氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定加熱卷煙煙草材料中8種涼味劑

王紫燕，韓敬美，袁大林，鄭緒東，尚善齋，李志強(qiáng)，任達(dá)兵，易倫朝*，湯建國*

1.云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，昆明市五華區(qū)紅錦路367 號 650231 2.昆明理工大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品學(xué)院，昆明市呈貢區(qū)景明南路727 號 650500

涼味劑是薄荷卷煙中最常見的添加劑之一，能修飾卷煙風(fēng)味，并給消費(fèi)者帶來清涼感，目前在卷煙工業(yè)企業(yè)應(yīng)用廣泛［1-3］。煙草行業(yè)常用的涼味劑有DL-薄荷醇、L-薄荷酮、乙酸薄荷酯、乳酸薄荷酯、異胡薄荷醇、N-乙基-對薄荷基-3-甲酰胺（WS-3，CAS 號：39711-79-0）、N-（乙氧羰基甲 基）-對 烷-3-甲 酰 胺（WS-5，CAS 號：68489-14-5）、N,2,3-三甲基-2-異丙基丁酰胺（WS-23，CAS 號：51115-67-4）等，這些涼味劑通常以多種成分復(fù)配的方式添加于卷煙，進(jìn)而滿足卷煙抽吸口感和實(shí)現(xiàn)涼感持久性［4-5］。目前，針對傳統(tǒng)煙草制品中涼味劑的分析方法主要有頂空氣相色譜法（HS-GC）［1,6］、氣相色譜火焰離子化檢測法（GC-FID）［7］、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）［8-9］、全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜法（GC×GC-TOFMS）［10］、高效液相色譜法（HPLC）［11］、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）［12］、高速逆流色譜法（HPCCC）［13］等。其中，GC-MS 法具有選擇性好、分辨率高、靈敏度高、分析時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，是目前煙草行業(yè)中測定涼味劑應(yīng)用最廣泛的方法［14-18］。采用GC-MS 法測定傳統(tǒng)卷煙中涼味劑含量的方法國內(nèi)外已有文獻(xiàn)報(bào)道［19-21］，但主要是傳統(tǒng)卷煙煙草材料中薄荷醇的定量檢測。孫海峰等［21］建立了用無水乙醇萃取傳統(tǒng)卷煙煙氣、煙絲、濾嘴及添加劑中涼味劑的方法。Reger 等［4］建立了GC-MS 測定煙草制品中薄荷醇及其他煙用香料的方法。近年來，在日趨嚴(yán)峻的控?zé)煭h(huán)境下，加熱卷煙（又名加熱不燃燒卷煙）產(chǎn)品正在快速興起［22］。加熱卷煙用煙草材料類型主要有顆粒型（粉末）、煙絲型和薄片型［23］，通常，加熱卷煙煙草材料中添加了大量的發(fā)煙劑（一般為甘油），以產(chǎn)生氣溶膠［24］。加熱卷煙煙草材料基質(zhì)與傳統(tǒng)卷煙煙草材料有明顯差異。另外，以往文獻(xiàn)方法存在樣品前處理時(shí)間長，樣品用量大，靈敏度較低等不足，檢測的涼味劑種類也較少。為此，本研究中通過樣品前處理?xiàng)l件及色譜條件優(yōu)化，建立基于GC-MS 技術(shù)檢測加熱卷煙薄片、煙絲及煙草粉末中DL-薄荷醇、乳酸薄荷酯、L-薄荷酮、乙酸薄荷酯、異胡薄荷醇、WS-3、WS-5 和WS-23 等8 種涼味劑的分析方法，旨在為加熱卷煙煙草材料中多種涼味劑的同時(shí)檢測提供參考方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

由云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心提供含DL-薄荷醇、乳酸薄荷酯、L-薄荷酮、乙酸薄荷酯、異胡薄荷醇、WS-3、WS-5 和WS-23 的加熱卷煙煙草材料，主要包括薄片、煙絲和煙草粉末。

乳酸薄荷酯（≥98.0%，上海西園生物技術(shù)有限公司）；異胡薄荷醇（≥98.0%，阿法埃沙（中國）化學(xué)有限公司）；WS-3（≥99%，上海阿達(dá)瑪斯試劑有限公司）；WS-5（≥98.0%，上海西園生物技術(shù)有限公司）；WS-23（≥99%，上海阿達(dá)瑪斯試劑有限公司）；DL-薄荷醇、L-薄荷酮、乙酸薄荷酯、苯甲酸丙酯［＞99.0%，梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司］；乙醇［色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司］；甲醇、異丙醇、正己烷（色譜純，德國Merck公司）；二氯甲烷（色譜純，北京百靈威科技有限公司）。

S-CVS/250/900 涂布機(jī)、QS-2A 實(shí)驗(yàn)室煙葉切絲機(jī)（鄭州嘉德機(jī)電科技有限公司）；HH-S114 數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國立試驗(yàn)設(shè)備研究所）；PL7-C平板紙樣干燥器（咸陽泰思特試驗(yàn)設(shè)備有限公司）；2010plus 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本Shimadzu 公司）；XP204 電子天平（感量0.000 1 g，瑞士Mettler-Toledo 公司）；DB-5MS 色譜柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm，美國Agilent 公司）；HU20500B超聲波清洗器（天津市恒奧科技發(fā)展有限公司）；Milli-A10 超純水儀（美國Millipore 公司）。

1.2 方法

內(nèi)標(biāo)溶液：準(zhǔn)確稱量4 g 苯甲酸丙酯，于100 mL 容量瓶中以乙醇定容，充分搖勻得到質(zhì)量濃度為40 mg/mL 的內(nèi)標(biāo)溶液。

混標(biāo)儲備液：分別準(zhǔn)確稱取1 g 異胡薄荷醇、DL-薄荷醇、L-薄荷酮、乙酸薄荷酯、乳酸薄荷酯、WS-3、WS-5 和WS-23，置于10 mL 容量瓶中以乙醇定容，混勻后得到單標(biāo)儲備液。準(zhǔn)確移取8種涼味劑單標(biāo)溶液各5 mL，置于100 mL 容量瓶中以乙醇定容，充分搖勻后得到混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別移取2、20、40、100、200、400 和1 000 μL 混標(biāo)儲備液于10 mL 容量瓶中，再分別加入50 μL 內(nèi)標(biāo)溶液，以乙醇定容，充分搖勻后得到標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.2 樣品制備

分別準(zhǔn)確稱取0.5 g 加熱卷煙煙草材料（薄片、煙草粉末和煙絲），置于50 mL 三角瓶中，加入100 μL 內(nèi)標(biāo)溶液和20 mL 乙醇，超聲5 min；取上清液，用0.45 μm 有機(jī)濾膜過濾，得到待測液。

1.2.3 GC-MS 分析條件

進(jìn)樣口溫度：250 ℃；進(jìn)樣量：1 μL；分流進(jìn)樣，分流比：50∶1；載氣：氦氣（≥99.999%），恒流模式；流速：2 mL/min；程序升溫：初始溫度100 ℃，保持1 min，以10 ℃/min 的速率升溫至150 ℃，保持1 min，再以5 ℃/min 的速率升溫至220 ℃，保持1 min；溶劑延遲時(shí)間：2 min；電離方式：EI；離子源溫度：230 ℃；傳輸線溫度：280 ℃；掃描方式：全掃描（Scan）；質(zhì)量掃描范圍：50 ～1 000 amu。

在創(chuàng)作者的自述中，他像是美學(xué)的傳教士?！皼_洗照片時(shí)，我總是一個(gè)人，在開始之前我會和我的設(shè)備與材料交流，提前對它們表示感謝。當(dāng)我把一張負(fù)片放在放大機(jī)上，暗房就成了一個(gè)神圣的空間，一個(gè)影像的避難所……”通過改變照片的質(zhì)地，威特金賦予照片一種穿越時(shí)空的效果。我們好像通過隱蔽的縫隙，窺見了一個(gè)獨(dú)特的暗箱。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的優(yōu)化

比較了甲醇、乙醇、異丙醇、正己烷和二氯甲烷作為提取溶劑對樣品中涼味劑的提取率。結(jié)果（圖1）表明：正己烷和二氯甲烷對8 種涼味劑的提取效果較好，但穩(wěn)定性不足，所測樣品相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別在1.89%～8.82%和2.02%～9.05%之間；甲醇和乙醇對多數(shù)涼味劑的提取效果無顯著差異，但乙醇對乳酸薄荷酯、乙酸薄荷酯及WS-3的提取效果強(qiáng)于甲醇，且毒性小，成本更低；異丙醇對大多數(shù)涼味劑的提取效果都低于甲醇和乙醇。盡管有研究者［4］用二氯甲烷為提取溶劑提取卷煙中L-薄荷酮、乳酸薄荷酯、DL-薄荷醇、WS-3、WS-23 等物質(zhì)，且目標(biāo)物的檢出限和定量限與本研究中的結(jié)果相近，但正己烷和二氯甲烷的毒性較大，揮發(fā)性較強(qiáng)。由于DL-薄荷醇是加熱卷煙煙草材料中最常用的一種涼味劑，因此進(jìn)一步考察了5 種提取溶劑對DL-薄荷醇的提取效果，結(jié)果顯示，5 種提取溶劑對DL-薄荷醇的提取率順序?yàn)椋赫和椋径燃淄椋疽掖迹炯状迹井惐肌＞C合考慮，選擇乙醇為提取溶劑。

2.1.2 提取溶劑體積的優(yōu)化

考察了5、10、20 mL 提取溶劑對樣品中涼味劑的提取效果。結(jié)果（圖2）顯示，多數(shù)涼味劑提取量隨提取溶劑體積的增大而增加，少數(shù)涼味劑在15 mL 提取溶劑條件下的提取率最高。綜合考慮，選擇提取溶劑體積為20 mL。

圖2 不同提取溶劑體積下測定的加熱卷煙煙草材料中涼味劑含量Fig.2 Cooling agent contents in tobacco materials for heated tobacco products measured at different extraction solvent volumes

2.1.3 樣品量的優(yōu)化

對樣品用量進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果（圖3）顯示，涼味劑提取率隨樣品量的增加而增加，但當(dāng)樣品量超過0.5 g 時(shí)，涼味劑提取率趨于穩(wěn)定或減少。因此，選擇加熱卷煙煙草材料使用量為0.5 g。與文獻(xiàn)［21］相比，本研究中使用的樣品量更少。

2.1.4 提取方式的優(yōu)化

比較了回旋振蕩和超聲振蕩兩種提取方式對加熱卷煙煙草材料中涼味劑的提取效果。結(jié)果表明，在相同提取時(shí)間下，與回旋振蕩方式相比，超聲振蕩方式的涼味劑提取率更高。因此，采用超聲振蕩提取方式。

2.1.5 提取時(shí)間的優(yōu)化

比較了5、15、30 min 超聲振蕩時(shí)間對加熱卷煙煙草材料中涼味劑提取率的影響。結(jié)果（圖4）表明，超聲振蕩5 和15 min 對加熱卷煙煙草材料中涼味劑的提取率無顯著影響，但略高于超聲振蕩30 min 下的提取率，這可能是因?yàn)槌曊袷幪崛∵^程能量較高，溶劑和涼味劑隨超聲振蕩時(shí)間的延長而損失。因此，為節(jié)約時(shí)間成本，采用超聲振蕩5 min。與文獻(xiàn)［21］對比，本研究中提取時(shí)間顯著縮短。

圖3 不同樣品用量下測定的加熱卷煙煙草材料中涼味劑含量Fig.3 Cooling agent contents in tobacco materials for heated tobacco products measured at different sample dosages

圖4 不同提取時(shí)間下測定的加熱卷煙煙草材料中涼味劑含量Fig.4 Cooling agent contents in tobacco materials for heated tobacco products measured at different extraction time

2.2 色譜條件的優(yōu)化

分析討論了載氣流量（1.0、1.5、2.0、2.5 和3.0 mL/min）、分流比（不分流和分流比為10∶1、20∶1、50∶1、80∶1 和100∶1）和程序升溫等條件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，考察了8 種涼味劑在DB-5MS 色譜柱上的分離效果，以確定適宜的色譜分離條件。結(jié)果表明：①隨著載氣流量的增加，多數(shù)涼味劑的峰面積呈上升趨勢，峰寬變窄，當(dāng)流量為2.0 mL/min 后峰面積增加趨緩，峰寬緩慢變寬，為縮短涼味劑出峰時(shí)間，在保證方法靈敏度的前提下，選擇載氣流量為2.0 mL/min。②在分流比較小時(shí)，目標(biāo)物的色譜峰有拖尾現(xiàn)象；在分流比較大時(shí)，目標(biāo)物的色譜峰寬變窄，當(dāng)分流比為50∶1 時(shí)，各成分的分離效果較好，因此選擇分流比為50∶1。③調(diào)整程序升溫條件，對同一標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣品溶液進(jìn)行分析，分析內(nèi)標(biāo)物與目標(biāo)物的出峰情況，最終確定了1.2.3節(jié)所示的程序升溫條件。在優(yōu)化的色譜條件下，樣品溶液中的目標(biāo)物與雜質(zhì)峰實(shí)現(xiàn)了較好分離，可以滿足實(shí)驗(yàn)要求。優(yōu)化條件下樣品色譜圖見圖5。

圖5 優(yōu)化的GC-MS 條件下樣品溶液色譜圖Fig.5 Chromatogram of sample solution under optimized conditions

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、方法的檢出限和定量限

取7 個(gè)不同濃度涼味劑混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（含內(nèi)標(biāo)），采用1.2 節(jié)色譜質(zhì)譜條件進(jìn)行GC-MS 分析，以各涼味劑與內(nèi)標(biāo)的峰面積比為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將最低濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液稀釋10 倍后，平行測定10 次，以所得測定結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)偏差的3 倍作為方法的檢出限（LOD），以所得測定結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)偏差的10 倍作為方法的定量限（LOQ）。本方法線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限見表1。結(jié)果顯示，在測試范圍內(nèi)，質(zhì)譜信號與目標(biāo)物的濃度呈良好線性關(guān)系，所有回歸方程的相關(guān)系數(shù)均≥0.999 6，方法的檢出限和定量限分別為0.25～0.54 μg/g 和0.83～1.80 μg/g。

表1 8 種涼味劑的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限(n=5)Tab.1 Linear ranges,regression equations,correlation coefficients,limits of detection(LOD)and limits of quantification(LOQ)of eight cooling agents(n=5)

2.3.2 方法回收率及精密度

取6 份標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液，在優(yōu)化的色譜質(zhì)譜條件下分別進(jìn)樣分析，計(jì)算各組分與內(nèi)標(biāo)峰面積比的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），考察精密度。取混標(biāo)儲備液進(jìn)行分析，連續(xù)進(jìn)樣5 次，計(jì)算各組分峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），考察日內(nèi)精密度，連續(xù)5 d 進(jìn)樣，考察日間精密度。取已知含量的加熱卷煙煙草材料，分別添加低、中、高3個(gè)水平的涼味劑混標(biāo)3 份，測定添加前后樣品中各涼味劑含量，考察回收率。重復(fù)性、精密度與回收率結(jié)果見表2?？梢钥闯觯核薪M分的RSD 均小于2.07%；日內(nèi)精密度RSD≤2.60%，日間精密度RSD≤3.35%；低、中、高3 個(gè)水平下加標(biāo)回收率分別為85.66%～109.36%、96.08%～105.47%和94.29%～104.12%?？梢?，建立的測定方法精密度和重復(fù)性良好，回收率較高，適用于加熱卷煙煙草材料中涼味劑的檢測。

表2 8 種涼味劑在加熱卷煙煙草材料中的精密度和回收率(n=3)Tab.2 Precision and recovery results of eight cooling agents in tobacco materials for heated tobacco products(n=3)

2.3.3 樣品分析

將建立的方法應(yīng)用于加熱卷煙煙草材料（薄片、煙草粉末、煙絲）中涼味劑的檢測，每個(gè)樣品平行測定3 次，結(jié)果如表3 所示。結(jié)果表明，加熱卷煙煙草材料中大多含有1 種或幾種涼味劑，其中普遍含有DL-薄荷醇。另外，添加的主要涼味劑有L-薄荷酮、乙酸薄荷酯、乳酸薄荷酯、異胡薄荷醇、WS-3、WS-5 和WS-23。且這些涼味劑在薄片、煙草粉末和煙絲中的含量分別為0.65 ～29.40、0.15 ～6.23 mg/g 和0.01 ～3.94 mg/g（n=3），RSD 在0.31%～2.14%之間?？梢?，本方法精密度良好。

表3 不同加熱卷煙煙草材料中涼味劑含量及其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)Tab.3 Cooling agent content and its RSDs in different tobacco materials for heated tobacco products(n=3)

續(xù)表（3）

3 結(jié)論

通過對提取溶劑、提取溶劑體積、樣本用量、提取方式及提取時(shí)間等優(yōu)化，建立了以苯甲酸丙酯為內(nèi)標(biāo)，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）測定加熱卷煙煙草材料中8 種涼味劑含量的檢測方法。該方法前處理簡單、分析速度快且靈敏度較高，適用于加熱卷煙煙草材料中涼味劑的定量檢測。加熱卷煙煙草材料薄片、煙草粉末和煙絲樣品中8種涼味劑的實(shí)測含量分別在0.65 ～29.40、0.15 ～6.23 和0.01 ～3.94 mg/g（n=3）之間，RSD 為0.31%～2.14%。本研究可為含有多種涼味劑的加熱卷煙煙草材料的分析測定提供方法參考。