(dǎo)致其花粉粒核分裂在二核期發(fā)生異常；V-偃師9 號(hào)和Ven-偃師9 號(hào)絨氈層降解在單核晚期停滯，其花粉粒核分裂異常分別發(fā)生在二核期和單核晚期。 此外，本研究還發(fā)現(xiàn)S-偃師9 號(hào)絨氈層降解異常發(fā)生在三核期，然而其花粉粒異常分裂發(fā)生在單核早期，表明可能另有原因?qū)е铝撕朔至旬惓！?Liu 等[38]對(duì)甘藍(lán)型油菜核質(zhì)互作雄性不育系進(jìn)行細(xì)胞學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)花藥絨氈層和中層細(xì)胞過(guò)早的細(xì)胞程序化死亡是花粉敗育的主要原因，指出絨氈層異常降解并非花粉敗育的唯一原因，至于本研究中核質(zhì)互作雄性不育系S-偃師9 號(hào)花粉核分裂異常是否與花藥中層細(xì)胞降解異常有關(guān)還有待進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)同質(zhì)異核不育系的絨氈層降解特征不同，具體表現(xiàn)為K 型、B 型、S 型、V 型和Ven 型細(xì)胞質(zhì)在1B/1R 類(lèi)型細(xì)胞核和非1B/1R 類(lèi)型細(xì)胞核存在時(shí)，不育系絨氈層降解特征均存在不同程度的差異。 表明核質(zhì)互作雄性不育系絨氈層細(xì)胞代謝紊亂與異源細(xì)胞質(zhì)和不同1B/1R 類(lèi)型細(xì)胞核的互作模式有關(guān)，即核質(zhì)互作雄性不育系的絨氈層降解代謝異?？赡苁呛速|(zhì)互作的結(jié)果。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，異源細(xì)胞質(zhì)分別與1B/1R 類(lèi)型細(xì)胞核和非1B/1R 類(lèi)型細(xì)胞核間存在互作模式的差異，不同程度地影響核質(zhì)互作雄性不育系的農(nóng)藝性狀，同時(shí)引發(fā)花藥絨氈層細(xì)胞差異性代謝異常，最終導(dǎo)致花粉粒核分裂異常，產(chǎn)生不同的敗育類(lèi)型。 本研究結(jié)果為進(jìn)一步揭示小麥核質(zhì)互作雄性不育機(jī)理和更好地利用異源核質(zhì)互作雄性不育系提供了堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)。