依達(dá)拉奉對(duì)慢性阻塞性肺疾病模型大鼠的干預(yù)作用

楊玲玲 石廣軍

慢性阻塞性肺疾病(以下簡(jiǎn)稱“慢阻肺”)是以氣流受限為主要病理特征并呈進(jìn)行性發(fā)展的常見肺部疾病，目前對(duì)于該病的病因與發(fā)病機(jī)制尚不明確，臨床普遍認(rèn)為該病的發(fā)生與香煙、煙霧等有害氣體或有害顆粒吸入所致的肺部異常炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[1]，而在此基礎(chǔ)上肺部的抗氧化、抗蛋白酶功能的失衡以及慢性炎癥的發(fā)展是慢阻肺病情進(jìn)展的主要原因[2-3]。依達(dá)拉奉是臨床較為常用的強(qiáng)效自由基清除劑，廣泛用于缺血性腦卒中后、腦組織的保護(hù)治療，且大量研究表明依達(dá)拉奉還具有一定的抗炎作用，并在治療多種肺損傷疾病中表現(xiàn)出了較好的臨床效果。由于依達(dá)拉奉具有抗氧化和抗炎的作用，近年來(lái)臨床在采用依達(dá)拉奉治療慢阻肺患者中也表現(xiàn)出了較好的有效性和安全性，鑒于此本研究旨在通過對(duì)慢阻肺模型大鼠進(jìn)行不同劑量的依達(dá)拉奉治療，為進(jìn)一步探討依達(dá)拉奉在治療慢阻肺中的作用機(jī)制提供依據(jù)。

資料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

購(gòu)取120只8周齡健康雄性SD大鼠，體重(200±20)g，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、慢阻肺模型組、低劑量依達(dá)拉奉組和高劑量依達(dá)拉奉組，每組各30只，雌雄各半。所有大鼠均于恒溫動(dòng)物房?jī)?nèi)飼養(yǎng)1周，排除體重不符、實(shí)驗(yàn)過程中傷亡的大鼠，實(shí)際納入研究大鼠72只，每組各18只，雌雄各半。

二、方法

1 造模方法 被動(dòng)吸煙造模： 采用氣管內(nèi)滴入脂多糖聯(lián)合被動(dòng)吸煙法對(duì)慢阻肺模型組、低劑量依達(dá)拉奉組和高劑量依達(dá)拉奉組大鼠進(jìn)行造模，操作方法：第1d和第14d采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后進(jìn)行固定，以壓舌板壓住舌根，以彎頭灌胃針輕輕插入大鼠氣管，以感覺觸到氣管軟骨環(huán)，且觀察大鼠呼吸音增粗為插入成功標(biāo)準(zhǔn)，隨后緩慢注入200μg/200mL脂多糖200μL，聽診見濕羅音后將固定大鼠連同固定板豎起，輕微左右搖晃3～5次，使注入的脂多糖在左右兩肺盡可能的均勻分布，完成后取下大鼠單獨(dú)飼養(yǎng)，待意識(shí)、行為、活動(dòng)完全恢復(fù)后放回原飼養(yǎng)籠中。

造模過程： 注射脂多糖當(dāng)日不進(jìn)行被動(dòng)吸煙造模，第2～13d和第15～28d每日根據(jù)大鼠的晝夜節(jié)律于20：00開始將大鼠放入自制密閉有機(jī)玻璃箱中，僅側(cè)壁留置直徑約1cm通氣孔，在密閉箱頂部設(shè)置點(diǎn)煙盒，將同一品牌香煙點(diǎn)燃2支后放置盒中密閉，使煙霧向下充滿密閉箱，每次10min，換煙間隔5min/次，連續(xù)被動(dòng)吸煙4次?？瞻捉M大鼠不造模，但于注射脂多糖同期進(jìn)行麻醉和固定，并注入同體積生理鹽水，在被動(dòng)吸煙操作時(shí)，置入未點(diǎn)煙的密閉箱中。被動(dòng)吸煙前空白組和慢阻肺模型組腹腔注射20mg/kg生理鹽水，低劑量依達(dá)拉奉組和高劑量依達(dá)拉奉組注射配置的低濃度依達(dá)拉奉注射液和高濃度依達(dá)拉奉注射液，劑量均為20mg/kg。配置方法：采用30%丙二醇10mL進(jìn)行配置，低濃度依達(dá)拉奉注射液加入依達(dá)拉奉20mg，高濃度依達(dá)拉奉注射液加入依達(dá)拉奉40mg。

2 觀察指標(biāo) 肺功能檢測(cè)：四組大鼠于造模28d后，麻醉固定大鼠，采用無(wú)束縛全身體積描記系統(tǒng)(美國(guó)DATA SCIENCES INTERNATIONAL提供)對(duì)大鼠的靜息呼吸頻率(frequence，f)、潮氣量(tidal volume，VT)、吸氣峰流速(Peak inhale flow，PIF)、氣道阻力(Airway resistance，RI)以及動(dòng)態(tài)肺順應(yīng)性(Dynamic lung compliance，Cdyn)水平進(jìn)行檢測(cè)。

血清抗氧化因子：造模28d后于肺功能檢測(cè)完成后摘取大鼠眼球取血，分別采用硫代巴比妥法和黃嘌呤氧化酶法對(duì)血漿丙二醛(Malondialdehyde，MDA)和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)進(jìn)行檢測(cè)。

支氣管肺泡灌洗液炎性因子：取血后固定大鼠，暴露雙側(cè)肺葉，結(jié)扎肺支氣管，采用針頭氣管插管緩慢注入3mL生理鹽水，10s后回抽，重復(fù)操作3次作為支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本，采用染色法檢測(cè)白細(xì)胞(White blood cell，WBC)水平，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)白介素-8(Interleukin-8，IL-8)和腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)水平。

肺組織采樣及檢測(cè)：完成支氣管肺泡灌洗后，取右上肺和右下肺，生理鹽水沖洗后浸泡于10%中性福爾馬林溶液中固定，經(jīng)組織脫水、石蠟包埋切片，采用HE染色觀察肺組織和支氣管情況，并對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶-9(Matric metalloproteinase-9，MMP-9)和基質(zhì)金屬蛋白酶-12(Matric metalloproteinase-12，MMP-12)表達(dá)情況、免疫組化學(xué)半胱胺酸蛋白酶蛋白(Caspase-12)和CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding Protein-homologous protein，CHOP)表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、肺功能檢測(cè)結(jié)果

肺功能檢測(cè)結(jié)果列于下表。整體比較(單因素方差分析)知：各指標(biāo)整體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。多重比較并結(jié)合主要數(shù)據(jù)分析：由(表1)可見，慢阻肺模型組與空白組相比，f、RI明顯增高，Cdyn以及PIF水平均明顯降低(P<0.05)，提示慢阻肺模型組造模后，存在明顯的氣流受限和阻塞性通氣障礙，造模具有可行性。與慢阻肺模型組相比，低劑量依達(dá)拉奉組RI明顯降低，Cdyn、PIF水平明顯升高，高劑量依達(dá)拉奉組f、RI均明顯降低，Cdyn及PIF明顯升高。與低劑量依達(dá)拉奉組相比，高劑量依達(dá)拉奉組Cdyn明顯升高(P<0.05)。

二、肺組織病理檢測(cè)結(jié)果

空白組肺組織和肺泡結(jié)構(gòu)均無(wú)明顯異常(圖1)，慢阻肺模型組和低劑量依達(dá)拉奉組均可見明顯的支氣管炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔擴(kuò)大，肺泡壁變薄(圖2、圖3)，高劑量依達(dá)拉奉組支氣管炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔擴(kuò)大，肺泡壁變薄程度相比慢阻肺模型組和低劑量依達(dá)拉奉組明顯減輕(圖4)。

圖1 空白組肺組織(SP，×400)圖2 慢阻肺模型組肺組織(SP，×400)圖3 低劑量依達(dá)拉奉組肺組織(SP，×400)圖4 高劑量依達(dá)拉奉組肺組織(SP，×400)

三、其他檢測(cè)指標(biāo)比較

1 血漿抗氧化物 仿前做整體比較，兩指標(biāo)整體差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。多重比較并結(jié)合主要數(shù)據(jù)分析：與空白組相比，慢阻肺模型組MDA、SOD水平明顯升高(P<0.05)；與慢阻肺模型組相比，低劑量依達(dá)拉奉組和高劑量依達(dá)拉奉組MDA明顯降低(P<0.05)，SOD水平無(wú)明顯變化(P>0.05)；低劑量依達(dá)拉奉組與高劑量依達(dá)拉奉組相比，MDA、SOD水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表2)。

2 支氣管肺泡灌洗液檢測(cè)及結(jié)果 仍仿前做整體比較，三指標(biāo)整體差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。多重比較并結(jié)合主要數(shù)據(jù)分析：與空白組相比，慢阻肺模型組WBC、TNF-α水平明顯升高(P<0.05)，IL-8水平無(wú)明顯變化(P>0.05)；與慢阻肺模型組相比，低劑量依達(dá)拉奉組和高劑量依達(dá)拉奉組WBC、TNF-α水平均明顯降低(P<0.05)，IL-8水平無(wú)明顯變化(P>0.05)；與低劑量依達(dá)拉奉組相比，高劑量依達(dá)拉奉組WBC、TNF-α水平明顯降低(P<0.05)(見表2)。

3 肺組織檢測(cè)結(jié)果 仍仿前做整體比較，四指標(biāo)整體差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。多重比較并結(jié)合主要數(shù)據(jù)分析：與空白組相比，慢阻肺模型組MMP-9、MMP-12、Caspase-12、CHOP表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.05)；與慢阻肺模型組相比，低劑量依達(dá)拉奉組和高劑量依達(dá)拉奉組MMP-9、MMP-12、Caspase-12、CHOP表達(dá)均明顯減弱(P<0.05)；與低劑量依達(dá)拉奉組相比，高劑量依達(dá)拉奉組MMP-9、MMP-12、Caspase-12、CHOP表達(dá)明顯減弱(P<0.05)。

表1 肺功能檢測(cè)結(jié)果

注：整體比較為單因素方差分析。多重比較為HSD-q檢驗(yàn)，顯著性標(biāo)記a、b、c 分別為和A、B、C組相比P<0.05。

表2 其他檢測(cè)指標(biāo)比較

討 論

一、慢阻肺造模

慢阻肺的發(fā)病機(jī)制目前臨床尚不明確，普遍認(rèn)為與香煙、煙霧等有害氣體或有害顆粒的吸入密切相關(guān)，因而在實(shí)驗(yàn)慢阻肺大鼠的造模方法方面常見的主要有被動(dòng)吸煙、被動(dòng)吸入二氧化硫、脂多糖氣道注入、彈性蛋白酶氣道注入以及多種方法復(fù)合等[4-6]，相關(guān)研究表明，被動(dòng)吸煙所采用的香煙具有影響慢阻肺發(fā)生的大量氧化劑和自由基，可促使炎性細(xì)胞的釋放和聚集，而在此基礎(chǔ)上被活化的炎癥細(xì)胞可進(jìn)一步導(dǎo)致蛋白酶/抗蛋白酶失衡，臨床可表現(xiàn)出肺氣腫以及慢阻肺的病理過程，因而成為慢阻肺造模中最常用的方式。但由于被動(dòng)吸煙在誘導(dǎo)慢阻肺模型通常需要3～6個(gè)月，實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)，不利于控制實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的其他生理狀態(tài)，影響最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果。且有臨床研究認(rèn)為，單純的吸煙并不能完全導(dǎo)致慢阻肺的發(fā)生，其發(fā)生率僅占慢阻肺發(fā)生總?cè)藬?shù)的20%左右。脂多糖是具有激活人體非特異性免疫的內(nèi)毒素之一，通過氣管滴注脂多糖可導(dǎo)致慢性炎癥的發(fā)生，相關(guān)動(dòng)物研究表明氣管滴注脂多糖后的肺損傷發(fā)展和進(jìn)程與慢阻肺相似，但反復(fù)多次脂多糖滴入容易造成動(dòng)物死亡，因此本研究結(jié)合被動(dòng)吸煙與氣管滴注脂多糖兩種方式，分別于造模初期和中期對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行氣管滴注脂多糖，并在此之后持續(xù)每日進(jìn)行被動(dòng)吸煙，在吸煙時(shí)間的制定上為滿足實(shí)驗(yàn)大鼠與人類晝夜節(jié)律的一致性，將被動(dòng)吸煙時(shí)間安排在夜間執(zhí)行。本研究結(jié)果顯示，造模28d后慢阻肺造模組大鼠其肺功能檢測(cè)指標(biāo)、血漿抗氧化物MDA、SOD水平、支氣管肺泡灌洗液WBC、TNF-α水平以及肺組織MMP-9、MMP-12、Caspase-12、CHOP表達(dá)均表現(xiàn)異常，且與空白組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，由此提示慢阻肺模型組造模后存在明顯的氣流受限和阻塞性通氣障礙，而免疫組化Caspase-12、CHOP表達(dá)的增強(qiáng)也提示造模后大鼠已出現(xiàn)肺組織細(xì)胞的損傷和凋亡，造模具有可行性。

二、依達(dá)拉奉的作用機(jī)制

本研究結(jié)果顯示，(1)在肺功能檢測(cè)方面，兩種劑量依達(dá)拉奉治療大鼠相比慢阻肺模型大鼠均表現(xiàn)為RI明顯降低，而Cdyn和PIF水平明顯升高，其中高劑量依達(dá)拉奉治療大鼠f水平也較慢阻肺模型大鼠明顯降低，表明依達(dá)拉奉對(duì)于改善氣流受限以及阻塞性通氣障礙所導(dǎo)致的呼吸困難等臨床癥狀均有顯著效果[7-8]，但高劑量依達(dá)拉奉表現(xiàn)更加突出，提示依達(dá)拉奉的使用劑量可能與抑制慢阻肺病情進(jìn)展的程度具有一定的相關(guān)性。(2)在血漿抗氧化物檢測(cè)方面低劑量依達(dá)拉奉組和高劑量依達(dá)拉奉組MDA水平均明顯降低，MDA作為反映氧化損傷嚴(yán)重程度的重要檢測(cè)指標(biāo)[9-10]，慢阻肺模型大鼠MDA水平的增高表明慢阻肺大鼠可能存在嚴(yán)重的肺氧化損傷，而通過運(yùn)用依達(dá)拉奉大鼠的MDA水平得以明顯降低，提示其具有減輕慢阻肺氧化損傷的作用，雖然依達(dá)拉奉大鼠SOD水平與慢阻肺模型大鼠相比其差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但具有一定的下降趨勢(shì)，國(guó)外學(xué)者表示這可能與依達(dá)拉奉直接對(duì)抗氧化性物質(zhì)，從而避免了過量氧化性物質(zhì)對(duì)SOD基因表達(dá)的影響[11]。(3)支氣管肺泡灌洗液檢測(cè)方面，慢阻肺模型組WBC、TNF-α水平明顯升高，而低劑量依達(dá)拉奉組和高劑量依達(dá)拉奉組WBC、TNF-α水平均明顯降低。其中TNF-α是具有多種炎癥介質(zhì)功能的重要炎性因子，可誘導(dǎo)與炎癥過程中包括淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞以及中性粒細(xì)胞等在內(nèi)多種炎性細(xì)胞的粘附浸潤(rùn)密切相關(guān)血管粘附因子的表達(dá)，因而其水平可隨著氣道阻塞的嚴(yán)重程度而逐漸增高[12-14]。由此表明在炎癥反應(yīng)嚴(yán)重的情況下應(yīng)用依達(dá)拉奉可以通過減少白細(xì)胞，降低TNF-α水平達(dá)到減輕慢阻肺肺內(nèi)炎癥損傷的作用。(4)在肺組織檢測(cè)方面，相關(guān)研究表明MMP在吸煙相關(guān)的慢阻肺病情發(fā)展中具有突出作用，與氣道重塑、炎癥反應(yīng)以及傷口愈合等多種生理過程均有密切的關(guān)系，臨床慢阻肺、哮喘、肺間質(zhì)纖維化以及腫瘤等疾病的病理過程中均可見MMP的過度表達(dá)。其中MMP-9主要由中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞合成并以酶原形式分泌，研究表明MMP-9是參與炎癥反應(yīng)的重要基質(zhì)金屬蛋白酶，且其活性與氣流受限程度呈相關(guān)性[15]。而MMP-12是巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，受香煙煙霧影響較大，其分解的彈性蛋白可產(chǎn)生對(duì)單核細(xì)胞具有趨化性的組織碎片，而這種同時(shí)存在的正反饋循環(huán)可導(dǎo)致肺組織的持續(xù)損傷，因此可作為評(píng)價(jià)炎癥反應(yīng)的標(biāo)志物[16]。本研究結(jié)果顯示，慢阻肺模型大鼠MMP-9和MMP-12均表現(xiàn)為高表達(dá)水平，而應(yīng)用依達(dá)拉奉后MMP-9和MMP-12表達(dá)明顯減弱，且高劑量依達(dá)拉奉表現(xiàn)更加具有優(yōu)勢(shì)。這與江興等人研究結(jié)果[17]較為一致，并且認(rèn)為依達(dá)拉奉具有抑制MMP-9和MMP-12表達(dá)的作用，且對(duì)于平衡蛋白酶/抗蛋白酶系統(tǒng)具有一定的效果，從而達(dá)到抗肺氣腫、肺損傷的作用。在免疫組化檢測(cè)方面，Caspase-12、CHOP作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)中的重要因子，與肺組織細(xì)胞凋亡有密切的關(guān)系[18-19]。在經(jīng)依達(dá)拉奉治療后大鼠Caspase-12、CHOP表達(dá)相比造模后有明顯的降低，且高劑量依達(dá)拉奉組相比低劑量依達(dá)拉奉更加突出，由此推測(cè)依達(dá)拉奉的治療效果可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。井忠喜[20]和李瑜等[21]人研究結(jié)果均證實(shí)依達(dá)拉奉可通過抑制黃嘌呤氧化酶活性，降低機(jī)體白三烯的生成，達(dá)到有效抑制并清除大腦內(nèi)毒性羥自由基和減輕細(xì)胞磷脂膜氧化損傷的作用，進(jìn)而有效改善慢性阻塞性肺疾病急性加重患者肺功能及氧化應(yīng)激反應(yīng)。

結(jié) 論

依達(dá)拉奉可提高抗氧化能力、減少炎癥因子的釋放和聚集以及改善蛋白酶調(diào)節(jié)，對(duì)延緩慢阻肺臨床病理進(jìn)展有一定的作用。