沉默MAT1基因通過(guò)SDF1-CXCR4信號(hào)通路抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖與遷移

巨嘯晨 舒 莉 周 玲 孫榮鑫

骨肉瘤(osteosarcoma，OS)是最常見(jiàn)的原發(fā)性惡性骨腫瘤，起源于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，其特點(diǎn)是進(jìn)展迅速且預(yù)后不良[1,2]。OS主要發(fā)生在兒童和青少年期，據(jù)報(bào)道，年齡15～19歲的發(fā)生率最高，為每年800萬(wàn)～1100萬(wàn)，5年生存率為60%～70%[3，4]。一些患者在確診時(shí)即可出現(xiàn)轉(zhuǎn)移性病灶，另外還有一些無(wú)法辨別的亞臨床癥狀的微小轉(zhuǎn)移， 致使該病的治療效果不甚理想[5，6]。目前，OS的主要治療手段是手術(shù)并輔以放療和化療[7,8]。近年來(lái)，盡管外科手術(shù)方法有所改善，但骨肉瘤患者的生存率并沒(méi)有得到明顯提高，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的概率仍然較大。因此，進(jìn)一步探索OS發(fā)展的機(jī)制并尋找治療骨肉瘤治療的新方法是十分迫切的。

細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶活化激酶 (cyclin dependent kinase-activating kinase，CDK) 通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期在細(xì)胞形成以及增殖過(guò)程中具有重要作用[9]。CDK的磷酸化由CDK激活激酶(CAK)執(zhí)行的，CAK是由CDK7、細(xì)胞周期蛋白H和輔助蛋白MAT1組成的三聚體復(fù)合物[10]。其中，MAT1作為CAK的重要組成部分，在多數(shù)癌細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)，并參與癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為[11]。有研究表明，MAT1的缺失會(huì)阻礙抑癌蛋白的磷酸化并誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞中的G1阻滯，說(shuō)明MAT1可能在骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展中起到了一定的作用[12]。本研究通過(guò)RNAi 技術(shù)沉默骨肉瘤細(xì)胞143B細(xì)胞中MAT1的表達(dá)，旨在探討沉默MAT1 表達(dá)后對(duì)143細(xì)胞增殖、遷移的影響，并揭示其潛在機(jī)制。

材料與方法

1.主要試劑與材料：人骨肉瘤細(xì)胞株Saos-2、MG63、U2OS、143B與人成骨細(xì)胞hFOB1.19購(gòu)自美國(guó)美國(guó)菌種保藏中心ATCC。本研究主要試劑包括TRIzol試劑與LipofectamineTM 2000 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司，胎牛血清、100U/ml 青霉素和100μg/ml鏈霉素、DMEM/F12培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó) Gibco 公司，RNase和PI試劑購(gòu)自江蘇凱基公司，TRIzol試劑、Prime ScriptTMRT reagent Kit試劑盒以及SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒均購(gòu)自日本TaKaRa公司，CCK-8試劑盒、RIPA 裂解液與BCA蛋白測(cè)定試劑盒均購(gòu)自美國(guó) Bio-Rad 公司，Transwell 小室購(gòu)自美國(guó) Costar公司。

2.細(xì)胞培養(yǎng)：將骨肉瘤細(xì)胞株Saos-2、MG63、U2OS、143B以及人成骨細(xì)胞hFOB1.19置于含有10%胎牛血清、100U/ml 青霉素和100μg/ml鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中，在5%CO2、37℃的細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到 80%～90%時(shí)，加0.25%胰蛋白酶消化傳代。本研究所有細(xì)胞均為生長(zhǎng)良好的第3代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

3.qRT-PCR：使用TRIzol試劑從各細(xì)胞系(hBMSCs、hFOB1.19、Saos-2、MG63和U2OS)中提取總RNA。按照Prime ScriptTM RT Reagent Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作獲得cDNA。根據(jù)SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ說(shuō)明并以GAPDH 作為內(nèi)參基因檢測(cè)MAT1 mRNA的表達(dá)。擴(kuò)增體系：上游引物1μl、下游引物1μl、cDNA 2μl、SYBR Premix Ex TaqⅡ 12.5μl、無(wú)酶水補(bǔ)足25μl。擴(kuò)增條件：95℃ 3min，95℃ 30s，60℃ 30s，58℃ 30s，40個(gè)循環(huán)。使用2-ΔΔCt法來(lái)計(jì)算MAT1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。使用的引物由上海生工生物有限公司合成，具體序列如下：MAT1上游引物：5′-ACTGCCCTGAGTGTGGTACT-3′，下游引物：5′-TGAAATATGTTGACCCAGCTCATCT-3′；GAPDH上游引物：5′-TTTGCGTCGCCAGGTGAAGA-3′，下游引物：5′-AGTTAAAAGCAGCCCTGGTGA-3′。

4.siRNA 轉(zhuǎn)染：將143B細(xì)胞以 2×105個(gè)/孔的密度接種于 6 孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞密度達(dá)到70%左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。細(xì)胞分為空白對(duì)照組(正常培養(yǎng)，不進(jìn)行轉(zhuǎn)染)、陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照 siRNA-NC)和 siRNA-MAT1 組(轉(zhuǎn)染 siRNA-MAT1)，siRNA序列由上海生工生物有限公司設(shè)計(jì)并合成。根據(jù) Lipofectamine TM 2000 說(shuō)明書(shū)操作，分別將 5μg siRNA 與 250μl OPTI-MEM、10μl 脂質(zhì)體與250μl OPTI-MEM輕柔混勻，室溫孵育10min，然后將兩種稀釋物混合均勻，室溫孵育20min。將混合后的轉(zhuǎn)染試劑加入培養(yǎng)的細(xì)胞中，在37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育 6h，棄原培養(yǎng)基，更換為DMEM新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)。

5.CCK-8測(cè)定：轉(zhuǎn)染后48h，將各組143B細(xì)胞以1×104個(gè)/孔的密度接種到96孔板中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)孵育。使用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的增殖力，分別于24、48、72、96h時(shí)，每孔加10μl CCK-8溶液，再將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h，在酶標(biāo)儀上450nm 處檢測(cè)各孔吸光光度值。

6.流式細(xì)胞術(shù)：轉(zhuǎn)染后48h，收集各組143B細(xì)胞用于細(xì)胞周期分析。使用PBS洗滌細(xì)胞，在4℃的75%乙醇中固定24h，去除乙醇，PBS洗滌重懸細(xì)胞，加10μl RNase在37℃下孵育10min，再加入5μl PI 37℃避光孵育30min，過(guò)300目篩網(wǎng)，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

7.Transwell小室：轉(zhuǎn)染后48h，將各組143B細(xì)胞以2×104個(gè)/孔的密度接種于Transwell 小室的上室，并加100μl 無(wú)血清培養(yǎng)基，下室中加入600μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，放入37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24h后取出小室，棄培養(yǎng)液，PBS洗滌，置于40g/L甲醛中固定20min，0.1%結(jié)晶紫染色30min，PBS再次洗滌，棉簽擦拭掉上層未穿過(guò)基膜的細(xì)胞，封片后使用倒置顯微鏡觀察拍照并計(jì)數(shù)。

8.Western blot法檢測(cè)：轉(zhuǎn)染后48h，使用 RIPA 裂解液抽提各組143B細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。取20μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，分離的蛋白切膠并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2h，分別加入兔抗SDF-1(1∶500)、兔抗CXCR4(1∶500)、鼠抗β-actin(1∶1000)于4℃孵育過(guò)夜，次日使用PBS洗滌3次，每次10min，再用加HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶5000)室溫孵育2h，PBS洗滌3次，每次10min，在暗室用ECL發(fā)光液檢測(cè)，用掃描儀掃描X線片，用ProtParam 軟件對(duì)灰度值進(jìn)行分析，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

結(jié) 果

1.MAT1在骨肉瘤細(xì)胞中高表達(dá)：qRT-PCR檢測(cè)MAT1 mRNA在骨肉瘤細(xì)胞株Saos-2、MG63、U2OS、143B以及人成骨細(xì)胞hFOB1.19中的表達(dá)水平。與hFOB1.19細(xì)胞比較，Saos-2、MG63、U2OS細(xì)胞中MAT1 mRNA的表達(dá)水平均明顯升高(P<0.01)，其中143B細(xì)胞中MAT1 mRNA的表達(dá)水平顯著升高(P=0.000，圖1)。選擇143B細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞MAT1 mRNA表達(dá)水平與hFOB1.19細(xì)胞比較，*P<0.01，**P=0.000

2.沉默MAT1對(duì)骨肉瘤細(xì)胞143B增殖的影響：qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組143B細(xì)胞中MAT1 mRNA的表達(dá)水平，與Blank組比較，siRNA-NC組MAT1 mRNA的表達(dá)水平無(wú)顯著變化，而siRNA-MAT1組MAT1 mRNA的表達(dá)水平較Blank組和siRNA-NC組明顯下降(P<0.01，圖2)，表明轉(zhuǎn)染siRNA成功。CCK-8檢測(cè)在轉(zhuǎn)染143B細(xì)胞后24、48、72、96h時(shí)細(xì)胞的增殖能力，轉(zhuǎn)染siRNA-MAT1的細(xì)胞增殖活性較低，在72h時(shí)siRNA-MAT1組細(xì)胞增殖活力顯著低于Blank組和siRNA-NC組(P<0.01，圖3)。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組143B細(xì)胞的周期變化，Blank組和siRNA-NC組中細(xì)胞G1期比例分別為48.22%、47.89%，S期比例為32.41%、30.67%。而siRNA-MAT1組細(xì)胞G1期比例增加，達(dá)到60.23%， S 期比例下降至23.55%(圖4)。

圖2 qRT-PCR檢測(cè)各組轉(zhuǎn)染143B細(xì)胞MAT1 mRNA表達(dá)與Blank組比較，*P<0.01;與siRNA-NC組比較，#P<0.01

圖3 CCK-8檢測(cè)各組轉(zhuǎn)染143B細(xì)胞增殖活力與Blank組比較，*P<0.01；與siRNA-NC組比較，#P<0.01

3.沉默MAT1對(duì)骨肉瘤細(xì)胞143B遷移的影響：通過(guò)Transwell 小室法對(duì)轉(zhuǎn)染后各組143B細(xì)胞的遷移能力進(jìn)行分析，siRNA-MAT1組143B細(xì)胞遷移的細(xì)胞數(shù)目明顯低于對(duì)照組和siRNA-NC組(P<0.01)，而siRNA-NC組較Blank組細(xì)胞遷移的細(xì)胞數(shù)目無(wú)顯著變化(圖5)。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組轉(zhuǎn)染143B細(xì)胞周期變化

4.沉默MAT1對(duì)骨肉瘤細(xì)胞143B中 SDF-1/CXCR4信號(hào)通路的影響：Western blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組143B細(xì)胞中SDF-1與CXCR4蛋白表達(dá)情況，siRNA-NC組SDF-1和CXCR4蛋白表達(dá)水平較Blank組無(wú)顯著變化，而沉默143B細(xì)胞中MAT1的表達(dá)后，細(xì)胞中SDF-1與CXCR4蛋白表達(dá)相對(duì)于Blank組和siRNA-NC組細(xì)胞均顯著降低(P<0.01)，詳見(jiàn)圖6。

圖6 Western blot法檢測(cè)各組轉(zhuǎn)染143B細(xì)胞SDF-1與CXCR4蛋白表達(dá)與Blank組比較，*P<0.01；與siRNA-NC組比較，#P<0.01

討 論

惡性腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致OS患者治療失敗的主要原因[13]。深入研究骨肉瘤的發(fā)病機(jī)制并尋找新型治療方法，這對(duì)提高OS臨床治療效果是至關(guān)重要的。而骨肉瘤的發(fā)病機(jī)制與許多基因的途徑相關(guān)，因此，探討骨肉瘤中相關(guān)基因改變的研究將有助于理解其轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制并確定潛在的治療靶標(biāo)。

MAT1基因編碼的蛋白質(zhì)可以通過(guò)蘇氨酸磷酸化來(lái)激活與細(xì)胞周期蛋白相關(guān)的激酶[12]。已有研究發(fā)現(xiàn)，MAT1在細(xì)胞增殖、分化和胚胎發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用[11,14]。例如，Liu等[15]通過(guò)用siRNA或重組腺病毒轉(zhuǎn)染敲除MAT1后，研究表明人胰腺癌的細(xì)胞增殖力明顯降低并誘導(dǎo)了G0/G1期的阻滯。Fejzo等[16]揭示了ADRM1的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了卵巢癌ES2細(xì)胞的增殖和遷移能力，而MAT1的表達(dá)也升高，這表明MAT1可能參與了腫瘤的轉(zhuǎn)移。本研究RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，MAT1在骨肉瘤細(xì)胞株Saos-2、MG63、U2OS以及143B中均高表達(dá)，這也提示MAT1可能與骨肉瘤的發(fā)生有關(guān)。RNAi技術(shù)是分子生物學(xué)研究中干擾基因表達(dá)以及研究基因功能的基因調(diào)控手段，能夠與靶基因在特定區(qū)域特異性結(jié)合來(lái)切割 mRNA 使靶基因降解[17]。本研究通過(guò)RNAi 技術(shù)沉默骨肉瘤143B細(xì)胞中MAT1的表達(dá)檢測(cè)其對(duì)143B增殖和遷移的影響。沉默143B細(xì)胞中MAT1的表達(dá)后，通過(guò)CCK-8檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在24、48、72、96h細(xì)胞增殖能力均受到抑制，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示細(xì)胞G1期比例增加而S 期比例下降，Transwell小室細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示細(xì)胞遷移率明顯下降。說(shuō)明沉默MAT1表達(dá)能夠抑制 143B細(xì)胞增殖與遷移，并阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程。

基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1 (SDF-1)及其特異性趨化因子受體4(CXCR4)在肺癌、大腸癌、乳腺癌及甲狀腺癌等多種腫瘤實(shí)質(zhì)細(xì)胞中廣泛表達(dá)，并在惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、侵襲與遷移等過(guò)程中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[18～21]。兩者特異性結(jié)合發(fā)生空間構(gòu)象改變，與此同時(shí)，通過(guò)活化與其偶聯(lián)的G蛋白并激活多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，以產(chǎn)生相關(guān)聯(lián)的生物學(xué)效應(yīng)。Liao等[22]通過(guò)在體外和小鼠實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，AMD3100通過(guò)抑制JNK和Akt通路降低了CXCR4介導(dǎo)的骨肉瘤轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果證實(shí)，沉默MAT1表達(dá)也能夠抑制骨肉瘤143B細(xì)胞中SDF-1與CXCR4蛋白表達(dá)。但其激活作用或共同參與這一過(guò)程的其他信號(hào)通路有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，MAT1與骨肉瘤的發(fā)展進(jìn)程關(guān)系密切，通過(guò)本研究表明沉默MAT1表達(dá)可以抑制骨肉瘤143B細(xì)胞的增殖與遷移、阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程，機(jī)制可能與下調(diào) SDF-1與CXCR4表達(dá)有關(guān)。