MDR1介導(dǎo)LncRNAFENDRR對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞特性的影響及機(jī)制研究

李瑋 徐櫻 項(xiàng)金華

癌癥相關(guān)數(shù)據(jù)結(jié)果顯示：肺癌已成為患病率、致死率最高的一種腫瘤，同時(shí)其也是全球死亡率最高的腫瘤[1-2]，其中非小細(xì)胞肺癌占肺癌的80%～85%[3]，其首選治療手段是手術(shù)切除，同時(shí)術(shù)后放化療可顯著降低非小細(xì)胞肺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，但臨床數(shù)據(jù)顯示治療后其5年生存率仍低于15%，其中一部分原因是多藥耐藥(MDR)對(duì)肺癌化療效果產(chǎn)生影響[4-5]。Lnc RNA是長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，其在遺傳調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)控及細(xì)胞分化調(diào)控等多個(gè)生命活動(dòng)中均有重要作用[5-7]，已經(jīng)成為遺傳學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。本文研究發(fā)現(xiàn)，LncRNAFENDRR與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，F(xiàn)ENDRR過(guò)表達(dá)可抑制肺癌細(xì)胞增殖，降低細(xì)胞侵襲及遷移能力，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，分析如下。

資料與方法

一、標(biāo)本與試劑

選擇2018年至2019年長(zhǎng)沙市第三醫(yī)院收治的60例非小細(xì)胞肺癌患者作為標(biāo)本來(lái)源(其中男30例，女30例，年齡35～68歲，均經(jīng)病理學(xué)診斷確診為非小細(xì)胞肺癌)，取其非小細(xì)胞肺癌組織及距腫瘤3cm以上癌旁組織作為標(biāo)本；A549細(xì)胞系購(gòu)自南京科佰生物科技有限公司，載體pcDNA-FENDRR購(gòu)自江蘇泓訊生物科技股份有限公司，Real-time PCR基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自賽默飛世爾公司，PCR引物合成由金唯智生物科技公司完成，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑采自賽默飛世爾公司，MTT試劑盒購(gòu)自默沙克生物科技有限公司，細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自全式金生物科技有限公司，Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自BD Biosciences公司，結(jié)晶紫染液購(gòu)自碧云天公司。

二、試驗(yàn)方法

1 Real-tine PCR 取非小細(xì)胞肺癌肺癌組織及癌旁組織，用液氮冷凍后粉碎，提取兩種組織的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，擴(kuò)增FENDRR基因后，設(shè)計(jì)其引物，取GAPDH基因作為內(nèi)部參數(shù)，參照實(shí)驗(yàn)所得的Ct值對(duì)FENDRR實(shí)施相對(duì)定量分析，定量分析方法為Ct值法。

2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將A549細(xì)胞系細(xì)胞行常規(guī)培養(yǎng)，待其處于對(duì)數(shù)期且達(dá)到80%融合后取出待用，按照說(shuō)明書(shū)，將重組載體pcDNA-FENDRR轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞，轉(zhuǎn)染時(shí)間為2h，之后更換為正常培養(yǎng)基，再培養(yǎng)48h后取出并檢測(cè)。

3 細(xì)胞增殖活力檢測(cè) 將A549細(xì)胞系分為空白對(duì)照組及FENDRR轉(zhuǎn)染組，空白對(duì)照組未實(shí)施轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，未進(jìn)行任何干預(yù)，F(xiàn)ENDRR轉(zhuǎn)染組細(xì)胞接受pcDNA-FENDRR轉(zhuǎn)染，使用MTT法分析兩組細(xì)胞增殖活力。

4 細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 收集兩組A549細(xì)胞，使用PBS液制作成細(xì)胞懸浮液后在4℃、1000r/min下離心2min，再使用PBS洗脫并離心，重復(fù)2次后使用PBS制作為細(xì)胞懸浮液，之后常溫培養(yǎng)15min，再用細(xì)胞凋亡試劑盒行細(xì)胞凋亡率檢測(cè)。

5 細(xì)胞遷移能力檢測(cè) 收集兩組A549細(xì)胞，消化后調(diào)整細(xì)胞濃度，將細(xì)胞懸液加入至Transwell小室的上室，再將含胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基加入至下室，之后置于含5 % CO2的37℃培養(yǎng)箱孵育24 h，取出小室取，在400倍高倍鏡下計(jì)數(shù)，每張片子隨機(jī)記錄5個(gè)視野的遷移細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞遷移數(shù)為每張片子五個(gè)視野總數(shù)視(設(shè)置3個(gè)重復(fù))。

6 細(xì)胞侵襲能力檢測(cè) 將Matrigel膠在4℃下解凍，用不含胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)：將Matrigel膠按8:1比例稀釋，在冰上混勻，之后將混合液加入Transwell小室上室，置于含5 % CO2的37℃培養(yǎng)箱孵育1～2 h，再接種細(xì)胞，其余過(guò)程同遷移檢測(cè)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、FNDRR mRNA在非小細(xì)胞肺癌及癌旁組織中表達(dá)量對(duì)比

Real-time檢測(cè)結(jié)果中，F(xiàn)ENDRR在非小細(xì)胞肺癌與癌旁組織中相對(duì)表達(dá)的△△Ct為1.366，其在非小細(xì)胞肺癌組織中的相對(duì)表達(dá)量為癌旁組織的35.62%，在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)量明顯低于正常癌旁組織(P<0.05)。

二、FENDRR表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌分級(jí)及T分期相關(guān)性分析

隨著非小細(xì)胞肺癌分化程度的降低及T分期的升高，F(xiàn)ENDRRmRNA表達(dá)逐漸降低(P<0.05)，但其在非小細(xì)胞肺癌N、M分期中變化無(wú)顯著性差異(P<0.05)(見(jiàn)表1)。

三、FENDRR基因表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞增殖活力及凋亡率影響

Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果表明，與空白對(duì)照組A549細(xì)胞相比，F(xiàn)ENDRR轉(zhuǎn)染組A549細(xì)胞中FENDRR mRNA表達(dá)量顯著上升，A549細(xì)胞的增殖活力顯著降低，凋亡率顯著上升(P均<0.05)(見(jiàn)圖1)。

四、FENDRR基因表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響

表1 FENDRR表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌分級(jí)及T分期相關(guān)性分析

圖1 FENDRR基因表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞增殖活力及凋亡率影響

注：A為FENDRR-mRNA表達(dá)量；B為A549細(xì)胞增殖活力；C為A549細(xì)胞凋亡率(%)；****P<0.0001，與空白對(duì)照組比較

細(xì)胞遷移能力檢測(cè)結(jié)果表明，與空白對(duì)照組相比，F(xiàn)ENDRR轉(zhuǎn)染組A549細(xì)胞遷移及侵襲能力明顯降低(P<0.05)(見(jiàn)圖2)。

圖2 FENDRR基因表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響

注：**P<0.01，***P<0.001，與空白對(duì)照組比較

討 論

有研究顯示，近年來(lái)我國(guó)居民肺癌的發(fā)病率和致死率逐年增加，不僅影響居民的生命健康，也對(duì)我國(guó)經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展產(chǎn)生不利影響[8-9]。非小細(xì)胞肺癌在肺癌中占比最高，具有腫瘤組織分裂速度慢，擴(kuò)散較晚的特點(diǎn)，但其臨床癥狀不明顯，使得臨床上在前中期不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)，使得其致死率較高[10-12]。

隨著我國(guó)人類全基因組研究的進(jìn)行，具有編碼蛋白質(zhì)的基因逐漸被發(fā)掘出來(lái)，其在各類疾病中有重要作用，目前其已用于膽道閉鎖自身免疫研究中[13-15]。Lnc RNA是一類非編碼RNA，近年來(lái)研究指出，多種腫瘤中Lnc RNA存在異常表達(dá)[7]。有研究發(fā)現(xiàn)[16]，Lnc RNA與肝癌及其相關(guān)疾病密切相關(guān)，可通過(guò)表觀遺傳調(diào)控、促進(jìn)血管生成、增加脂質(zhì)代謝異常等方式對(duì)肝癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后產(chǎn)生影響，因此可將Lnc RNA作為肝癌診斷標(biāo)志物及新型治療靶點(diǎn)。

相關(guān)研究指出，F(xiàn)ENDRR可通過(guò)影響復(fù)合物2來(lái)調(diào)控原癌基因及腫瘤抑制基因，從而影響腫瘤進(jìn)程[17-18]。本文結(jié)果表明， 非小細(xì)胞肺癌癌組織中FENDRR的表達(dá)明顯低于癌旁組織，進(jìn)一步分析顯示，F(xiàn)ENDRR表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者肺癌分化程度及T分期密切相關(guān)，癌細(xì)胞分化程度越低、T分期越高，F(xiàn)ENDRR表達(dá)越低(P<0.05)，而在T分期各階段對(duì)比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，其表明FENDRR基因與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，但其與癌癥N及M分期無(wú)相關(guān)性[19]。同時(shí)與空白對(duì)照組細(xì)胞相比，F(xiàn)ENDRR轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞系其增殖活力、遷移能力和侵襲能力均明顯下降，而凋亡率明顯上升(P<0.05)，表明FENDRR基因可抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖，降低癌細(xì)胞侵襲及遷移能力，從而發(fā)揮抑癌基因的作用，可能與其可抑制MDR1的表達(dá)相關(guān)，以上結(jié)果與學(xué)者陳瀅[20]等的研究結(jié)果相一致。

綜上所述，LncRNAFENDRR與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，F(xiàn)ENDRR過(guò)表達(dá)可抑制癌細(xì)胞增殖、降低細(xì)胞侵襲和遷移能力，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，其可作為未來(lái)非小細(xì)胞肺癌的治療新型靶點(diǎn)。