納米銀復(fù)合材料與抗生素的聯(lián)合抗菌性能及相關(guān)機(jī)制研究

王孟珍，孫昊宇，龍茜，林志芬

污染控制與資源化研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，同濟(jì)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200092

抗生素被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療衛(wèi)生、農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)等領(lǐng)域，對感染性疾病的防治起到關(guān)鍵作用。然而，近年來抗生素的濫用使得細(xì)菌耐藥問題不斷加劇，導(dǎo)致抗菌劑在治療細(xì)菌感染時(shí)藥效降低甚至完全失效，這較抗菌劑自身的毒性而言對生態(tài)安全和人類健康威脅更大[1]。在此情況下，人類迫切需要開發(fā)出新的抗菌藥物以減少細(xì)菌耐藥問題。納米銀作為一種新型的抗菌藥物，其能穿透微生物的細(xì)胞壁進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)，與巰基結(jié)合后破壞細(xì)菌的呼吸鏈并產(chǎn)生活性氧簇抑制細(xì)菌生長[2]。相較于傳統(tǒng)的銀離子，納米銀具有較高的價(jià)態(tài)和巨大的比表面積，不易被氧化和沉淀，因此納米銀的使用越來越廣泛[3]。但是，單一納米銀有釋放速度快、易團(tuán)聚和不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。為了克服這些缺點(diǎn)，有研究人員將納米銀與其他材料制備成納米銀復(fù)合材料，不僅能夠?qū){米銀起到穩(wěn)定和保護(hù)作用，還能降低納米銀的釋放速度從而獲得較好的持效抑菌性能[4-5]。例如，Badu等[6]將納米銀/聚吡咯復(fù)合材料覆于棉織物上，通過瓊脂擴(kuò)散板測試實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，復(fù)合材料在6 h后殺滅大腸桿菌率達(dá)100%，而在12 h后殺滅金黃色葡萄球菌率達(dá)100%。Tang等[7]在氧化石墨烯的懸浮液中通過檸檬酸鈉還原硝酸銀制備得到氧化石墨烯-銀納米復(fù)合材料并進(jìn)行毒性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌都具有較好的殺菌效果。因此，制備納米銀復(fù)合材料并開展其抗菌性能研究對生態(tài)安全和人類健康具有重要意義。

在納米銀復(fù)合材料的制備過程中，研究比較廣泛的納米銀載體材料有沸石[8]、碳納米管[9]、氧化石墨烯[10]以及納米二氧化硅[11]等。其中，納米二氧化硅與其他幾種載體材料相比，具有高載藥量、良好的生物相容性、低細(xì)胞毒性和高比表面積等優(yōu)勢。此外，納米銀與二氧化硅載體結(jié)合的時(shí)候，既可以被包裹在二氧化硅微球的內(nèi)部，也可以黏附在其外層，或者兩者同時(shí)兼具[12-14]。因此，以納米二氧化硅作為載體制備納米銀復(fù)合材料具有廣闊的應(yīng)用前景。

此前關(guān)于納米銀抗菌性能的研究表明，納米銀和抗生素聯(lián)合使用可以產(chǎn)生協(xié)同抗菌效果[15-16]。例如，郭春蘭等[17]通過觀察傷口病原菌和耐藥菌陽性率的變化，發(fā)現(xiàn)納米銀敷料結(jié)合青霉素等抗生素治療慢性感染傷口具有協(xié)同抗菌作用，有助于傷口愈合。Li等[15]認(rèn)為納米銀更容易與細(xì)菌細(xì)胞膜的磷脂和糖蛋白反應(yīng)，可作為載體有利于阿莫西林向細(xì)胞表面運(yùn)輸，從而抗菌效果更明顯。由此看出單一納米銀與某些抗生素的聯(lián)合使用可以達(dá)到協(xié)同殺菌效果，但是有關(guān)納米銀復(fù)合材料與抗生素聯(lián)合使用的抗菌性能研究卻十分有限。那么，納米銀復(fù)合材料與傳統(tǒng)抗生素聯(lián)合暴露是否比單一納米銀復(fù)合材料的抗菌效果好？其聯(lián)合抗菌機(jī)制又是如何？這是本文所關(guān)注的問題。

本文首先通過溶膠-凝膠法制備出二氧化硅微球作為載體材料，并參考宋笑等[18]報(bào)道的方法制備出3種不同結(jié)構(gòu)的納米銀復(fù)合材料并簡單表征，最后分別測定3種納米銀復(fù)合材料對大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis,B.subtilis)的單一毒性及AgNPs@SiO2-PD-AgNPs與硫酸卡那霉素(kanamycin sulfate, KS)/鹽酸土霉素(oxytetracycline hydrochloride, OH)對受試菌的二元聯(lián)合毒性。本文旨在得到具有良好抗菌性能的納米銀復(fù)合材料，并探索可以產(chǎn)生協(xié)同抗菌作用的納米銀復(fù)合材料與抗生素的組合，為開發(fā)新型抗菌材料提供思路并為其進(jìn)一步推廣使用提供參考。

1 材料與方法 (Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

正硅酸四乙酯、氨水(25%～28%)、無水乙醇、甲醇、甲醛和鹽酸(36%～38%)均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(上海，中國)，純度均為分析純。多巴胺鹽酸鹽、三羥甲基氨基甲烷、十六烷基三甲基溴化銨和硝酸銀購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司(上海，中國)，純度均為分析純。鹽酸土霉素和硫酸卡那霉素購自Sigma-Aldrich化學(xué)制品有限公司(上海，中國)，純度為分析純以上。

本實(shí)驗(yàn)中使用的模式生物E.coli(K-12 MG1655)和B.subtilis(168)購自BioVector科技有限公司(北京，中國)。

1.2 納米銀復(fù)合材料的制備

1.2.1 納米二氧化硅(SiO2)的制備

將9 mL的氨水與24.75 mL的去離子水及16.25 mL的無水乙醇混勻得到溶液A；將4.5 mL的正硅酸四乙酯與45.5 mL的無水乙醇混合，用85-1型磁力攪拌器(武漢科爾儀器有限公司，武漢，中國)以1 100 r·min-1轉(zhuǎn)速攪拌20 min，得到溶液B。室溫下將B溶液快速加入A溶液中，60 s后將攪拌速度降低至350～400 r·min-1。反應(yīng)2 h后將溶液進(jìn)行離心，去掉上清液，沉淀物用乙醇反復(fù)洗滌3次后，用DZF-6050型真空干燥箱(上海精宏儀器有限公司，上海，中國)干燥，得到納米SiO2粒子。

1.2.2 納米銀@二氧化硅(AgNPs@SiO2)的制備

將0.2 g的十六烷基三甲基溴化銨、96 mL的去離子水和2.8 mL的氨水加入到三口燒瓶中，不斷攪拌，加熱至80 ℃后反應(yīng)30 min。此時(shí)向燒瓶中加入1 mL的硝酸銀溶液(0.1 mol·L-1)和0.6 mL的甲醛溶液(1.0 mol·L-1)，攪拌5 min后，向混合體系逐滴滴加1 mL的正硅酸四乙酯。反應(yīng)2 h后將溶液進(jìn)行離心，去掉上清液，沉淀物用去離子水洗滌后加入80 mL的0.1 mol·L-1的鹽酸/乙醇溶液，在80 ℃條件下加熱回流4 h后，將溶液進(jìn)行離心，去掉上清液，將沉淀物真空干燥后得到AgNPs@SiO2粒子。

1.2.3 二氧化硅-聚多巴胺-納米銀(SiO2-PD-AgNPs)的制備

將50 mL 0.1 mol·L-1的三羥甲基氨基甲烷溶液與14.7 mL 0.1 mol·L-1的鹽酸混合，加水定容至100 mL，得到pH=8.5的三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液。將0.06 g的多巴胺鹽酸鹽和0.05 g的SiO2顆粒加入30 mL三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液中，室溫下避光攪拌過夜。將反應(yīng)產(chǎn)物過濾洗滌后，加到20 mL的硝酸銀(1.5 mg·mL-1)溶液中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下80 ℃反應(yīng)30 min。將溶液進(jìn)行離心，去掉上清液，沉淀物用乙醇反復(fù)洗滌3次后真空干燥，得到SiO2-PD-AgNPs粒子。

1.2.4 納米銀@二氧化硅-聚多巴胺-納米銀(AgNPs@SiO2-PD-AgNPs)的制備

將SiO2-PD-AgNPs制備過程中的SiO2替換為AgNPs@SiO2，按照同樣的方法反應(yīng)合成AgNPs@SiO2-PD-AgNPs粒子。

1.3 毒性測定及表征方法

1.3.1 受試菌的培養(yǎng)

液體培養(yǎng)基配方為10.0 g·L-1氯化鈉、25.0 g·L-1蛋白胨和12.5 g·L-1酵母膏，pH調(diào)節(jié)至約為7.0。取E.coli或B.subtilis菌種接種到5 mL液體培養(yǎng)基中，在37 ℃恒溫條件下震蕩培養(yǎng)(E.coli為6 h，B.subtilis為10 h)至對數(shù)生長期，將菌液用1%氯化鈉溶液稀釋105倍，用于毒性測定。

1.3.2 毒性實(shí)驗(yàn)

稱取待測樣用1%氯化鈉溶液配制成母液，將母液用1%氯化鈉溶液稀釋成等對數(shù)梯度的濃度加入96孔板中。每孔溶液總體系為200 μL，其中包括80 μL培養(yǎng)基、40 μL工作菌液以及80 μL待測物質(zhì)溶液，每個(gè)濃度梯度設(shè)置3個(gè)平行，37 ℃下180 r·min-1震蕩培養(yǎng)(E.coli培養(yǎng)12 h，B.subtilis培養(yǎng)19 h)，使用GO1510型多功能酶標(biāo)儀(Thermo Fisher公司，沃爾瑟姆，美國)測定600 nm處的光密度值(OD600)。根據(jù)式(1)計(jì)算測試樣對細(xì)菌的抑制率。

(1)

式中：OD600,0為受試菌在無染毒作用下的空白OD600讀數(shù)的平均值；OD600,i為受試菌在濃度為i的化合物作用下OD600讀數(shù)的平均值。以測試樣濃度的負(fù)對數(shù)為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)，繪制劑量-效應(yīng)曲線，50%抑制率時(shí)對應(yīng)的測試樣濃度即為半最大效應(yīng)濃度(concentration for 50% of maximal effect, EC50)。

EC50是一個(gè)經(jīng)典參數(shù)，已在毒理學(xué)研究中長期使用。作為衡量物質(zhì)生物毒性大小的指標(biāo)，EC50值越小表示物質(zhì)的毒性越大[19]。根據(jù)單獨(dú)毒性實(shí)驗(yàn)研究中每種抗菌劑對受試菌的EC50濃度值來確定配制測試樣A(納米銀復(fù)合材料，本研究中選用AgNPs@SiO2-PD-AgNPs進(jìn)行聯(lián)合毒性實(shí)驗(yàn))與測試樣B(KS/OH)的混合溶液濃度，按照AgNPs@SiO2-PD-AgNPs與KS/OH的EC50配制系列二元混合溶液，其毒性比分別為1∶1、1∶5和5∶1。然后按照單一毒性測定方法測定系列混合溶液的聯(lián)合毒性，并繪制劑量-效應(yīng)曲線，計(jì)算出EC50mix。EC50mix和毒性單位(toxic unit, TU)都是用來表征混合毒性效應(yīng)的重要參數(shù)，TU法參數(shù)的物理意義比較明確，計(jì)算簡捷，評價(jià)結(jié)果便于理解，用此模型來判斷混合物的聯(lián)合作用結(jié)果較為可靠，可以直觀地判斷出混合毒性的聯(lián)合效應(yīng)類型，因此得到廣泛的應(yīng)用[20]。聯(lián)合毒性的研究是依據(jù)單一測試樣的EC50來設(shè)計(jì)的，將單一測試樣對受試菌的抑制率為50%時(shí)對應(yīng)的濃度定義為一個(gè)毒性單位[21]，實(shí)驗(yàn)所得聯(lián)合毒性效應(yīng)使用的TU的計(jì)算如式(2)。

(2)

式中：CA、CB是混合體系產(chǎn)生50%抑制時(shí)測試樣A、B各自的濃度，EC50A和EC50B是測試樣A、B分別作用于細(xì)菌時(shí)產(chǎn)生50%抑制時(shí)的濃度。當(dāng)TU<0.8時(shí)，判定聯(lián)合毒性效應(yīng)為協(xié)同；當(dāng)0.8≤TU≤1.2時(shí)，判定聯(lián)合毒性效應(yīng)為相加；當(dāng)TU>1.2時(shí)，判定聯(lián)合毒性效應(yīng)為拮抗[22]。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 納米銀復(fù)合粒子的表征

使用ZEN3690型粒度分析儀(Malvern公司，馬爾文，英國)對復(fù)合材料的粒徑以及分散系數(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果如表1所示。AgNPs@SiO2的粒徑是553.7 nm，分散系數(shù)為0.725；SiO2-PD-AgNPs的粒徑是743.6 nm，分散系數(shù)為0.547；AgNPs@SiO2-PD-AgNPs的粒徑是974.6 nm，分散系數(shù)為0.392?？梢?，3種納米銀復(fù)合材料的粒徑大小排序?yàn)椋篈gNPs@SiO2-PD-AgNPs>SiO2-PD-AgNPs>AgNPs@SiO2，其中AgNPs@SiO2-PD-AgNPs的分散系數(shù)最小，其分散度最好。

此外，用Evolution 350型紫外可見分光光度計(jì)(Thermo Scientific公司，沃爾瑟姆，美國)檢測3種納米銀復(fù)合材料的紫外吸收光譜。結(jié)果如圖1(a)所示，AgNPs@SiO2無紫外吸收，AgNPs@SiO2-PD-AgNPs和SiO2-PD-AgNPs在475 nm左右產(chǎn)生了最大紫外吸收峰。已有研究表明，納米銀的最大紫外吸收峰在420 nm左右[23-24]，所以筆者推測475 nm左右處的最大紫外吸收峰很可能與復(fù)合材料中的納米銀有關(guān)。對于AgNPs@SiO2，在其制備過程中，甲醛作為還原劑還原硝酸銀為納米銀，納米銀被包覆于SiO2微球的孔洞中，因此沒有明顯的紫外吸收峰，推測其結(jié)構(gòu)如圖1(b)所示。而在SiO2-PD-AgNPs的制備過程中，多巴胺會聚合成為聚多巴胺并在SiO2表面形成一層薄膜，隨后聚多巴胺還原硝酸銀為納米銀后被包覆在聚多巴胺薄膜外面，因此可以檢測到紫外吸收峰，其推測結(jié)構(gòu)如圖1(b)所示。AgNPs@SiO2-PD-AgNPs結(jié)合了前面2種復(fù)合材料的特點(diǎn)，SiO2內(nèi)層和表面都存在納米銀粒子，具有明顯的夾心層結(jié)構(gòu)，所以也會出現(xiàn)紫外吸收峰，推測結(jié)構(gòu)如圖1(b)所示。此外，納米銀最大吸收峰的位置和形狀在很大程度上取決于其粒徑、表面吸附的物質(zhì)以及周圍的電介質(zhì)[25-26]。在AgNPs@SiO2-PD-AgNPs和SiO2-PD-AgNPs這2種復(fù)合材料中，由于SiO2的折射率略高于水，納米銀與SiO2的結(jié)合導(dǎo)致納米銀周圍基質(zhì)的介電常數(shù)與折射率都有所增加，因此，AgNPs@SiO2-PD-AgNPs和SiO2-PD-AgNPs的最大紫外吸收峰(475 nm左右)相對于納米銀的最大紫外吸收峰(420 nm左右)發(fā)生了紅移。

表1 納米銀復(fù)合材料的粒徑和分散系數(shù)Table 1 Particle size and polymer dispersity index of nanosilver composites

注：AgNPs@SiO2為納米銀@二氧化硅復(fù)合材料，SiO2-PD-AgNPs為二氧化硅-聚多巴胺-納米銀復(fù)合材料，AgNPs@SiO2-PD-AgNPs為納米銀@二氧化硅-聚多巴胺-納米銀復(fù)合材料。

Note: AgNPs@SiO2stands for nanosilver@silica; SiO2-PD-AgNPs stands for silica-polydopamine-nanosilver; AgNPs@SiO2-PD-AgNPs stands for nanosilver@silica-polydopamine-nanosilver.

2.2 單一毒性

3種納米銀復(fù)合材料對E.coli和B.subtilis的單一毒性數(shù)據(jù)如表2所示。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，AgNPs@SiO2、SiO2-PD-AgNPs和AgNPs@SiO2-PD-AgNPs對E.coli的EC50分別為65.7、90.7和48.2 mg·L-1，對B.subtilis的EC50分別為466.4、560.0和161.5 mg·L-1?？梢?種納米銀復(fù)合材料對2種菌的毒性大小順序一致，均為AgNPs@SiO2-PD-AgNPs>AgNPs@SiO2>SiO2-PD-AgNPs。

此前，已有研究闡明納米銀復(fù)合材料主要依靠納米銀和Ag+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)阻斷DNA復(fù)制和產(chǎn)生活性氧誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來殺死細(xì)菌[27]。根據(jù)納米銀復(fù)合材料抗菌機(jī)理的相關(guān)研究[28]，以AgNPs@SiO2為例，推測其抗菌機(jī)理如圖2(a)所示。AgNPs@SiO2吸附在細(xì)菌表面，在與細(xì)胞接觸的過程中，納米銀粒子通過硅殼孔道釋放出來(如圖2(b))，納米銀可能會影響細(xì)胞壁上的某些蛋白質(zhì)和磷脂，誘導(dǎo)膜破裂，影響細(xì)胞膜的完整性[29-30]，從而使細(xì)胞膜通透性增加，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物釋放。在此過程中，納米銀會釋放出Ag+[29,31]。納米銀和Ag+進(jìn)入到胞內(nèi)，一方面導(dǎo)致活性氧簇(ROS)的產(chǎn)生，Ag+被氧化為Ag2O，從而滅活呼吸鏈脫氫酶，抑制細(xì)胞呼吸；另一方面Ag+通過與細(xì)菌蛋白酶上的巰基(—SH)迅速結(jié)合，破壞蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，抑制細(xì)菌生命活動必需的酶和蛋白質(zhì)的活性[32]，并通過濃縮DNA使其失去復(fù)制能力而引起DNA的降解來抑制細(xì)菌的生長繁殖[33]，最后達(dá)到抑菌效果。SiO2-PD-AgNPs和AgNPs@SiO2-PD-AgNPs的納米銀和Ag+的釋放過程如圖2(c)和圖2(d)所示。對于SiO2-PD-AgNPs，因?yàn)榧{米銀粒子覆蓋在最外層，所以在與細(xì)菌接觸的過程中直接釋放。由于AgNPs@SiO2-PD-AgNPs具備前面2種材料的特點(diǎn)，因此其最外層的納米銀先流失，然后聚多巴胺膜被水解破壞，最后SiO2內(nèi)部的納米銀被釋放出來。在納米銀釋放之后，SiO2-PD-AgNPs和AgNPs@SiO2-PD-AgNPs的抗菌機(jī)制與AgNPs@SiO2類似。

圖1 3種納米銀復(fù)合材料的紫外可見吸收光譜(a)與結(jié)構(gòu)(b)注：1. AgNPs@SiO2-PD-AgNPs；2. SiO2-PD-AgNPs；3. AgNPs@SiO2。Fig. 1 UV-vis spectra (a) and the structure (b) of three kinds of nanosilver compositesNote: 1. AgNPs@SiO2-PD-AgNPs; 2. SiO2-PD-AgNPs; 3. AgNPs@SiO2.

表2 3種納米銀復(fù)合材料的半最大效應(yīng)濃度(EC50)Table 2 The concentration for 50% of maximal effect (EC50) of three kinds of nanosilver composites (mg·L-1)

本研究中納米銀復(fù)合材料的抗菌性能主要由納米銀的負(fù)載率決定。對于AgNPs@SiO2來說，該材料是將納米銀的還原反應(yīng)和正硅酸乙酯的水解反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行，使納米銀能夠更多地被包裹于SiO2微孔中，其對納米銀的吸附率較高。而SiO2表面的聚多巴胺雖具有一定的黏附性，但其負(fù)載的納米銀粒子可能相對較少，導(dǎo)致SiO2-PD-AgNPs毒性較AgNPs@SiO2小。AgNPs@SiO2-PD-AgNPs是在AgNPs@SiO2的基礎(chǔ)上，對材料表面進(jìn)行進(jìn)一步修飾，從而進(jìn)一步提高了納米銀的負(fù)載率，因此AgNPs@SiO2-PD-AgNPs的毒性最大。從受試菌來看，3種材料對E.coli的毒性均大于對B.subtilis的毒性，即E.coli對納米銀復(fù)合材料的敏感度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于B.subtilis。筆者推測這可能與2種菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)有關(guān)：E.coli是革蘭氏陰性菌，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)較為單薄，含極少肽聚糖，納米銀和Ag+容易滲透到細(xì)胞質(zhì)中；對于B.subtilis來說，細(xì)胞壁堅(jiān)固致密的肽聚糖層會阻礙納米銀和Ag+的滲透，抑菌效應(yīng)減弱[34]。

圖2 3種納米銀復(fù)合材料的抑菌機(jī)理注：ROS表示活性氧簇；—SH表示巰基。Fig. 2 Bacteriostatic mechanism of three nanosilver compositesNote: ROS stands for reactive oxygen species;—SH stands for hydrosulfuryl.

2.3 聯(lián)合毒性

為了探究納米銀復(fù)合材料與抗生素的聯(lián)合抗菌性能，本研究選用單一毒性最大的AgNPs@SiO2-PD-AgNPs與廣泛應(yīng)用的抗菌藥物KS/OH進(jìn)行二元聯(lián)合[35-37]，測定二元混合物對E.coli和B.subtilis的聯(lián)合毒性，結(jié)果如表3所示?？梢?，AgNPs@SiO2-PD-AgNPs與KS在毒性比為1∶1、1∶5和5∶1時(shí)對E.coli的聯(lián)合毒性效應(yīng)為協(xié)同，對B.subtilis的聯(lián)合毒性效應(yīng)為相加，而AgNPs@SiO2-PD-AgNPs與OH在毒性比為1∶1、1∶5和5∶1時(shí)對2種菌的聯(lián)合毒性效應(yīng)均為相加。

以往的研究指出納米銀與抗生素產(chǎn)生協(xié)同抗菌效應(yīng)的可能原因是由于抗生素分子包含許多活性基團(tuán)，例如羥基和酰胺基(圖3(a))，它們?nèi)菀着c納米銀通過鍵合反應(yīng)成為抗生素-納米銀復(fù)合物[24,38]。本研究中，AgNPs@SiO2-PD-AgNPs和KS在3種不同濃度配比下對E.coli都可以產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，表明二者的協(xié)同效應(yīng)不會受濃度配比的影響。筆者推測納米銀復(fù)合材料和KS對E.coli的協(xié)同作用機(jī)理如圖3(b)所示。AgNPs@SiO2-PD-AgNPs首先釋放出納米銀粒子(圖2(d))，KS和納米銀通過鍵合反應(yīng)成為KS-納米銀復(fù)合物，納米銀與KS的結(jié)合會使納米銀的有效表面積發(fā)生變化，影響Ag+的釋放動力學(xué)[39]，所以KS-納米銀復(fù)合物比相同條件下單獨(dú)納米銀作用釋放了更多的Ag+。Ag+從復(fù)合物中的釋放一方面增加了細(xì)胞膜的通透性，另一方面也導(dǎo)致KS從復(fù)合物中解離下來[40-41]。因此，納米銀復(fù)合材料與KS聯(lián)合作用使得進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)的Ag+和KS含量均大于單獨(dú)作用時(shí)可進(jìn)入胞內(nèi)的抗菌劑含量。進(jìn)入胞內(nèi)的Ag+導(dǎo)致ROS的產(chǎn)生從而使Ag+被氧化為Ag2O，滅活呼吸鏈脫氫酶，抑制細(xì)胞呼吸，并且Ag+通過與細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和DNA分子結(jié)合從而引起細(xì)菌毒性[29]；而KS通過結(jié)合于細(xì)菌的30S核糖體影響細(xì)菌蛋白質(zhì)的正常合成，進(jìn)而破壞細(xì)菌功能導(dǎo)致E.coli死亡[42]。因此，AgNPs@SiO2-PD-AgNPs和KS對E.coli表現(xiàn)出協(xié)同抗菌效應(yīng)。而B.subtilis是革蘭氏陽性菌，其細(xì)胞壁較厚(平均20～80 nm)，從內(nèi)向外有15～50層含量豐富的肽聚糖，結(jié)構(gòu)致密，所以相較于E.coli，其細(xì)胞膜通透性不易被改變，筆者推測這可能是AgNPs@SiO2-PD-AgNPs與KS二元聯(lián)合對B.subtilis表現(xiàn)出相加效應(yīng)的原因。

對于AgNPs@SiO2-PD-AgNPs和OH的聯(lián)合毒性效應(yīng)，有研究指出，納米銀與四環(huán)素在水溶液中共存時(shí)會發(fā)生交互反應(yīng)，改變納米銀與四環(huán)素的理化性質(zhì)，導(dǎo)致Ag+的濃度升高，四環(huán)素的濃度降低[43]。Wan等[44]在評價(jià)納米銀與抗生素聯(lián)合抑制大腸桿菌實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，納米銀與四環(huán)素聯(lián)用不具有協(xié)同抑菌效果。因此，筆者推測納米銀復(fù)合材料和OH的聯(lián)合作用機(jī)制如圖3(d)所示。AgNPs@SiO2-PD-AgNPs首先釋放出納米銀(圖2(d))，之后OH通過羥基和酰胺基(圖3(c))與納米銀結(jié)合成為OH-納米銀復(fù)合物。但是OH與納米銀會發(fā)生交互反應(yīng)，改變了OH與納米銀的理化性質(zhì)，導(dǎo)致Ag+濃度增加，OH濃度降低。一方面，OH-納米銀復(fù)合物會釋放更多的Ag+，與單獨(dú)的納米銀相比會對細(xì)菌產(chǎn)生更大的毒性作用；另一方面，OH濃度的降低減少了其與細(xì)菌核糖體的結(jié)合，降低了對蛋白質(zhì)合成過程的影響，和相同條件下單獨(dú)的OH作用相比對細(xì)菌的毒性效應(yīng)減弱了，總體表現(xiàn)出對細(xì)菌的聯(lián)合抗菌效應(yīng)為相加。

圖3 AgNPs@SiO2-PD-AgNPs與2種抗生素的聯(lián)合抗菌機(jī)理Fig. 3 Combined antibacterial mechanism of AgNPs@SiO2-PD-AgNPs and two antibiotics

表3 抗菌混合物的聯(lián)合毒性作用Table 3 The joint toxic action of antimicrobial mixture

綜上，本文制備出3種納米銀復(fù)合材料并對其抗菌性能進(jìn)行探究，研究結(jié)果總結(jié)如下。(1)3種納米銀復(fù)合材料對細(xì)菌的單一毒性大小順序一致，均為AgNPs@SiO2-PD-AgNPs>AgNPs@SiO2>SiO2-PD-AgNPs。此外，E.coli對納米銀復(fù)合材料的敏感度要高于B.subtilis。(2)AgNPs@SiO2-PD-AgNPs與KS在毒性比為1∶1、1∶5和5∶1時(shí)對E.coli的聯(lián)合毒性效應(yīng)為協(xié)同，對B.subtilis的聯(lián)合毒性效應(yīng)為相加，而AgNPs@SiO2-PD-AgNPs與OH對2種菌的聯(lián)合毒性效應(yīng)均為相加。(3)AgNPs@SiO2-PD-AgNPs與KS協(xié)同效應(yīng)產(chǎn)生的主要原因可能是因?yàn)槎呓Y(jié)合而成的KS-納米銀復(fù)合物導(dǎo)致進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)的Ag+和KS相較于單獨(dú)的抗菌劑作用時(shí)均有增加，對細(xì)菌產(chǎn)生更大的毒性作用，表現(xiàn)出協(xié)同抗菌效應(yīng)。因此，可以推測AgNPs@SiO2-PD-AgNPs和KS聯(lián)用會對革蘭氏陰性菌發(fā)揮優(yōu)異的協(xié)同抗菌性能。所以，建議在今后的實(shí)際運(yùn)用中，可以將夾心層結(jié)構(gòu)的納米銀復(fù)合材料和包含有羥基和酰胺基等活性基團(tuán)并且不會與納米銀發(fā)生交互反應(yīng)的抗生素聯(lián)合作用于革蘭氏陰性菌；此外，在此基礎(chǔ)上有必要進(jìn)一步探究對革蘭氏陽性菌也能產(chǎn)生良好協(xié)同抗菌效應(yīng)的納米銀復(fù)合材料與抗生素的組合，為開發(fā)新型抗菌材料提供新思路并為聯(lián)合用藥提供參考。