lncRNA LINC01015在腎癌患者組織中的表達及其對腎癌細胞增殖和遷移的影響

魯帥奇 李小輝 郝彤彤 韓興濤 張 寒

腎癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，起源于腎小管上皮[1]。針對腎癌的治療方式以手術(shù)切除為主，然而腎癌的預后較差且較易復發(fā)，嚴重影響腎癌患者的生命健康[2]。明確腎癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移的分子機制，對于尋找腎癌腫瘤標志物、實現(xiàn)早期診斷和分子靶向治療具有重要意義。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類長度超過200個核苷酸的單鏈RNA，主要定位于細胞核和細胞質(zhì)，不具有編碼蛋白質(zhì)的功能[3]。lncRNA通過表觀遺傳調(diào)控、劑量補償效應、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等多水平影響基因表達，參與人體細胞的分化、組織發(fā)育[4]。大量研究證實，lncRNA在包括腎癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤中異常表達，且與腫瘤細胞的惡性表型如增殖、遷移、侵襲、耐藥性、抗凋亡等顯著相關(guān)[5]。LINC01015屬于lncRNA家族成員，在腎癌中的表達和分子作用機制尚未見報道。本研究通過qPCR技術(shù)在腎癌組織和細胞株中分別檢測LINC01015的表達水平, 并通過轉(zhuǎn)染LINC01015質(zhì)粒，明確高表達LINC01015對腎癌細胞增殖能力、遷移能力的影響，旨在闡明LINC01015在腎癌進展中的作用機制。

材料與方法

1.材料:(1)臨床標本:選取鄭州大學附屬洛陽中心醫(yī)院泌尿外科2017年3月～2018年11月手術(shù)治療的腎癌患者82例，留取保存腎癌組織及癌旁組織，組織標本均經(jīng)病理學確診?；颊吣挲g45.80±11.87歲，術(shù)前均未接受過放射治療、化學治療。本研究經(jīng)筆者醫(yī)院醫(yī)學倫理學委員會批準，患者均簽署知情同意書。(2)細胞與試劑：腎癌細胞株(Caki-1、ACHN、786-O、OS-RC-2、A498)和正常腎小管上皮細胞(HK-2)購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心；LINC01015質(zhì)粒和陰性對照質(zhì)粒購自蘇州吉瑪基因股份有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Hyclone公司；轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM3000購自美國Invitrogen公司；熒光實時定量PCR(qPCR)試劑盒購自天根生化科技有限公司；噻唑藍(methyl thiazol tetrazolium，MTT)試劑盒和二甲基亞砜購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；Transwell小室購自美國康寧公司；一抗購自美國Cell Signaling Technology公司；ECL顯影液購自美國Thermo公司;二抗購自武漢博士德生物有限公司。

2.方法：(1)細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染：Caki-1、ACHN、786-O、OS-RC-2、A498培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，HK-2培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液中，在37℃、5% CO2下常規(guī)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的Caki-1細胞均勻接種于6孔板，當細胞密度達到70%時，采用LipofectamineTM3000 根據(jù)操作說明書將LINC01015質(zhì)粒和陰性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細胞株中，分別命名為實驗組和對照組。轉(zhuǎn)染24h后更換新鮮培養(yǎng)基。(2)qPCR檢測 LINC01015、FBXW7 mRNA的表達水平：腎癌組織和細胞總 RNA采用TRIzol試劑提取，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。產(chǎn)物進行qPCR檢測，內(nèi)參基因為GAPDH。引物序列如下，F(xiàn)BXW7：正向引物：5′-GGCCAAAATGATTCCCAGCAA-3′，反向引物：5′-ACTGGAGTTCGTGACACTGTTA-3′；GAPDH：正向引物：5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′，反向引物：5′-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3′； LINC01015：正向引物：5′-TGAGATAAGGATGCATAGGAGACC-3′，反向引物：5′-TGCCTCATCACCATGTCCT-3′。qPCR反應條件為：95℃ 3min，95℃ 30s，56℃ 15s，68℃ 15s，35個循環(huán)，熒光信號值采用2-ΔΔCt方法計算。(3)MTT法檢測Caki-1細胞增殖能力：將兩組Caki-1細胞以4×103個/200微升的細胞密度接種于96孔板。檢測時，加入20微升/孔 MTT試劑，混勻后于37℃孵育3h，去上清后加入150微升/孔二甲基亞砜，振蕩20min后，酶標儀檢測每孔在450nm波長處的吸光度(A)值。使用MTT法檢測各組細胞在接種后第1、2、3、4、5天的增殖情況。(4)Transwell遷移實驗檢測Caki-1細胞遷移能力:將兩組Caki-1細胞以4×104個/200微升的細胞密度接種于Transwell上室，加入600μl RPMI1640培養(yǎng)液至Transwell下室。培養(yǎng)24h后，取出Transwell上室，棉簽擦去上層未遷移的Caki-1細胞，采用多聚甲醛固定30min，采用結(jié)晶紫染液染色30min，采用PBS溶液洗3次。每孔在100倍顯微鏡下隨機選5個視野拍照、計數(shù)。(5)Western blot法檢測Caki-1細胞FBXW7蛋白表達:使用細胞裂解液進行細胞總蛋白提取，二喹啉甲酸法進行蛋白含量檢測。加樣進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至NC膜。5%脫脂牛奶封閉后，將NC膜進行一抗孵育，在4℃下過夜。洗膜后，將NC膜進行二抗孵育，室溫下孵育3h。洗膜后，使用ECL顯影液曝光顯影。

結(jié) 果

1.腎癌組織和癌旁組織中LINC01015的表達:腎癌組織和癌旁組織中LINC01015的表達分別為1.32±0.41和5.56±0.67，腎癌組織中LINC01015表達低于癌旁組織(P<0.01)。

2.腎癌細胞和正常腎小管上皮細胞中LINC01015的表達:腎癌細胞株(Caki-1、ACHN、786-O、OS-RC-2、A498)和正常腎小管上皮細胞(HK-2)中LINC01015的表達分別為0.11±0.01、0.48±0.04、0.74±0.03、0.34±0.03、0.59± 0.06和1.00±0.02，腎癌細胞系中LINC01015表達均低于正常腎小管上皮細胞(P<0.01)。Caki-1細胞中LINC01015的表達最少(P<0.01)，選擇Caki-1細胞進行后續(xù)實驗(圖1)。

圖1 腎癌細胞和正常腎小管上皮細胞中LINC01015的表達與HK-2細胞比較，*P<0.01

3.兩組Caki-1細胞中LINC01015的表達：收集兩組Caki-1細胞，提取總RNA并應用qPCR檢測LINC01015的表達。實驗組和對照組Caki-1細胞中LINC01015表達分別為11.43±0.77和1.01±0.08，實驗組明顯高于對照組(P<0.01)。

4.高表達LINC01015抑制Caki-1細胞的增殖能力：MTT法檢測兩組Caki-1細胞的增殖能力，從第3天起，實驗組細胞與對照組比較，增殖能力明顯受到抑制(P<0.05，圖2)。

圖2 MTT檢測兩組腎癌Caki-1細胞增殖能力與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

5.高表達LINC01015抑制Caki-1細胞的遷移能力:Transwell遷移實驗檢測兩組Caki-1細胞的遷移能力。實驗組和對照組Caki-1細胞遷移細胞數(shù)分別為68.37±9.64和163.80±21.30，與對照組比較，高表達LINC01015后明顯抑制Caki-1細胞的遷移能力，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，圖3)。

圖3 Transwell遷移實驗檢測LINC01015對腎癌Caki-1細胞遷移能力的影響A.Transwell遷移實驗檢測LINC01015對腎癌Caki-1細胞遷移能力的影響(結(jié)晶紫，×200)；B.遷移細胞數(shù)的半定量分析;與對照組比較，*P<0.01

6.高表達LINC01015上調(diào)腎癌Caki-1細胞中FBXW7 mRNA的表達：qPCR檢測兩組Caki-1細胞FBXW7 mRNA的表達情況，實驗組和對照組Caki-1細胞FBXW7 mRNA的表達分別為5.87±0.49和1.00±0.04， 上調(diào)LINC01015能使FBXW7 mRNA表達水平升高(P<0.01)。

7.高表達LINC01015上調(diào)腎癌Caki-1細胞中蛋白表達：Western blot法檢測結(jié)果顯示，高表達LINC01015引起FBXW7蛋白表達升高，F(xiàn)BXW7蛋白表達升高后，Mcl-1、mTOR、ENO1、HIF-1α等癌蛋白表達明顯降低(圖4)。

圖4 Western blot法檢測蛋白表達情況

討 論

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)由于缺少開放閱讀框架，不能編碼蛋白質(zhì)，以往被認為是轉(zhuǎn)錄過程的“噪聲”，不參與調(diào)控細胞活動[6]。隨著對lncRNA研究的深入，研究者發(fā)現(xiàn)lncRNA可顯著影響染色質(zhì)重塑、基因轉(zhuǎn)錄和基因翻譯過程，影響細胞各種生命活動的調(diào)節(jié)，在疾病進程中表達差異顯著[7]。大量研究表明，lncRNA在腫瘤細胞中低表達或高表達，發(fā)揮致癌因子或抑癌因子效應，在腫瘤標志物和靶向治療方面具有重要的應用價值[8]。近年來，lncRNA已成為腫瘤包括腎癌研究的熱點，lncRNA的異常表達影響腎癌的發(fā)生、發(fā)展。Liu等[9]研究顯示，ZFPM2-AS1在腎癌組織中的表達明顯增加，通過靶向作用于miR-137，參與腎癌的發(fā)生。Shi等[10]報道，lncRNA ROR可通過miR-206/VEGF分子軸，促進腎癌的進展。He等[11]報道，lncRNA FENDRR在腎癌組織中表達明顯降低，F(xiàn)ENDRR表達水平與腎癌患者的預后明顯相關(guān)。LINC01015長度為2874個核苷酸，其在腫瘤特別是腎癌中尚未見報道。本研究結(jié)果表明，腎癌組織中LINC01015的表達低于癌旁組織，腎癌細胞株中的表達低于正常腎小管上皮細胞，LINC01015可能在腎癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮抑癌因子效應。

本研究選取LINC01015表達最低的Caki-1細胞進行轉(zhuǎn)染，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高表達LINC01015可明顯抑制腎癌細胞的增殖能力和遷移能力，進一步證實LINC01015在腎癌中可能發(fā)揮抑癌因子效應。F框/WD重復域蛋白7(F-box and WD repeat domain containing 7，F(xiàn)BXW7)蛋白是F-box蛋白家族成員之一，包括F-box蛋白、D結(jié)構(gòu)域和WD-40重復序列等3個結(jié)構(gòu)域，參與調(diào)控細胞的多個生物學過程。既往研究表明，F(xiàn)BXW7在胰腺癌、乳腺癌、非小細胞肺癌等多種惡性腫瘤中表達降低或功能缺失，與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、耐藥性等惡性表型密切相關(guān)[12～15]。FBXW7作為抑癌基因，在腎癌組織中的表達明顯降低，高表達FBXW7可抑制腎癌細胞的增殖、遷移和侵襲[16, 17]。本研究高表達腎癌Caki-1細胞中LINC01015后，F(xiàn)BXW7基因的表達明顯增加，說明LINC01015具有上調(diào)FBXW7基因表達的作用。研究顯示， FBXW7基因可作為E3泛素連接酶復合物的底物，識別細胞生長和轉(zhuǎn)移相關(guān)癌蛋白如Mcl-1、mTOR、ENO1、HIF-1α的亞基，降解多種癌蛋白的表達，從而抑制腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移[12, 16]。本研究顯示，F(xiàn)BXW7基因表達上調(diào)后，Mcl-1、mTOR、ENO1、HIF-1α等癌蛋白表達明顯降低。LINC01015調(diào)控FBXW7基因的具體分子機制尚不明確，這是下一步研究的重點。

綜上所述，本研究證明了LINC01015在腎癌組織和細胞中呈低表達。高表達LINC01015可抑制腎癌細胞的增殖和遷移能力，其作用機制可能是LINC01015上調(diào)FBXW7基因的表達。