菲對蒿柳生理生化特性的影響

李 霞 馬曉東 程運河 翟飛飛 劉俊祥 孫振元 韓 蕾

(1中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所/國家林業(yè)局林木培育重點實驗室，北京 100091；2菏澤學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院(牡丹學(xué)院)，山東 菏澤 274000；3北京市林業(yè)果樹科學(xué)研究院，北京 100093；4 河南理工大學(xué)建筑與藝術(shù)設(shè)計學(xué)院，河南 焦作 454000)

多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)主要來自工業(yè)生產(chǎn)(如焦炭和煤焦油的生產(chǎn)、原油及其衍生物的精煉和分餾等)以及有機物的不完全燃燒等過程，廣泛分布于大氣、土壤和水體中[1]。 PAHs 具有誘變和致畸特性[2-3]，可被植物或動物吸收，進入食物鏈威脅人類健康。 在中國東部109 個農(nóng)業(yè)土壤點收集的表層土壤樣本中，PAHs 的總濃度介于8.8～3 880 μg·kg-1之間[4]。 菲是三環(huán)的PAHs，因其在環(huán)境中濃度較高，且是美國環(huán)保局選定的16 種PAHs 優(yōu)先污染物之一，已成為植物與PAHs 互作機制研究的代表[5]。 植物可以通過直接吸收[6]、根系分泌物降解[7]及與微生物互作[8]等方式來降解PAHs。 與草本植物相比，木本植物具有生物量大、生命周期長、根系空間分布更廣等優(yōu)勢。 與生長較快的洋白蠟(Fraxinus pennsylvanica)、 楊樹(Populusdeltoides×P. nigraDN 34)相比，黑柳(Salix nigra)對土壤中PAHs 的降解率更高[9]。 而蒿柳(Salix viminalis)對土壤中PAHs 也具有較好的降解效應(yīng)。 研究表明，將蒿柳種植于PAHs 含量較高的雜酚油土中，10 周后，蒽、熒蒽、芘和苯并[a]芘的含量分別降低67%、79%、77%和43%，而未種植蒿柳土壤中，熒蒽和芘的濃度分別降低35%和19%，蒽和苯并[a]芘未降解[10]。

植物長期種植于PAHs 污染土壤中，其生長會受到抑制，高濃度PAHs 會導(dǎo)致植物細胞壞死，從而影響植物對環(huán)境的修復(fù)效應(yīng)。 土壤中芴濃度超過一定閾值時，小麥(Triticunt aestivum)、紫花苜蓿(Medicago sativa)和向日葵(Helianthus annuus)的株高、干重和鮮重均受到抑制[11]。 Alkio 等[12]將擬南芥(Arabidopsis thaliana)移植到含菲的培養(yǎng)基上，6 h 后就檢測到死細胞，12 h 后50%的植株死亡。 因此，研究PAHs 對植物生理生化的影響機制非常重要。 光合作用是植物代謝的能量來源，光合器官的損傷會影響植物細胞的生理活動，抑制植物生長。 對番茄(Lycopersicon esculentum)葉片噴施熒蒽，30d后，氣孔導(dǎo)度( stomatal conductance，Gs)、PS Ⅱ的最大光化學(xué)效率(maximal photochemical efficiency，F(xiàn)v/Fm)、葉綠素a(chlorophyll a，Chl a)和葉綠素b(chlorophyll b，Chl b)均顯著降低[13]。 Jin 等[14]將黃瓜(Cucumis sativus)葉片浸在菲溶液中4 h，發(fā)現(xiàn)PSⅡ活性(photosystem Ⅱactivity，PSⅡactivity)和Fv/Fm顯著降低，電子傳遞速率受到抑制。 滲透調(diào)節(jié)是植物抵御逆境的重要機制之一。 而關(guān)于PAHs 對光合及滲透調(diào)節(jié)影響的研究多基于草本植物，缺乏對木本植物的研究，尤其對蒿柳的影響鮮見報道。

本研究以蒿柳為試驗材料，通過水培的方式，研究不同濃度菲處理對蒿柳株高及生理的影響，在此基礎(chǔ)上選用對植物生長具有顯著抑制的最低濃度進行16 d的菲處理，從氣體交換參數(shù)、光合色素、Rubisco 活性、葉綠素熒光參數(shù)及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的變化分析菲對蒿柳光合特性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響機制，旨在為探究PAHs 對植物的毒害機制及加強植物的修復(fù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

于2019年3月中旬剪取種植于中國林業(yè)科學(xué)院試驗基地蒿柳(引種于中科院沈陽生態(tài)所植物園)同一無性系的一年生枝條，直徑1.0±0.2 cm，在水中剪成10 cm 長插條，扦插在灰色塑料箱(容量20 L)內(nèi)，用PVC 板支撐并用海綿固定。 用自來水培養(yǎng)2 周后保留一個枝芽，改為用1/2 Hoagland′s 營養(yǎng)液培養(yǎng)，每3 d 換一次營養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)8 周后，用于后續(xù)試驗。供試有機污染物為菲(純度＞97%)，25℃純水中溶解度為7.3 μmol·L-1。

1.2 試驗設(shè)計

將長勢一致的蒿柳移入玻璃容器中適應(yīng)1 周后再進行后續(xù)處理。 先用甲醇溶解菲，再與蒸餾水配制的改良1/2 Hoagland′s 營養(yǎng)液混合，制成菲濃度分別為0.2、0.5、1.0、1.2 mg·L-1的處理液，以未加菲的蒸餾水配制的改良1/2 Hoagland′s 營養(yǎng)液為對照(CK)，pH 值6.0。 營養(yǎng)液(CK 與處理)中甲醇濃度為0.05%，甲醇濃度小于0.1%的營養(yǎng)液對植物根系生長無影響[15]。 容器外壁用錫箔紙包裹，保持根系和溶液避光且防止菲的光降解。 每2 d 更換一次處理液，每4 d 隨機交換容器在溫室中的位置，自然光照，對培養(yǎng)液全程通氧。 于試驗第0 和第8 天測定蒿柳的株高，第8 天測定根系活力以及根系和葉片的電導(dǎo)率。

根據(jù)前期試驗結(jié)果，選擇對植物生長有顯著抑制的最低濃度，處理方法同上。 于試驗第0、第4、第8、第12 和第16 天測定光合色素、脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)含量以及Rubisco 活性；第5、第10 和第15 天測定植株氣體交換參數(shù)和葉綠素熒光參數(shù)。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 株高、電導(dǎo)率和根系活力的測定 隨機選取4組植株作為4 個重復(fù)，每組3 株，用直尺測量植株基部至頂梢的長度。 葉片電導(dǎo)率取植株中上部葉片，根系電導(dǎo)率取中下部分，采用高俊鳳[16]的方法測定。 根系活力取根系中下部分，采用TTC 法測定(根系活力試劑盒，北京雷根生物公司生產(chǎn))。

1.3.2 氣體交換參數(shù)的測定 CK 與處理各設(shè)置4 個重復(fù)。 選取蒿柳上部第5 片完全展開葉，采用Li-Cor 6400 便攜式光合測定儀(LI-COR，USA)進行氣體交換參數(shù)測定，包括凈光合速率(net photosynthetic rate，Pn)、胞間CO2濃度(inter cellular CO2concentration，Ci)、Gs 和蒸騰速率(transpiration rate，Tr)。 測定前，植株先在光下活化30 min，測定時控制葉室CO2濃度為400 μmol·mol-1，紅藍光源光強為1 200 μmol·m-2·s-1，溫度25℃，葉室內(nèi)葉片長度為3 cm，葉室兩頭及中間葉寬用直尺測定，葉片面積按2 個梯形計算。 然后將實際葉片面積輸入Li-Cor 6400 的輸出文件，自動重新計算各參數(shù)。

1.3.3 光合色素含量和Rubisco 活性測定 CK 與處理各設(shè)計3 個重復(fù)。 取蒿柳中上部葉片，去除主脈后剪成0.3 cm×0.3 cm 大小。 稱0.2 g 葉片置于試管中，用80%丙酮溶液定容至20 mL，黑暗浸提48 h 后，測定663、645 和470 nm 波長處的吸光度值，并計算Chl a、Chl b 和類胡蘿卜素(carotenoid，Car)含量[17]。取蒿柳中上部葉片剪碎混勻，放入液氮迅速冷凍，冷凍研磨后稱取0.1 g，加入1 mL 提取液(Tris-鹽酸，KCl，EDTA)，冰浴勻漿后超聲破碎，然后4℃、8 000×g離心10 min，取上清，測定340 nm 波長處的吸光度值，計算Rubisco 活性[18]。

1.3.4 葉綠素熒光參數(shù)測定 CK 與處理各設(shè)置4 個重復(fù)。 選取蒿柳上部第5 片完全展開葉，使用FluorPen FP100 手持式葉綠素熒光儀(北京澳作生態(tài)儀器有限公司)，在葉片暗適應(yīng)30 min 后讀取蒿柳中上部葉片的葉綠素熒光參數(shù)，包括Fv/Fm、PSⅡ潛在活性(PSⅡpotential activity，F(xiàn)v/F0)、非光化學(xué)淬滅系數(shù)(non photochemical coefficient，NPQ)和光化學(xué)淬滅系數(shù)(photochemical coefficient，qP)。

1.3.5 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的測定 CK 與處理各設(shè)置3個重復(fù)，取蒿柳中上部葉片剪碎混勻，放入液氮迅速冷凍，冷凍研磨后稱量。 脯氨酸含量測定采用酸性茚三酮法[19]，可溶性糖含量測定采用蒽酮比色法[20]，可溶性蛋白質(zhì)含量測定采用考馬斯亮藍法[21]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

生理指標數(shù)據(jù)采用Excel 2016 統(tǒng)計整理，采用GraphPad Prism Version7.0(GraphPad software，La Jolla，CA，USA)作圖，并進行單因素、雙因素方差分析和多重比較。 試驗數(shù)據(jù)均為重復(fù)測定的平均值±標準誤差。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度菲處理對蒿柳株高及生理的影響

由表1 可知，與CK 相比，0.2 和0.5 mg·L-1菲處理對蒿柳的株高增長量、根系活力及電導(dǎo)率均無顯著影響；1.0 和1.2 mg·L-1菲處理株高增長量、根系活力及電導(dǎo)率均具有顯著影響。 1.0 與1.2 mg·L-1菲處理之間的根系活力和根系電導(dǎo)率差異顯著，株高增長量和葉片電導(dǎo)率無顯著差異。 表明菲濃度≥1.0 mg·L-1時，蒿柳生長受到抑制，且對生理指標具有顯著影響，后續(xù)選用1.0 mg·L-1菲濃度進行試驗。

表1 不同濃度菲對蒿柳株高及生理的影響(第8 天)Table 1 Effects of different phenanthrene concentration on relative height and physiology of Salix viminalis (at 8th day)

2.2 菲脅迫下蒿柳葉片光合特性的變化

2.2.1 菲脅迫下蒿柳氣體交換參數(shù)的變化 由圖1可知，菲脅迫下，蒿柳葉片的Pn、Gs、Ci 和Tr 整體較CK 顯著或極顯著降低。 與CK 相比，Pn、Gs、Ci 和Tr在第5、第10 天的降幅較大，第5 天分別降低23.0%、33.3%、3.5%、25.7%，第10 天分別降低14.1%、47.0%、19.6%和35.5%。

2.2.2 菲脅迫下蒿柳光合色素和Rubisco 活性的變化 由圖2 可知，菲脅迫下，蒿柳葉片的Chl a 和Chl b整體較CK 降低，且Chl a 在處理第12 天，Chl b 在處理第8 天較CK 顯著降低；Car 含量與CK 差異不顯著；Rubisco 活性在整個處理過程中均極顯著低于CK，在處理第4、第8、第12 和第16 天分別為CK 的65.7%、84.6%、85.0%和85.7%。

2.2.3 菲脅迫下蒿柳葉綠素熒光參數(shù)的變化 由圖3 可知，與CK 相比，菲脅迫后蒿柳葉片的Fv/Fm和Fv/F0均未發(fā)生顯著變化；NPQ 僅在第5 天時較CK顯著降低，為CK 的82.2%；qP 則一直顯著或極顯著低于CK，在處理第5、第10 和第15 天分別為CK的46.4%、86.5%和80.5%。

圖1 菲脅迫下蒿柳Pn、Ci、Gs 和Tr 的變化Fig.1 Changes of Pn，Ci，Gs and Tr of Salix viminalis under phenanthrene treatment

2.3 菲脅迫下蒿柳葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的變化

圖3 菲脅迫下蒿柳Fv/Fm、Fv/F0、qP 和NPQ 的變化Fig.3 Changes of Fv/Fm， Fv/F0，qP and NPQ of Salix viminalis under phenanthrene treatment

滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成，是植物抵御逆境的生理機制之一。 菲脅迫下，蒿柳葉片的脯氨酸含量在第8、第12、第16 天較CK 極顯著上升，分別為CK 的1.2、1.15和1.17 倍(圖4-A)；可溶性糖含量在處理第4 和第8天極顯著上升，為CK 的1.14 和1.21 倍(圖4-B)；可溶性蛋白質(zhì)含量則與CK 均無顯著差異(圖4-C)。

圖4 菲脅迫下蒿柳滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的變化Fig.4 Changes of osmotic regulators of Salix viminalis under phenanthrene treatment

3 討論

3.1 不同濃度菲對蒿柳的影響

在環(huán)境脅迫下，植物體生長和生理遭受傷害都有一定的濃度閾值。 土壤中芘濃度大于50 mg·kg-1時，菠菜苗期的株高、根和莖葉的鮮重顯著降低，芘濃度大于100 mg·kg-1時，收獲期的根和莖葉干重受到抑制[22]。 本研究通過分析不同濃度菲處理下蒿柳株高、根系活力、根系電導(dǎo)率和葉片電導(dǎo)率發(fā)現(xiàn)，1.0 mg·L-1菲處理開始使蒿柳根系膜透性增大，根系活力受到抑制，株高增長量顯著下降，因此選用該濃度研究菲對蒿柳光合特性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響機理。

3.2 菲對蒿柳光合特性的影響

光合速率的降低是多種因素共同作用的結(jié)果，包括氣孔和非氣孔因素。 氣孔的開度對控制植物和環(huán)境之間CO2、O2和H2O 的流動至關(guān)重要。 本研究中菲脅迫使蒿柳葉片的Gs 和Ci 降低，影響其CO2吸收。 有研究發(fā)現(xiàn)紫花苜蓿吸收菲后，菲主要分布在氣孔保衛(wèi)細胞及附近的表皮細胞[23]，但是否由于保衛(wèi)細胞和副衛(wèi)細胞失水、膨壓降低，造成氣孔的開閉受到影響[24]，尚待進一步研究。 此外，蒿柳葉片Gs 和Tr 降低，可以減少水分散失，提高保水能力，是植物對不利環(huán)境的一種適應(yīng)性策略，但CO2輸入的減少對光合作用是不利的。

光合作用包括光反應(yīng)和暗反應(yīng)，光合色素是植物光反應(yīng)的重要部分，光合色素通常包括Chl a、Chl b 和Car。 Chl a 可將光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能，Chl b 則收集與傳遞光能，過量的光能會損傷光合系統(tǒng)，Car 可快速淬滅激發(fā)態(tài)葉綠素，發(fā)揮光保護劑的作用。 研究表明，PAHs 可以破壞植物的光合色素，對豌豆進行1 mg·L-1的熒蒽處理，25 d 后其光合色素含量顯著降低[25]。 本研究中菲脅迫下蒿柳葉片的Chl a 和Chl b均在處理中期低于CK，說明菲對Chl a 和Chl b 具有一定的影響，導(dǎo)致植物體對光能的吸收能力有所下降。CO2同化酶Rubisco 是光合作用碳反應(yīng)的主要催化劑[26-27]，卡爾文循環(huán)的第一步羧化反應(yīng)由葉綠體中Rubisco 催化完成。 Huang 等[28]研究表明，蒽抑制了浮萍(Lemna gibba)的碳固定，從而降低了光合作用。本研究結(jié)果與之類似，菲脅迫后，蒿柳葉片的Rubisco活性均顯著低于CK，導(dǎo)致CO2同化受到抑制，說明Rubisco 活性降低，從而碳固定受到影響，導(dǎo)致菲脅迫后光合速率下降。

Fv/Fm是指原初光化學(xué)反應(yīng)的最大量子產(chǎn)額，通常用來衡量PSⅡ利用光能的能力。Fv/F0代表植物受脅迫后PSⅡ潛在活性的變化。 NPQ 反映PSⅡ反應(yīng)中心對天線色素吸收過量光能后的熱耗散能力及光合機構(gòu)的損傷程度[29]。 Jajoo 等[30]將擬南芥種植于土壤和蛭石(1 ∶1)中，分別用25 μmol·L-1的萘、蒽、芘每天澆灌，5 周后，植物生長受到抑制，PSⅡ活性顯著降低。 本研究與其結(jié)果不同，1.0 mg·L-1菲脅迫下，雖然蒿柳生長受到抑制，但其Fv/Fm和Fv/F0均無顯著變化，說明PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)化效率和潛在活性未受到影響，這與PAHs 的濃度以及植物的種類有關(guān)，說明蒿柳在一定濃度的菲脅迫下，首先受影響的不是PSⅡ潛在活性。 NPQ 在菲脅迫第5 天較CK 顯著降低，之后與CK 相比差異均不顯著，說明蒿柳在菲脅迫初期，通過熱耗散減輕過剩光能傷害的能力降低，導(dǎo)致其容易受到高溫等逆境的傷害。 光化學(xué)淬滅反映了PSⅡ原初電子受體QA 的氧化還原狀態(tài)和PSⅡ開放中心的開放程度，其系數(shù)qP 可以反映PSⅡ的電子傳遞活性的大小[29]。 qP 在菲脅迫第5 和第15 天顯著低于CK，說明類囊體膜中光化學(xué)電子傳遞的份額有顯著變化，這與Kummerová 等[25]和Jin 等[14]的研究結(jié)果一致。Duxbury 等[31]利用14C 標記PAHs，發(fā)現(xiàn)PAHs 可在植物的類囊體膜上積累，從而影響葉綠體的有序排列，干擾電子傳遞。 此外，PAHs 轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物，特別是醌類化合物，可能影響PSⅡ和PSI 的電子運輸[32]。 本研究中，菲抑制了PSⅡ電子傳遞活性，但其影響機制尚不清楚，應(yīng)結(jié)合菲在植物體內(nèi)的分布和代謝做進一步研究。

3.3 菲對蒿柳滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累是植物提高自身耐性的一個重要途徑，不同植物其滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的響應(yīng)機制不同。如秋茄[Kandelia candel(L.)Druce]葉片的可溶性糖含量隨著PAHs 濃度的增加而增加[33]，而擬南芥葉片的可溶性糖含量則隨著蒽脅迫濃度的增加而減少[34]。Sivaram 等[35]通過代謝組學(xué)研究得出芘可誘導(dǎo)玉米葉片的脯氨酸含量顯著上升。 本研究中，菲脅迫后蒿柳葉片的可溶性蛋白質(zhì)含量與CK 相比無顯著差異，而脯氨酸和可溶性糖含量顯著增加，說明蒿柳可以通過這2 種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)抵御菲脅迫，增加細胞內(nèi)的溶質(zhì)濃度，調(diào)節(jié)滲透勢，增強其適應(yīng)性，其中可溶性糖主要參與對菲的早期響應(yīng)。

4 結(jié)論

隨著菲濃度的增加，蒿柳的生長和根系活力受到抑制，膜透性增大，表明菲對蒿柳具有毒害作用。 菲濃度為1.0 mg·L-1時，蒿柳葉片的光合能力降低。 菲脅迫使qP 顯著下降，PSⅡ的電子傳遞活性受到抑制，光反應(yīng)受到影響；同時Gs 和Ci 下降、Rubisco 活性顯著降低，CO2供應(yīng)和同化減少，暗反應(yīng)受到抑制，導(dǎo)致葉片光合作用下降。 此外，脯氨酸和可溶性糖是抵御菲脅迫的重要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。 本研究為探究菲對木本植物的毒害機制奠定了基礎(chǔ)，今后還需進一步研究菲抑制Rubisco 活性的原因，探究是否由于菲在植物體內(nèi)發(fā)生了代謝，改變了胞內(nèi)環(huán)境，從而影響了該酶的激活。