不同采收期壇紫菜中半乳聚糖硫酸酯的結構特征分析

張忠山， 王曉梅， 劉重斌， 王占旗， 潘永良， 張紹勇

(湖州師范學院 浙江省媒介生物學與病原控制重點實驗室， 浙江 湖州 313000)

0 引 言

壇紫菜(Porphyrahaitanensis)，俗名烏菜，是中國特有的一種可人工栽培的海藻.作為浙江、福建和廣東的主要栽培藻類，壇紫菜富含蛋白質、多糖和維生素等營養(yǎng)成分，素有“營養(yǎng)寶庫”的美稱[1].壇紫菜是分期采割的，采收期從秋后開始可持續(xù)到翌年2月份.整個采收期可以采收5～6茬，頭茬稱為頭水或一水，口感最好，售價也最高.此后的幾茬依次稱為二水、三水至末水.越往后采收的壇紫菜，口感越差，獲利也越少[2].產品口感與營養(yǎng)成分有很大關系，而營養(yǎng)成分隨生長環(huán)境變化而變化.因此研究不同采收期壇紫菜的營養(yǎng)成分變化，對探索其口感變化具有重要意義.

壇紫菜中營養(yǎng)成分最多的是碳水化合物，它是決定壇紫菜口感的重要指標.碳水化合物包括纖維素、淀粉、半乳聚糖3類.壇紫菜通過光合作用的卡爾文循環(huán)產生的三碳糖經(jīng)過二次分配合成上述3種碳水化合物，三者相互轉化和代謝，共同調控壇紫菜的糖代謝流程.隨著采收期的溫度不斷降低，三者會通過相關含量動態(tài)變化應答低溫脅迫[3].研究發(fā)現(xiàn)，半乳聚糖占壇紫菜干重的20%～40%，是壇紫菜體內含量最多的營養(yǎng)成分.隨著整個采收期內采收溫度的降低，壇紫菜體內半乳聚糖的含量和結構必然發(fā)生改變，以適應低溫脅迫的影響.本文測定不同采收期壇紫菜中幾種多糖成分的含量變化，提取壇紫菜中的半乳聚糖硫酸酯進行成分測定和結構解析，探索不同采收期壇紫菜中半乳聚糖硫酸酯響應低溫脅迫的調控變化，為解析其生物合成途徑提供依據(jù).

1 實驗材料與方法

1.1 試劑與設備

Nicolet Avatar 360型紅外光譜儀(美國Nicolet Instrument Corporation 公司)、LC-10A高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司)、AVANCE 600-MHz核磁共振儀(瑞士Bruker公司)、凱氏定氮儀(上海沛歐分析儀器有限公司)、SP-752型紫外可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司)、溴化鉀(天津博君科技有限公司，光譜純)，其他試劑均為分析純.

1.2 實驗材料

不同采收期的壇紫菜于2017年10月15日開始在浙江省溫州市洞頭養(yǎng)殖場采集，每20 d采集1次，共采集一水至六水6個樣品，用海水洗凈后，低溫烘干備用.

1.3 營養(yǎng)成分檢測

蛋白質含量測定采用凱氏定氮法[4]；纖維素含量測定采用中性洗滌劑法[5]；灰分含量測定采用高溫灼燒法[6].

取各組壇紫菜藻體研磨成漿加鹽酸溶液水解后，再加堿中和定容，用蒽酮硫酸法測定總糖含量；勻漿藻體加水提取后過濾定容，用蒽酮硫酸法測定半乳聚糖含量.經(jīng)上述過程提取可溶性糖后的殘渣經(jīng)沸水浴煮沸，再加高氯酸提取后定容，用蒽酮硫酸法測定紅藻淀粉含量[7].

1.4 半乳聚糖硫酸酯提取

稱取粉碎的壇紫菜藻粉，加入一定量的甲醇浸泡后晾干，再加入40倍水于105 ℃加熱提取3 h，過濾殘渣后，上清液裝入透析袋進行透析.透析液經(jīng)旋轉蒸發(fā)濃縮后加入4倍乙醇攪拌沉淀，經(jīng)無水乙醇洗滌2～3次后干燥，即得半乳聚糖硫酸酯.

1.5 半乳聚糖硫酸酯化學成分檢測

總糖含量測定采用苯酚硫酸法[7]；硫酸根含量測定采用明膠氯化鋇法[8]；3,6-內醚半乳糖含量測定采用間苯二酚比色法[9].

1.6 儀器分析法

稱取半乳聚糖硫酸酯粉末與適量的光譜純溴化鉀，經(jīng)研磨混勻后壓片，于400～4 000 cm-1波長范圍內進行紅外光譜掃描.樣品配成一定濃度溶液于高效液相色譜儀(示差檢測器)檢測相對分子量.稱取樣品溶于一定量的D2O中，于核磁共振儀中，記錄氫譜和碳譜信號，分析樣品中的C、H類型和相關化合物的特點.

2 結果與討論

2.1 不同采收期壇紫菜營養(yǎng)成分變化

不同采收期壇紫菜的基本營養(yǎng)成分見表1.由表1看出，不同采收期壇紫菜中各成分含量存在一定的變化規(guī)律.蛋白質是壇紫菜中重要的營養(yǎng)物質，隨著采收期的延長，其含量逐漸減少，但總糖含量逐漸增加.幾種碳水化合物的含量呈現(xiàn)不同的變化.隨著采收期的推移，纖維素含量逐漸增加，這可能與溫度和光照不斷降低有關，纖維素合成酶在此過程中對其影響較大.前兩個月內，壇紫菜中紅藻淀粉的含量逐漸增多，12月后逐漸減少，衰老期含量下降至最低，說明壇紫菜中紅藻淀粉的積累存在一個最適宜的溫度，較低溫度不利于紅藻淀粉的合成.纖維素和紅藻淀粉是壇紫菜應答低溫脅迫的主要因子，其含量增加也是壇紫菜衰老的表現(xiàn).半乳聚糖含量逐漸降低至穩(wěn)定狀態(tài)，這是因為壇紫菜中其他糖類物質積累以抵御低溫脅迫，從而造成半乳聚糖含量下降.

表1 不同采收期壇紫菜的基本營養(yǎng)成分Tab.1 Nutritional composition of P. haitanensis at different harvest time

2.2 半乳聚糖硫酸酯化學成分檢測

如表2所示，隨著采收期的推移，壇紫菜半乳聚糖硫酸酯中總糖含量逐漸降低，3,6-內醚半乳糖含量逐漸增加，說明組織的老化有利于3,6-內醚半乳糖的合成.硫酸基含量先增加后減少，四水時達到最多，之后逐漸下降，這與硫酸基合成酶有關.各水壇紫菜中半乳聚糖硫酸酯分子量也有不同變化.從一水至四水，半乳聚糖硫酸酯分子量逐漸減小，四水后逐漸增大，但總體變化不大.

表2 不同采收期壇紫菜中半乳聚糖硫酸酯的化學成分和分子量Tab.2 Chemical composition and molecular weight of galactosan sulfate in P. haitanensis at different harvest time

2.3 紅外光譜分析

圖1為6個樣品半乳聚糖硫酸酯的紅外光譜.由圖1可見，所有樣品均具有多糖的基本特征.其中，3 405 cm-1和1 650 cm-1左右的峰是多糖OH伸縮和彎曲的振動吸收峰；930 cm-1處的峰代表3,6-內醚半乳糖的吸收峰，從一水至六水峰的強度逐漸增大，說明3,6-內醚半乳糖的含量有上升趨勢；1 250 cm-1、1 360 cm-1和1 420 cm-1左右的峰代表硫酸基吸收峰，從一水至四水，其峰的強度有加大趨勢，四水后有減小趨勢，與化學分析的含量變化一致；820 cm-1左右的峰表明有6-硫酸基-半乳糖；1 540 cm-1左右的弱小峰表明有含氮化合物，且強度逐漸減小，說明蛋白質含量有所減少.

2.4 核磁共振波譜分析

圖2為各采收期壇紫菜中半乳聚糖硫酸酯的核磁共振碳譜，表明所有樣品都含有瓊膠糖及其前體，即由1,3-β-D-半乳糖和1,4-3,6-內醚半乳糖-α-L半乳糖組成.59.5 ppm左右的峰是OCH3的信號，從一水至六水，該甲基信號逐漸增強.尤其對六水壇紫菜，70.6 ppm和73.4 ppm處的峰明顯表明含有較多的6-OCH3-D-半乳糖，說明隨著采收期的推移，D-半乳糖甲基化程度增加.根據(jù)瓊膠糖及其前體的C1位(分別標記為A98.1 ppm和A*101.4 ppm)的相對強度，可以估算出瓊膠糖前體在多糖中的比例.由圖2看出，從一水至六水，瓊膠糖前體的比例逐漸減少，3,6-內醚半乳糖含量逐漸增加.

圖3是各采收期壇紫菜中半乳聚糖硫酸酯的核磁共振氫譜.3.30 ppm左右的信號是6-O-CH3-半乳糖殘基中CH3的H化學位移.隨著采收期的推移，該信號強度逐漸增強，代表6-O-CH3-半乳糖含量逐漸增多，與碳譜結果一致.微弱的3.50 ppm左右的信號為極少量的2-O-甲基-3,6-內醚半乳糖中甲基H的化學位移，從一水至六水，該信號強度逐漸增加，說明甲基化酶在起作用.

3 結 論

隨著采收期的推移，水溫逐漸降低，壇紫菜中各糖類物質發(fā)生不同的變化.推測認為這種變化是由系列酶或基因調控的.在采收前期，壇紫菜中半乳聚糖硫酸酯合成的是瓊膠糖的生物前體.隨著采收期的推移，L-半乳糖逐漸向3,6-內醚半乳糖轉化，同時D-半乳糖的6位甲基化程度增加.在采收末期，壇紫菜內形成了瓊膠糖生物前體與瓊膠糖并存的情況.糖代謝作為植物體內生物代謝的中心，對植物的生長發(fā)育和抵抗脅迫具有重要的調節(jié)作用.低溫脅迫下，不僅壇紫菜的糖含量發(fā)生變化，而且糖還能對生物膜起到保護作用，使?jié)B透勢降低，以維持細胞結構穩(wěn)定.下一步將通過排除壇紫菜不同個體遺傳特征后，利用低溫脅迫對同一個體的糖代謝過程進行研究，以深入探討壇紫菜糖代謝對低溫脅迫的響應機制.