棘白菌素類(lèi)抗真菌藥物的耐藥機(jī)制分析*

張 靈，楊 勇

（1. 電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院·個(gè)體化藥物治療四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611731； 2. 四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院藥學(xué)部，四川 成都 610072）

目前，全球真菌年感染例次超100 萬(wàn)，且感染率仍在不斷升高，艾滋病、癌癥患者在晚期易受真菌感染。治療侵入性真菌感染一般要用抗真菌藥物，包括唑類(lèi)、棘白菌素類(lèi)等，但長(zhǎng)期用藥易引發(fā)耐藥風(fēng)險(xiǎn)。光滑念珠菌在念珠菌感染中屬重要病原菌，耐藥性高，多以棘白菌素類(lèi)相關(guān)的抗菌藥物（如米卡芬凈）等抑制。近年來(lái)棘白菌素治療失敗及念珠菌暴發(fā)感染的病例時(shí)有報(bào)道，棘白菌素耐藥率不斷升高，特別是長(zhǎng)期接受治療的危重患者。在此，對(duì)其耐藥機(jī)制的相關(guān)研究進(jìn)行了綜述，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 藥物簡(jiǎn)介

常用藥物包括卡泊芬凈、阿尼芬凈等，從組分看屬新型脂肽類(lèi)化合物，目前在臨床廣泛應(yīng)用，由于微生物的來(lái)源不同，適用范圍各異，且脂肪酸鏈也各有不同。

棘白菌素類(lèi)藥物為廣譜抗菌藥物，可有效阻礙真菌細(xì)胞壁β-1，3- D-葡聚糖合成，抑制真菌生長(zhǎng)代謝，并促使真菌溶解死亡。美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）發(fā)現(xiàn)，該類(lèi)藥對(duì)念珠菌血癥的療效確切，敏感性高，且不會(huì)引發(fā)明顯的不良反應(yīng)，推薦用于侵入性念珠菌感染的治療；還發(fā)現(xiàn)其對(duì)造血干細(xì)胞移植患者可起到一定預(yù)防感染的作用，且療效明顯優(yōu)于唑類(lèi)藥物，患者病情很?chē)?yán)重并對(duì)唑類(lèi)藥物有抗性的情況下，可優(yōu)先選擇棘白菌素類(lèi)藥物治療[1]。

臨床研究表明，棘白菌素類(lèi)藥物口服生物利用度不高，在實(shí)際應(yīng)用中主要選擇效率更高的靜脈注射給藥。該類(lèi)藥與血清蛋白結(jié)合率為97% ～99.8%，在人體組織中廣泛分布。

棘白菌素類(lèi)藥物對(duì)大多數(shù)念珠菌屬有活性，體外環(huán)境中也可取得良好的滅菌效果，但對(duì)曲霉菌只有輕微抑制作用。該類(lèi)藥物可在裂解基礎(chǔ)上改變菌絲的形態(tài)而殺菌。棘白菌素類(lèi)藥物無(wú)法有效抑制毛霉菌屬、隱球菌屬相關(guān)真菌，但對(duì)光滑念珠菌活性很高，而在抗菌方面其機(jī)制和唑類(lèi)藥物有差異[2]，高度唑類(lèi)抗性菌株中存在一定外排底物，與其抗藥性密切相關(guān)[2]。棘白菌素的療效指數(shù)高，由于人體欠缺該類(lèi)型葡聚糖合成酶，對(duì)大部分患者的安全性均較高，肝毒性與腎毒性較低，另外在使用過(guò)程中藥效平穩(wěn)，故在臨床使用廣泛。

2 真菌耐藥機(jī)制

棘白菌素類(lèi)藥物耐藥性的受重視程度比其他抗真菌藥物弱，耐藥機(jī)制的研究有限，相關(guān)的參考資料也有較大缺失。棘白菌素類(lèi)抗真菌藥物的耐藥機(jī)制在細(xì)胞層面及基因?qū)用婢憩F(xiàn)出特異性，相關(guān)研究可從這些方面入手。

目前，真菌耐藥的形勢(shì)嚴(yán)峻，常見(jiàn)機(jī)制包括Fks1 介導(dǎo)的耐藥機(jī)制、高劑量水平下的突破生長(zhǎng)、細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)、內(nèi)源性機(jī)制等。盡管棘白菌素類(lèi)藥物安全性較高，但也發(fā)現(xiàn)了一定的心臟毒性[3]。在抗真菌藥物中，棘白菌素類(lèi)占據(jù)了重要地位。有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)KS 突變與耐藥密切相關(guān)，因而棘白菌素的敏感性就可通過(guò)檢測(cè)這種基因的突變性而確定。

3 棘白菌素類(lèi)可能的耐藥機(jī)制

3.1 Fks1 介導(dǎo)的耐藥機(jī)制

3.1.1 Fks1 突變導(dǎo)致白色念珠菌敏感性降低

DENNING[4]研究發(fā)現(xiàn)，白色念珠菌的抗藥性可能和基因突變相關(guān)，而在一些針對(duì)該類(lèi)真菌的遺傳試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ks1 可能為一種靶點(diǎn)，而Fks1 為由Fks1 編碼的一種酶的亞基，在菌株Fks1 突變情況下可有效耐受脂肽類(lèi)抗菌藥物，達(dá)到很高的耐藥性。推斷在這種基因突變影響下，棘白菌素類(lèi)藥物對(duì)白色念珠菌的抗菌效果顯著降低[3]。一些學(xué)者在研究中檢測(cè)分析了該類(lèi)真菌的基因突變情況，結(jié)果Fks1 的2個(gè)區(qū)域出現(xiàn)了點(diǎn)突變，相關(guān)氨基酸區(qū)也產(chǎn)生了一定改變。與此相關(guān)的突變主要分為S645P 和S645F 等，且在易感菌株中該區(qū)域突變情況下，對(duì)應(yīng)菌株耐壓性升高，導(dǎo)致棘白菌素類(lèi)藥物的抗菌效果顯著降低。而這種藥物活性的降低是否是因?yàn)樵搮^(qū)域含這類(lèi)藥物的結(jié)合區(qū)，目前尚無(wú)定論。

Fks1 的F639I 在酵母菌中的作用相同，對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)其機(jī)制也類(lèi)似。由此可判斷，HS 區(qū)域的突變對(duì)該藥物的耐藥產(chǎn)生明顯影響。同一患者各處采集的菌株存在一定差異，這些菌株的Fks1 突變不一致，不過(guò)在這種突變影響下都會(huì)產(chǎn)生耐藥性。多位點(diǎn)序列研究結(jié)果表明，這些突變菌株的表型無(wú)明顯差異性，耐藥性的影響因素復(fù)雜，多種環(huán)境或因素都可引發(fā)[5]。WIEDERHOLD 等[6]選擇相關(guān)的合成酶為對(duì)象進(jìn)行分析，所得結(jié)果促進(jìn)了對(duì)Fks1 突變和耐藥性的研究。研究發(fā)現(xiàn)，HS 突變會(huì)降低其藥物敏感性[5]。對(duì)比分析結(jié)果表明，卡泊芬凈對(duì)S645P突變酶的抑制濃度顯著升高；在HS1 區(qū)C 位末端突變情況下獲得的酶，其耐藥性明顯低于其他突變[6]。

此外，耐藥性也和單一的Fks1 突變相關(guān)，由此可判斷出HS 區(qū)域突變很大可能為顯性，而其純合子的突變會(huì)引發(fā)耐藥性。BOWMAN 等[7]選擇鼠感染模型進(jìn)行模擬研究，所得結(jié)果基本一致。有研究對(duì)比分析了2個(gè)等位基因都產(chǎn)生突變的分離株，結(jié)果99%的個(gè)體產(chǎn)生效應(yīng)的劑量（ ED99）增幅最大可到野生型的1000 倍；對(duì)應(yīng)的雜合子的ED99增幅最大可到野生型的70 倍[8]。表明通過(guò)動(dòng)物模型可對(duì)其純合子和雜合子進(jìn)行高效區(qū)分，也可在此基礎(chǔ)上對(duì)該細(xì)菌的敏感性進(jìn)行評(píng)價(jià)。通過(guò)臨床抗性的氨基酸變化譜（見(jiàn)表1）可明確基因類(lèi)型。

表1 賦予臨床抗性的Fks 氨基酸變化譜

3.1.2 Fks1 機(jī)制導(dǎo)致其他念珠菌敏感性降低

從患者體內(nèi)采集獲得的耐藥性菌株，對(duì)應(yīng)的耐藥機(jī)制均與Fks1 機(jī)制有關(guān)，如都柏林念珠菌等[9]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，該類(lèi)菌株對(duì)棘白菌素類(lèi)的耐藥性基本一致，且耐藥機(jī)制相同，并在HS 區(qū)域也發(fā)現(xiàn)了明顯的基因突變。在Fks2 的HS1 突變情況下，光滑念珠菌也表現(xiàn)出一定耐藥性，針對(duì)克柔念珠菌的檢測(cè)結(jié)果表明，耐藥菌株中出現(xiàn)了HS1 突變[9]。該結(jié)論也證明了HS 區(qū)域突變相關(guān)的葡聚糖合成酶的藥物敏感性降低，其耐藥機(jī)制可能如此。該類(lèi)藥物對(duì)平滑念珠菌相關(guān)感染的效果顯著，最低抑菌濃度（MIC）更高（0.5 ～8.0 μg／mL），且明顯高于同類(lèi)型真菌。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，這種差異很有可能與Fks1 HS1／HS2 區(qū)域的氨基酸多態(tài)性相關(guān)。

在近平滑念珠菌中，Pro649 氨基酸表現(xiàn)出隨機(jī)多態(tài)性，對(duì)比分析結(jié)果表明，該種真菌中同樣存在相應(yīng)P649A 多態(tài)性，而對(duì)比發(fā)現(xiàn)其敏感性有一定降低。試驗(yàn)結(jié)果表明，其HS2 區(qū)域中同時(shí)還存在I1359V 多態(tài)性，在此因素影響下，相應(yīng)的MIC 更高[10]?？梢?jiàn)，非白色念珠菌的這種耐藥性大部分都和HS1 和HS2 區(qū)域突變引發(fā)的fks1 多態(tài)性相關(guān)，可據(jù)此解釋其耐藥性。

3.1.3 Fks1 機(jī)制導(dǎo)致曲霉菌敏感性降低

MORRISON 等[11]針對(duì)煙曲霉進(jìn)行了研究，檢測(cè)到該類(lèi)耐藥性，并通過(guò)基因技術(shù)將白色念珠菌Fks1-S645Y 突變導(dǎo)入到煙曲霉中進(jìn)行對(duì)照分析，發(fā)現(xiàn)菌株藥物敏感性顯著下降，但該耐藥性?xún)H在試驗(yàn)條件下存在，其他情況尚不明確。

3.2 高劑量水平下的突破生長(zhǎng)

突破生長(zhǎng)屬特定的生長(zhǎng)模式，為敏感菌株在顯著超過(guò)MIC 的藥物濃度條件下的生長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn)，該類(lèi)生長(zhǎng)可能和細(xì)胞適應(yīng)性有關(guān)，并非和fks1 突變相關(guān)，和藥物敏感性改變無(wú)相關(guān)性[12]。白色念珠菌生長(zhǎng)后，相應(yīng)細(xì)胞壁中的殼多糖組分占比大幅提高[13]?？梢?jiàn)，該生長(zhǎng)現(xiàn)象可能為細(xì)胞對(duì)抗菌藥物治療相關(guān)的β-（1，3）- D-葡聚糖減少癥的代償機(jī)制。MILLER 等[14]建立了鼠科肺部曲霉病模型，發(fā)現(xiàn)模型動(dòng)物體內(nèi)的菌株也存在該類(lèi)生長(zhǎng)現(xiàn)象，而臨床未觀察到類(lèi)似現(xiàn)象，推測(cè)可能只有在實(shí)驗(yàn)室條件下存在，側(cè)面說(shuō)明同時(shí)存在其他類(lèi)型耐藥性機(jī)制。

3.3 細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)

NIIMI 等[15]的研究中設(shè)置了1個(gè)酵母敲除突變株庫(kù)，以分析這類(lèi)細(xì)菌調(diào)節(jié)敏感性的途徑和模式，結(jié)果顯示，敲除基因后藥物敏感性提高。而與此相關(guān)的基因功能涉及磷脂肌醇信號(hào)途徑（PKC）完整性、麥角固醇合成、轉(zhuǎn)錄調(diào)控，敲除和信號(hào)轉(zhuǎn)換等有關(guān)環(huán)節(jié)，相應(yīng)敏感性會(huì)有一定下降。BACHMANN 等[16]的研究結(jié)果表明，敲除52個(gè)基因或這種菌株可大幅提高對(duì)卡泊芬凈的敏感性，而敲除39個(gè)基因的效果相反。sbe2 屬高爾基體蛋白基因，與細(xì)胞壁成分的合成關(guān)系密切，其表達(dá)水平過(guò)高會(huì)引發(fā)低水平的抗性?？梢?jiàn)，復(fù)雜途徑網(wǎng)絡(luò)可改變細(xì)胞對(duì)該類(lèi)藥物的敏感性[17]，不過(guò)細(xì)菌的抗性是適度的，對(duì)其機(jī)制分析發(fā)現(xiàn)，此種抗性可視為細(xì)胞耐受性，即在一定環(huán)境壓力條件下，細(xì)胞生理上進(jìn)行調(diào)節(jié)而適應(yīng)環(huán)境，但和耐藥性并不等同。

細(xì)胞壁的合成和修復(fù)對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝有重要意義，在此過(guò)程中基因起著重要的調(diào)節(jié)作用，決定了細(xì)胞壁的合成速度，在不同細(xì)胞壓力條件下細(xì)胞壁會(huì)產(chǎn)生對(duì)應(yīng)的應(yīng)激反應(yīng)。真菌細(xì)胞壁合成過(guò)程中，由于會(huì)大量出現(xiàn)相應(yīng)的聚合體，該類(lèi)物質(zhì)和細(xì)胞修復(fù)密切相關(guān)，也會(huì)多次出現(xiàn)修飾現(xiàn)象，頻發(fā)重排現(xiàn)象。棘白菌素類(lèi)藥物在使用后可有效抑制真菌的細(xì)胞壁合成，阻礙了真菌生長(zhǎng)代謝，且據(jù)此實(shí)現(xiàn)殺菌效果。葡聚糖合成酶可催化β-（1，3）- D-葡聚糖的合成，后者為細(xì)胞壁的主要成分，屬耐藥性的靶點(diǎn)，其包括催化亞基Fks1（或Fks2）與激活因子Rho1。Rho1 可通過(guò)調(diào)節(jié)作用大幅提高葡聚糖合成酶的活性，進(jìn)一步分析還發(fā)現(xiàn)其和細(xì)胞壁的合成也緊密相關(guān)，且調(diào)節(jié)路徑可能為細(xì)胞完整性[18]。外界刺激影響下會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞壁應(yīng)激，該應(yīng)激可通過(guò)受體Wsc1 介導(dǎo)產(chǎn)生復(fù)雜的次級(jí)交互作用。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，鈣調(diào)磷酸酶基于Crz1 對(duì)Fks1 產(chǎn)生一定影響[19]。還有殼多糖合成酶基因chs1／2／3／8 的調(diào)整。轉(zhuǎn)錄因子Rlm1 可調(diào)節(jié)PKC水平，同時(shí)也影響細(xì)胞壁相關(guān)基因的表達(dá)。Wsc1 與卡泊芬凈相關(guān)的細(xì)胞壁損傷有關(guān)，可使肽Slt2 處于激活狀態(tài)，后者可促使保護(hù)應(yīng)答，對(duì)細(xì)胞壁的合成起到調(diào)節(jié)和控制作用。研究發(fā)現(xiàn)，β-（1，3）- D-葡聚糖的裝配亞基主要有β-（1，3）- D-葡聚糖合成酶，和這些亞基相關(guān)的基因fks1，與對(duì)細(xì)胞壁極化產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用的基因相連而產(chǎn)生一定結(jié)構(gòu)的途徑網(wǎng)絡(luò)[20]。該網(wǎng)絡(luò)可對(duì)來(lái)自棘白菌素類(lèi)藥物的壓力刺激進(jìn)行調(diào)節(jié)，影響藥物敏感性?；蚪M的藥物敏感性研究結(jié)果表明[21]，在卡泊芬凈刺激下，和細(xì)胞壁合成相關(guān)的基因表達(dá)有一定改變，但差異很小。這種耐受性和PKC 途徑密切相關(guān)。

3.4 內(nèi)源性耐藥機(jī)制

目前常見(jiàn)的真菌包括有鐮刀菌屬、接合菌等，研究發(fā)現(xiàn)，該類(lèi)真菌均存在一定內(nèi)源性耐藥性，定量分析表明其MIC 超過(guò)16 μg／mL[22]。目前關(guān)于該內(nèi)源性耐藥機(jī)制的研究尚無(wú)明確結(jié)果。從體外分析結(jié)果來(lái)看，這幾種類(lèi)型的葡聚糖合成酶對(duì)卡泊芬凈敏感性很高，表明該類(lèi)型耐藥和靶位不相關(guān)[8]。曾鳳群等[23]通過(guò)形態(tài)學(xué)終點(diǎn)分析法進(jìn)行的最低效應(yīng)濃度研究結(jié)果表明，曲霉菌等對(duì)卡泊芬凈有很強(qiáng)的敏感性。由此也可判斷，上述幾種類(lèi)型的霉菌中含有一些和Fks1 存在明顯差異性的耐藥機(jī)制?？梢?jiàn)，這類(lèi)型真菌的耐藥性機(jī)制相對(duì)復(fù)雜，需滿(mǎn)足一定前提條件，在達(dá)到一定活性位點(diǎn)的情況下，才會(huì)導(dǎo)致耐藥性。其他如藥物修飾的作用途徑尚未被證實(shí)，但也可能起了一定作用。

4 結(jié)語(yǔ)

棘白菌素類(lèi)藥物的耐藥機(jī)制復(fù)雜且與多種因素相關(guān)。一些關(guān)于光滑念珠菌菌株的研究表明，在不規(guī)范用藥等因素影響下，該類(lèi)藥物也開(kāi)始表現(xiàn)出較高的多藥耐藥性[23]。穩(wěn)定耐藥性的FKS 機(jī)制已被深入研究，以后的研究中應(yīng)明確遺傳因素和FKS 突變的相關(guān)性，為抑制該類(lèi)耐藥性提供支持。真菌細(xì)胞在一定的代償途徑下會(huì)出現(xiàn)很強(qiáng)的應(yīng)激反應(yīng)，可在此基礎(chǔ)上有效提高對(duì)藥物的反應(yīng)，且利用一些特征性的FKS 熱點(diǎn)突變而實(shí)現(xiàn)耐藥。簡(jiǎn)言之，耐藥性的影響因素主要有藥物長(zhǎng)期暴露、宿主微生物庫(kù)形成等，為有效應(yīng)對(duì)耐藥性問(wèn)題，需開(kāi)展相關(guān)抗藥性試驗(yàn)以利于更好地診斷，且對(duì)治療方案和用藥劑量進(jìn)行優(yōu)化，從而應(yīng)對(duì)耐藥性問(wèn)題。

細(xì)胞應(yīng)答與適應(yīng)機(jī)制也可對(duì)這種耐藥性產(chǎn)生影響，不過(guò)關(guān)于fks1 突變機(jī)制相關(guān)耐藥性尚不確定，很少產(chǎn)生由于棘白菌素耐藥相關(guān)的無(wú)效病例，因而尚未引起重視。但隨著該類(lèi)藥物的不斷使用，其引發(fā)的問(wèn)題也會(huì)持續(xù)表現(xiàn)。故有必要對(duì)該類(lèi)耐藥機(jī)制進(jìn)行深入研究，為提高其臨床療效提供支持。同時(shí)，還需規(guī)范抗真菌藥物的合理使用，不斷優(yōu)化用藥方案，盡可能降低藥物使用頻率，從而減緩真菌對(duì)棘白菌素類(lèi)藥物耐藥的發(fā)生。