活性藍(lán)4與牛血清白蛋白的相互作用研究

任鈺婷，邱智軍，張 彬，趙 淵，馬瓊瓊，原江鋒

(河南科技大學(xué) a.食品與生物工程學(xué)院; b.農(nóng)學(xué)院/牡丹學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471023)

0 引言

隨著生物技術(shù)，尤其是分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，下游分離技術(shù)逐漸成為制約整個(gè)生物產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸[1]。因此，開(kāi)發(fā)高效的分離純化方法對(duì)于生物產(chǎn)業(yè)發(fā)展至關(guān)重要。親和色譜技術(shù)由于具有高選擇性、易于放大和易于工藝開(kāi)發(fā)等優(yōu)勢(shì)而備受關(guān)注[2]。親和色譜成功的關(guān)鍵在于親和配基的選擇。在目前已開(kāi)發(fā)的親和配基中，染料分子配基，特別是三嗪基染料分子配基由于具有價(jià)格低廉、穩(wěn)定性強(qiáng)且不易降解等特點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用[3]。

作為三嗪基染料分子的代表，以汽巴藍(lán)(cibacron blue)為配基的親和色譜介質(zhì)已廣泛用于人血清白蛋白[4]、激酶[5]、限制性內(nèi)切酶[6]、脂酶[7]和木聚糖酶[8]等蛋白的純化，在生物、醫(yī)藥和食品等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。近年來(lái)，與汽巴藍(lán)具有類似分子結(jié)構(gòu)的其他三嗪基染料分子也作為親和配基，逐步應(yīng)用于多種蛋白質(zhì)的分離和純化。例如，以活性棕10(reactive brown 10)作為親和配基，通過(guò)親和色譜法可以從轉(zhuǎn)基因棉籽中一步純化獲得磷酸肌醇乙酰轉(zhuǎn)移酶[9]；以活性綠5(reactive green 5)為親和配基，使用自由基共聚法制備的親和超大孔聚(2-羥乙基甲基丙烯酸酯)整體柱一步純化獲得了木瓜蛋白酶[10]。

盡管越來(lái)越多的三嗪基染料分子作為親和配基在蛋白色譜應(yīng)用中取得成功，但目前的研究主要集中在新型色譜介質(zhì)的制備和色譜方法的建立等方面[11-12]，而對(duì)于三嗪基染料分子與目標(biāo)蛋白質(zhì)相互作用的研究較少，這極大地限制了三嗪基染料配基的進(jìn)一步應(yīng)用以及新型配基分子的設(shè)計(jì)。因此，為了明確三嗪基染料配基與蛋白質(zhì)相互作用的分子機(jī)制，本研究基于前期對(duì)一系列結(jié)構(gòu)類似的三嗪基染料分子的篩選結(jié)果，選擇具有良好吸附效果的活性藍(lán)4(reactive blue 4，RB-4)作為親和配基，通過(guò)紫外吸收光譜、熒光光譜和同步熒光光譜等光譜學(xué)手段和分子對(duì)接方法，研究了RB-4與模式蛋白牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)之間的結(jié)合作用機(jī)制，可為三嗪基染料分子作為配體的親和色譜方法的建立，以及新型配基的設(shè)計(jì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

RB-4和BSA，購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris)，購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉和乙醇等試劑均為分析純，購(gòu)自天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；試驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent Cary Eclips型熒光分光光度計(jì)，安捷倫科技(中國(guó))有限公司；L5S型紫外分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；STARTER 3100型pH計(jì)，上海奧豪斯儀器有限公司；AR1502CN型電子天平，上海奧豪斯儀器有限公司；HB120-S型數(shù)顯恒溫金屬浴加熱器，大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)有限公司。

1.3 紫外吸收光譜分析

用濃度為20 mmol/L的醋酸鈉緩沖液(pH為4.5)將BSA溶解，配制成濃度為0.025 mmol/L的溶液。將所配制的BSA溶液與不同濃度的RB-4溶液等體積混合，在25 ℃靜置反應(yīng)2 h。反應(yīng)結(jié)束后，在270～300 nm波長(zhǎng)掃描各混合物的紫外吸收光譜。

1.4 熒光光譜分析

用濃度為20 mmol/L的醋酸鈉緩沖液(pH為4.5)將BSA溶解，配制成濃度為0.025 mmol/L的溶液。將所配制的BSA溶液與不同濃度的RB-4溶液等體積混合，分別在25 ℃、35 ℃和45 ℃下靜置反應(yīng)2 h。反應(yīng)結(jié)束后，測(cè)定各混合物的熒光光譜。熒光光譜測(cè)定儀器參數(shù)：激發(fā)波長(zhǎng)λex為280 nm，激發(fā)與發(fā)射狹縫寬度均為5 nm，電壓600 V，熒光掃描發(fā)射波長(zhǎng)λem為270～450 nm，同步熒光掃描激發(fā)波長(zhǎng)為270～310 nm。三維熒光光譜主要參數(shù)：掃描模式為3-D Scan，數(shù)據(jù)模式為Fluorescance，發(fā)射波長(zhǎng)λem為200～450 nm，激發(fā)波長(zhǎng)λex為200～350 nm，激發(fā)狹縫為5.0 nm，發(fā)射狹縫為5.0 nm，光電倍增管電壓為600 V，掃描速度為120 nm·min-1。

1.5 分子對(duì)接

BSA的晶體結(jié)構(gòu)取自蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)RCSB Protein Data Bank(PDB)(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)，PDB ID：3V03。RB-4結(jié)構(gòu)由Chemical draw軟件繪制。分析之前用UltraEdit軟件去除BSA結(jié)構(gòu)中自帶的配體、水和游離氫原子。用Discovery Studio軟件優(yōu)化RB-4的結(jié)構(gòu)模型(加力場(chǎng))，分析BSA的活性區(qū)域。通過(guò)軟件識(shí)別分析得出BSA有36個(gè)活性位點(diǎn)可供配體進(jìn)行對(duì)接，選擇評(píng)分第一的位點(diǎn)作為對(duì)接位點(diǎn)，用LibDock 模塊進(jìn)行分子對(duì)接。對(duì)接完成后產(chǎn)生14個(gè)對(duì)接構(gòu)象，選擇評(píng)分最高(107.365)的對(duì)接構(gòu)象作為對(duì)接結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外吸收光譜分析

圖1 RB-4與BSA相互作用的紫外吸收光譜圖

圖1為RB-4與BSA相互作用的紫外吸收光譜圖。圖1中，g→a線表示曲線所對(duì)應(yīng)的RB-4濃度的變化方向，即從上至下曲線所對(duì)應(yīng)的RB-4濃度分別為0.125 0 mmol/L、0.100 0 mmol/L、0.075 0 mmol/L、0.050 0 mmol/L、0.025 0 mmol/L、0.012 5 mmol/L和0 mmol/L。由圖1可以看出：在不添加RB-4的情況下，BSA在波長(zhǎng)279 nm處具有特征吸收峰。隨著RB-4溶液濃度的增加，BSA的特征吸收峰位置未發(fā)生改變，但吸光度隨之增大。BSA在波長(zhǎng)279 nm處的特征吸收峰主要是由其肽鏈上色氨酸和酪氨酸的苯雜環(huán)π-π*躍遷所引起的[13]，由此可見(jiàn)，RB-4的加入會(huì)誘導(dǎo)BSA分子發(fā)生蛋白質(zhì)肽鏈伸展，使內(nèi)部疏水性的色氨酸和酪氨酸殘基的芳雜環(huán)基團(tuán)暴露，吸光度增強(qiáng)?；诖?，紫外吸收光譜分析顯示RB-4與BSA之間存在特定的相互作用，但具體的作用模式需要進(jìn)一步確定。

2.2 內(nèi)源熒光光譜和熒光淬滅機(jī)制

BSA分子中含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等一系列能夠發(fā)射內(nèi)源熒光的氨基酸殘基，因此，可以通過(guò)內(nèi)源熒光的變化來(lái)反映RB-4與BSA之間的相互作用以及RB-4所引起B(yǎng)SA的構(gòu)象變化。圖2為RB-4與BSA相互作用的內(nèi)源熒光光譜與Stern-Volmer方程擬合圖。圖2中，a→g線表示曲線所對(duì)應(yīng)的RB-4濃度的變化方向，即從上至下曲線所對(duì)應(yīng)的RB-4濃度分別為0 mmol/L、0.012 5 mmol/L、0.025 0 mmol/L、0.050 0 mmol/L、0.075 0 mmol/L、0.100 0 mmol/L和0.125 0 mmol/L，下同；F0為未加入RB-4時(shí)BSA的熒光強(qiáng)度；F為加入不同濃度RB-4時(shí)BSA的熒光強(qiáng)度。如圖2a所示，在280 nm激發(fā)波長(zhǎng)下，BSA具有明顯的熒光發(fā)射，且在342 nm具有最大發(fā)射峰。隨著RB-4濃度的增加，熒光發(fā)射強(qiáng)度逐漸降低并伴隨最大發(fā)射峰輕微藍(lán)移，表明隨著RB-4的加入，BSA發(fā)生熒光淬滅。

(a) 25 ℃時(shí)的內(nèi)源熒光光譜

引起蛋白質(zhì)發(fā)生熒光淬滅的原因包括動(dòng)態(tài)淬滅、靜態(tài)淬滅，以及基于不同淬滅機(jī)制的動(dòng)態(tài)淬滅和靜態(tài)淬滅的組合[14]。在動(dòng)態(tài)淬滅過(guò)程中，蛋白質(zhì)與淬滅劑通過(guò)碰撞引起動(dòng)態(tài)淬滅。因此，隨著溫度的升高，擴(kuò)散系數(shù)增大，電子轉(zhuǎn)移增強(qiáng)，動(dòng)態(tài)淬滅常數(shù)也相應(yīng)增大。在靜態(tài)淬滅條件下，蛋白質(zhì)與淬滅劑形成基態(tài)復(fù)合物，所形成復(fù)合物的穩(wěn)定性隨溫度的升高而降低，因此，靜態(tài)淬滅常數(shù)隨溫度的升高而降低。動(dòng)態(tài)淬滅和靜態(tài)淬滅的組合，則是由蛋白質(zhì)與淬滅劑通過(guò)碰撞以及基態(tài)復(fù)合物的形成共同引起的[15]。對(duì)于動(dòng)態(tài)淬滅和靜態(tài)淬滅，Stern-Volmer方程中的F0/F與Q之間成線性關(guān)系[13]?；诖?，使用Stern-Volmer方程[13]分析了BSA的熒光淬滅過(guò)程。

表1 RB-4與BSA相互作用的Stern-Volmer常數(shù)

使用Stern-Volmer方程對(duì)不同溫度條件下BSA的熒光強(qiáng)度進(jìn)行擬合(見(jiàn)圖2b)，擬合結(jié)果即RB-4與BSA相互作用的Stern-Volmer常數(shù)(見(jiàn)表1)。表1中，KSV為Stern-Volmer淬滅常數(shù)；Kq為由擴(kuò)散過(guò)程控制的雙分子動(dòng)態(tài)熒光淬滅速率常數(shù)與單分子衰變速率常數(shù)的比值。從表1可以看出：在RB-4與BSA的相互作用過(guò)程中，擬合后的R2均不低于0.97，表明F0/F與Q之間成線性關(guān)系且斜率為負(fù)值，RB-4對(duì)BSA的淬滅機(jī)制為靜態(tài)淬滅；另外，在RB-4對(duì)BSA的淬滅過(guò)程中，Kq>2.0×1010mol·L-1·s-1，且隨著溫度升高，Kq減小，表明RB-4與BSA所形成的復(fù)合物在高溫下不穩(wěn)定，進(jìn)一步證明該過(guò)程為靜態(tài)淬滅[16]。

2.3 RB-4對(duì)BSA的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

對(duì)于靜態(tài)淬滅過(guò)程，可根據(jù)Lineweaver-Burk雙對(duì)數(shù)方程進(jìn)行計(jì)算，獲得RB-4與BSA相互作用的結(jié)合常數(shù)KA和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n[17]。

表2 Lineweaver-Burk雙對(duì)數(shù)方程的擬合結(jié)果

表2為L(zhǎng)ineweaver-Burk雙對(duì)數(shù)方程的擬合結(jié)果。由表2可知：RB-4與BSA之間的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n接近2，表明RB-4與BSA大致具有2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)；隨溫度升高，n值變化不大，表明RB-4與BSA具有較強(qiáng)的相互作用。隨著溫度的升高，KA減小，符合靜態(tài)淬滅的特征[18]。

蛋白質(zhì)與小分子化合物之間的結(jié)合強(qiáng)度可以通過(guò)結(jié)合常數(shù)KA來(lái)表示，KA值越大，則結(jié)合強(qiáng)度越大。在藥物分子(例如羅利環(huán)素、卡比多巴)與BSA的結(jié)合過(guò)程中，其KA值通常為103～104，表明這些藥物分子與BSA之間形成了強(qiáng)結(jié)合[19-20]。然而，在本研究中，RB-4與BSA之間的結(jié)合常數(shù)KA為102～103，明顯小于這些藥物分子與BSA之間的結(jié)合強(qiáng)度。與藥物分子不同，色譜配基除了要與目標(biāo)蛋白質(zhì)形成穩(wěn)定結(jié)合外，還需要考慮在分離結(jié)束時(shí)，能夠?qū)⒛繕?biāo)蛋白質(zhì)從色譜介質(zhì)上洗脫下來(lái)，因此結(jié)合強(qiáng)度不宜過(guò)大。

由于目前對(duì)于使用光譜法研究色譜配基與蛋白質(zhì)相互作用的報(bào)道較少，因此無(wú)法根據(jù)文獻(xiàn)判斷色譜配基適合的KA范圍。然而，在后續(xù)研究中，用RB-4官能化的色譜介質(zhì)對(duì)BSA表現(xiàn)出良好的吸附和解吸性能。因此，可以推斷102～103的KA對(duì)于色譜配基是較為適宜的。

2.4 RB-4與BSA相互作用的熱力學(xué)參數(shù)

熱力學(xué)參數(shù)，如吉布斯自由能變化(△G)、焓變(△H)和熵變(△S)可以指示小分子化合物與蛋白質(zhì)的相互作用模式和作用力類型。使用van′t-Hoff方程計(jì)算了RB-4與BSA相互作用過(guò)程中的熱力學(xué)參數(shù)△G、△H和△S，計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 RB-4與BSA相互作用的熱力學(xué)參數(shù)

由表3可知：在RB-4與BSA的反應(yīng)過(guò)程中△G<0，表明RB-4與BSA之間的結(jié)合是自發(fā)進(jìn)行的。小分子化合物與蛋白質(zhì)的作用力類型主要包括疏水作用、范德華力、靜電作用及氫鍵。根據(jù)△S和△H值的大小，可以判斷相互作用過(guò)程中所存在的主要作用力，即當(dāng)△H<0、△S<0時(shí)，表明該過(guò)程的主要作用力可能是氫鍵和范德華力；當(dāng)△H>0、△S>0時(shí)，表明該過(guò)程的主要作用力是典型的疏水作用；當(dāng)△H<0、△S>0時(shí)，表明該過(guò)程的主要作用力是靜電作用。在本研究中，△H和△S均大于0，因此可以認(rèn)為RB-4與BSA之間的主要作用力為疏水作用。

2.5 同步熒光光譜

同步熒光光譜可以用于指示熒光團(tuán)附近的分子微環(huán)境。當(dāng)將激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)之間的波長(zhǎng)差△λ固定為15 nm和60 nm時(shí)，所獲得的同步熒光光譜分別代表了蛋白質(zhì)中酪氨酸殘基和色氨酸殘基的光譜特征[21]。因此，可以基于熒光發(fā)射波長(zhǎng)的改變來(lái)判斷蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化情況。

圖3為RB-4與BSA相互作用的同步熒光光譜。如圖3所示，當(dāng)△λ=15 nm(見(jiàn)圖3a)和△λ=60 nm(見(jiàn)圖3b)時(shí)，同步熒光光譜顯示RB-4的加入使BSA的特征吸收峰降低，且使最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)分別藍(lán)移約7 nm和5 nm。表明RB-4與BSA的結(jié)合導(dǎo)致酪氨酸殘基和色氨酸殘基周圍的疏水性增強(qiáng)，且對(duì)酪氨酸殘基的影響更大，結(jié)合過(guò)程導(dǎo)致BSA的構(gòu)象發(fā)生變化。

(a) △λ=15 nm

(b) △λ=60 nm

2.6 三維熒光光譜

三維熒光光譜能準(zhǔn)確、可靠地檢驗(yàn)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和微環(huán)境變化。圖4為RB-4與BSA相互作用的三維熒光光譜。由圖4可知：在兩個(gè)體系中存在特征為△λem=△λex的瑞利散射，即圖4中所示的“山脊”峰(峰A)[22]。另外，對(duì)于BSA(見(jiàn)圖4a)，在△λem=345 nm處存在峰B，這是由BSA中氨基酸的π-π*躍遷所造成的。而對(duì)于RB-4與BSA結(jié)合的反應(yīng)體系(見(jiàn)圖4b)，峰B的熒光強(qiáng)度顯著降低，且λem發(fā)生輕微藍(lán)移(λem=343 nm)，表明在酪氨酸殘基和色氨酸殘基周圍微環(huán)境中的疏水性增強(qiáng)，這與同步熒光光譜的結(jié)果一致。

(a) BSA

(b) RB-4與BSA結(jié)合

2.7 分子對(duì)接

為了進(jìn)一步闡明RB-4與BSA之間的結(jié)合特性，進(jìn)行分子對(duì)接試驗(yàn)以確定配基和蛋白質(zhì)分子之間的最佳結(jié)合位點(diǎn)。

BSA分子的三維結(jié)構(gòu)呈心形，具有3個(gè)相似的結(jié)構(gòu)域：結(jié)構(gòu)域Ⅰ(1～183氨基酸殘基)、結(jié)構(gòu)域Ⅱ(184～376氨基酸殘基)和結(jié)構(gòu)域Ⅲ(377～583氨基酸殘基)，其中大部分的小分子與BSA的作用位置位于由亞結(jié)構(gòu)域Ⅱ和亞結(jié)構(gòu)域Ⅲ所形成的疏水性腔內(nèi)[23]。

圖5為RB-4與BSA的分子對(duì)接模型。圖5a顯示了RB-4與BSA分子對(duì)接的整體結(jié)果，在此構(gòu)象下，結(jié)合自由能最低。RB-4與BSA對(duì)接時(shí)，周邊存在11個(gè)氨基酸殘基，包括離子型氨基酸殘基：Glu-564和His-509；疏水型殘基：Phe-567、Ala-568、Ala-510、Val-575、Pro-572、Phe-508和Phe-506；親水型殘基：Gly-571和Thr-507。其中，Phe-508、Ala-510、Glu-564與RB-4形成5個(gè)氫鍵(見(jiàn)圖5b)。分子對(duì)接結(jié)果表明：BSA與RB-4之間的主要作用力為疏水作用，同時(shí)還存在一定的靜電作用與氫鍵作用，該結(jié)果與光譜試驗(yàn)結(jié)果一致。

(a) 整體圖

3 結(jié)論

(1)RB-4與BSA發(fā)生相互作用，使BSA內(nèi)部疏水性的色氨酸和酪氨酸殘基的芳雜環(huán)基團(tuán)暴露。

(2)RB-4與BSA通過(guò)靜態(tài)淬滅機(jī)制形成穩(wěn)定的復(fù)合物，從而使BSA熒光淬滅。RB-4與BSA的結(jié)合過(guò)程是自發(fā)放熱過(guò)程，低溫有利于兩者的結(jié)合，且疏水相互作用力是維持RB-4與BSA結(jié)合的主要作用力。

(3)RB-4與BSA的結(jié)合導(dǎo)致BSA的三級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞，空間結(jié)構(gòu)變得松散，從而使酪氨酸殘基和色氨酸殘基周圍微環(huán)境的疏水性增強(qiáng)。

(4)BSA與RB-4之間的主要氨基酸作用位點(diǎn)為Phe-567、Ala-568、Ala-510、Val-575、Pro-572、Phe-508和Phe-506，同時(shí)還存在一定的靜電作用與氫鍵作用。