石榴鞣花酸提取物對人肺癌細(xì)胞A549凋亡的誘導(dǎo)

趙勝娟，費 鵬，劉麗莉，程玉江

(1.河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023；2.洛寧縣市場監(jiān)督管理局，河南 洛陽 471700)

0 引言

肺癌是臨床最常見的惡性腫瘤之一，其治療手段主要有手術(shù)、放療、化療、靶向治療和免疫治療等，但這些治療方式存在較大的毒副作用以及價格昂貴等問題[1-3]。因此，尋找一種抗癌效果顯著，副作用小且成本低的治療途徑是亟待解決的科學(xué)問題。

腫瘤細(xì)胞的生長繁殖與細(xì)胞的凋亡水平緊密相關(guān)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是防治癌癥的一個重要策略[4]，而天然產(chǎn)物能夠顯著地降低腫瘤細(xì)胞的生命活性[5]，因此，越來越多的研究致力于探討不同天然產(chǎn)物對腫瘤細(xì)胞的抑制作用。文獻(xiàn)[6]對蔥類蔬菜治療癌癥的前景進(jìn)行了綜述。文獻(xiàn)[7]研究了青蒿提取物的抗腫瘤活性，并明確了其有效成分。文獻(xiàn)[8]研究了4種伏牛山原生藥用植物的抗癌活性，發(fā)現(xiàn)其醇提物在體外對食管癌細(xì)胞或肝癌細(xì)胞具有濃度依賴的生長抑制作用，以70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇提取物活性最強。石榴具有驅(qū)蟲、抗菌、抗病毒、預(yù)防和治療心腦血管、抗癌等多種藥理作用[9-11]，而這些功效都?xì)w結(jié)于石榴中含有豐富多樣的酚類物質(zhì)。鞣花酸(ellagic acid，EA)是石榴中主要的酚類物質(zhì)之一，文獻(xiàn)[12-13]研究了石榴皮多酚提取物和其主要活性物質(zhì)安石榴苷、鞣花酸對肝癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)它們能夠通過線粒體通路干預(yù)細(xì)胞的凋亡，而石榴鞣花酸提取物(ellagic acid extracts from pomegranate，EAEFP)對肺癌細(xì)胞的抑制作用及其可能的作用途徑尚未得到清晰的揭示。

本文以A549肺癌細(xì)胞為研究對象，分析EAEFP對A549肺癌細(xì)胞存活率、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的作用，以期揭示EAEFP誘導(dǎo)A549肺癌細(xì)胞凋亡的可能作用途徑，為石榴的深度加工利用和新型天然抗腫瘤功能性食品的開發(fā)提供一定的理論參考，對充分挖掘石榴的食用及保健價值具有積極意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549：河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院細(xì)胞室保存；石榴鞣花酸提取物(EAEFP)：西安維特生物科技有限責(zé)任公司提供，由石榴皮(產(chǎn)地：陜西臨潼)用100%(體積分?jǐn)?shù))甲醇提取所得。

四甲基偶氮唑鹽(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT)，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)：美國Sigma公司；細(xì)胞培養(yǎng)基：RPMI-1640，美國Gibco公司；胎牛血清：Gibco 10099-141，美國Gibco|Life Technologies公司；細(xì)胞周期檢測試劑盒：Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡試劑盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 試驗儀器

Agilent 1200 Infinity 系列高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)系統(tǒng)：北京安捷倫科技公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱：CCL-170B-8型，新加坡ESCO有限公司；普通倒置顯微鏡：OLYMPUS CKX41型，日本OLYMPUS公司；全波長酶標(biāo)儀：Multiskan GO型，美國熱電公司；生物柜：ESCO AC2-4S1型，新加坡 ESCO有限公司；流式細(xì)胞儀：FACSCalibur型，美國BD公司；熒光倒置顯微鏡：Leica DM3000型，上海徠卡儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 石榴鞣花酸提取物HPLC分析

準(zhǔn)確稱取0.10 g的EAEFP，溶于甲醇中，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的樣品溶液，用0.22 μm的過濾膜過濾后注入高效液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行成分分析。液相檢測條件：色譜柱 Aglient Zorbax SB-C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)，紫外檢測波長280 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μL，流動相A為1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))冰醋酸，流動相B為甲醇，流速1 mL/min。檢測程序：0～70 min(流動相 A:95%～56%(體積分?jǐn)?shù))，流動相 B:5%～44%(體積分?jǐn)?shù)))，70～80 min(流動相A：56%，流動相B:44%)[14]。

1.3.2 石榴鞣花酸提取物溶液配制及細(xì)胞培養(yǎng)

稱取一定量的EAEFP，用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解，配制成質(zhì)量濃度為15 mg/mL的貯存液，避光保存于4 ℃冰箱中備用。試驗時，用無血清培養(yǎng)基把貯存液按2∶3(體積比)稀釋成一系列工作濃度，保證DMSO在終體系中體積分?jǐn)?shù)不大于1‰。A549肺癌細(xì)胞用含10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的RPMI-1640培養(yǎng)液，置于37 ℃，5%(體積分?jǐn)?shù))CO2相對飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.3 細(xì)胞增殖抑制試驗

利用MTT比色法檢測EAEFP對A549肺癌細(xì)胞存活率的影響。取對數(shù)生長期的A549肺癌細(xì)胞，計數(shù)后調(diào)整至適宜種板密度，每孔種板90 μL。過夜培養(yǎng)后，分別加入10 μL不同質(zhì)量濃度的EAEFP。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μL MTT，孵育4 h后加入50 μL三聯(lián)液，過夜孵育后用全波長酶標(biāo)儀檢測570 nm波長處的吸光度，以對照組為100%計算各處理組的細(xì)胞活力。各質(zhì)量濃度的EAEFP設(shè)6個平行復(fù)孔，為了消除原始細(xì)胞對吸光度的影響，不同處理樣品最后的吸光值均減去原始細(xì)胞的吸光值。

1.3.4 DAPI染色法分析細(xì)胞形態(tài)

取對數(shù)生長期的A549肺癌細(xì)胞接種于六孔板，種板密度為1×105mL-1，每孔2 mL，將經(jīng)過多聚賴氨酸包被的無菌玻片放入六孔板中。過夜培養(yǎng)后，加EAEFP繼續(xù)孵育48 h，將上清液棄去，加入4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚賴氨酸固定。將固定液去除后，加入DAPI染色液，染色15 min后，用熒光顯微鏡拍照[15]。

1.3.5 細(xì)胞周期的檢測

利用流式分析儀分析EAEFP對A549肺癌細(xì)胞周期的影響。取對數(shù)生長期的A549肺癌細(xì)胞接種于六孔板，種板密度為1×105mL-1，每孔2 mL。過夜培養(yǎng)后，加EAEFP繼續(xù)孵育48 h，離心收集細(xì)胞，棄上清液，用預(yù)冷磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline，PBS)洗細(xì)胞2次。加入預(yù)冷70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇，于4 ℃固定過夜，或-20 ℃長期固定。離心收集細(xì)胞，以1 mL的PBS洗細(xì)胞1次，加入500 μL PBS(含50 μg/mL碘化丙啶(propidium iodide，PI)，100 μg/mL RNase A)，4 ℃避光孵育30 min。用流式細(xì)胞儀檢測，一般計數(shù)1×104個細(xì)胞，結(jié)果用細(xì)胞周期擬合軟件ModFit進(jìn)行分析。

1.3.6 細(xì)胞凋亡率的檢測

根據(jù)文獻(xiàn)[16]的方法，利用Annexin V-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞儀，檢測EAEFP對A549肺癌細(xì)胞的凋亡。按照試劑盒操作說明進(jìn)行如下操作：將對數(shù)生長期A549肺癌細(xì)胞接種于六孔板中，種板密度為1×105mL-1，每孔2 mL。過夜培養(yǎng)后加EAEFP。相同條件下，繼續(xù)孵育48 h，消化收集細(xì)胞，用PBS洗2次，加入100 μL 結(jié)合緩沖液、5 μL異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的Annexin-V和1 μL PI，室溫避光30 min。加入400 μL緩沖液，立即用FAC Scan進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)定量檢測，以不加Annexin V-FITC及PI作為陰性對照。

1.4 數(shù)據(jù)分析

以上試驗每組樣品測3個平行樣，所得數(shù)據(jù)用Microsoft Excel數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理、制圖，并用DPS軟件進(jìn)行差異性分析，顯著水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 石榴鞣花酸提取物成分鑒定及定量

在前期的研究中，確定了鞣花酸標(biāo)品HPLC圖譜中最高峰在保留時間65 min左右出現(xiàn)。進(jìn)而，利用HPLC法分析EAEFP的組成成分，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知：EAEFP在65 min時出現(xiàn)最大峰，說明EAEFP中鞣花酸占絕大部分，根據(jù)峰面積計算得出此提取物中鞣花酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)90.41%，其他物質(zhì)未確定。

2.2 石榴鞣花酸提取物對A549肺癌細(xì)胞增殖的抑制作用

利用MTT比色法分析EAEFP對A549肺癌細(xì)胞存活率的影響，結(jié)果如圖2所示。圖2中，圖柱上方不同字母表示差異顯著(P<0.05)。由圖2可知：隨著EAEFP質(zhì)量濃度的增大，A549肺癌細(xì)胞的存活率逐漸降低，呈現(xiàn)較好的劑量效應(yīng)。當(dāng)EAEFP質(zhì)量濃度為0.88 μg/mL時，細(xì)胞存活率為83.54%，與對照組相比差異顯著(P<0.05)。當(dāng)EAEFP質(zhì)量濃度為15.00 μg/mL 時，細(xì)胞存活率僅為35.77%。可見EAEFP對A549肺癌細(xì)胞的增殖具有良好的抑制作用。

圖1 EAEFP成分HPLC圖

圖2 EAEFP對A549肺癌細(xì)胞存活率的影響

2.3 石榴鞣花酸提取物對A549肺癌細(xì)胞形態(tài)的影響

A549肺癌細(xì)胞經(jīng)EAEFP處理后，利用DAPI染色法對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析，結(jié)果如圖3所示。圖3a為空白對照組，由圖3a可見：細(xì)胞大小均一，輪廓清楚，未見明顯的懸浮細(xì)胞。圖3b為3 μg/mL EAEFP處理后的細(xì)胞，由圖3b可見：A549肺癌細(xì)胞的生長受到顯著的抑制，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞核出現(xiàn)了一定程度的皺縮，甚至出現(xiàn)了一些細(xì)胞碎片。且對細(xì)胞的這種破壞隨著EAEFP質(zhì)量濃度的提高而加劇(見圖3c)。因此，初步推斷EAEFP具有促使A549肺癌細(xì)胞形態(tài)異常化的作用，從而促進(jìn)了A549肺癌細(xì)胞的凋亡，這一發(fā)現(xiàn)與白花蛇舌草乙醇提取物對A549肺癌細(xì)胞的作用途徑相似[17]。

(a) 對照組 (b) 3 μg/mL EAEFP (c) 6 μg/mL EAEFP

圖3 EAEFP對A549肺癌細(xì)胞形態(tài)的影響(200倍)

2.4 石榴鞣花酸提取物對A549肺癌細(xì)胞周期的影響

細(xì)胞的分裂一般分為3個階段，分別為G1期(DNA合成前期)、S期(DNA合成期)、G2期(DNA合成后期)。為了探究EAEFP對A549細(xì)胞增殖的抑制作用是否與其阻滯了細(xì)胞周期有關(guān)，本文利用流式細(xì)胞儀分析EAEFP作用于A549肺癌細(xì)胞48 h后，對A549肺癌細(xì)胞周期的影響，如圖4所示。

(a) 對照組

(b) 3 μg/mL EAEFP

(c) 6 μg/mL EAEFP

(d) 各時相細(xì)胞個數(shù)百分比統(tǒng)計圖

從圖4a～圖4c可以看出：當(dāng)3 μg/mL和6 μg/mL的EAEFP作用于A549肺癌細(xì)胞 48 h后，S期細(xì)胞個數(shù)明顯少于對照組，且隨著EAEFP質(zhì)量濃度的增大，S期細(xì)胞個數(shù)越來越少。數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果顯示(見圖4d)：EAEFP作用于A549肺癌細(xì)胞后，G1期細(xì)胞個數(shù)百分比由66.93%增加至81.66%，S期細(xì)胞個數(shù)百分比由29.20%降低至15.21%，G2期細(xì)胞個數(shù)百分比無明顯變化。這表明EAEFP將A549肺癌細(xì)胞阻滯在G1期，抑制A549肺癌細(xì)胞進(jìn)入DNA合成期，影響DNA正常復(fù)制，從而抑制了A549肺癌細(xì)胞的增殖。

2.5 石榴鞣花酸提取物對A549肺癌細(xì)胞凋亡的影響

采用Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀分析EAEFP對A549肺癌細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果如圖5所示。圖5a～5c中：橫坐標(biāo)為熒光探針Annexin V-FITC的信號強度；縱坐標(biāo)為熒光探針PI的信號強度。圖5a～圖5c為A549肺癌細(xì)胞Annexin V/PI染色點陣圖。圖5d為A549肺癌細(xì)胞凋亡率統(tǒng)計圖，圖柱上方不同字母表示差異顯著(P<0.05)。從圖5a～圖5c可以看出:當(dāng)3 μg/mL和6 μg/mL的EAEFP作用于A549肺癌細(xì)胞 48 h后，細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯高于對照組，且有劑量依賴關(guān)系。圖5d顯示兩個質(zhì)量濃度處理組的A549肺癌細(xì)胞凋亡率分別為10.41%和17.35%，均顯著高于對照組A549肺癌細(xì)胞凋亡率(P<0.05)。表明EAEFP能誘導(dǎo)A549肺癌細(xì)胞凋亡并呈劑量依賴性。

(a) 對照組

(b) 3 μg/mL EAEFP

(c) 6 μg/mL EAEFP

(d) 細(xì)胞凋亡率統(tǒng)計圖

3 結(jié)束語

石榴鞣花酸提取物能顯著抑制A549肺癌細(xì)胞的增殖，且在質(zhì)量濃度為0～15 μg/mL時呈現(xiàn)良好的劑量效應(yīng)。石榴鞣花酸提取物可以使A549肺癌細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞核發(fā)生皺縮，且隨質(zhì)量濃度增大，細(xì)胞核皺縮更加嚴(yán)重。石榴鞣花酸提取物可以干擾A549肺癌細(xì)胞生長周期，將細(xì)胞阻滯在G1期，抑制細(xì)胞DNA正常復(fù)制。石榴鞣花酸提取物可以引起A549肺癌細(xì)胞凋亡，且呈劑量依賴性。

石榴鞣花酸提取物對A549肺癌細(xì)胞具有良好的凋亡作用，是潛在的抗癌天然物質(zhì)。文獻(xiàn)[18]指出樹莓鞣花酸對肝癌細(xì)胞和肺癌細(xì)胞等具有顯著的抑制作用，發(fā)現(xiàn)鞣花酸在癌細(xì)胞分裂過程中，鞣花酸組織細(xì)胞有絲分裂G0/G1期的轉(zhuǎn)換，抑制了細(xì)胞DNA的合成，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，本研究的結(jié)果與此基本吻合。文獻(xiàn)[19]研究發(fā)現(xiàn):鞣花酸能夠與姜黃素協(xié)同作用，共同誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生，使p53蛋白大量累積，誘導(dǎo)了癌細(xì)胞的大量凋亡。文獻(xiàn)[20]利用膜透析技術(shù)制備鞣花酸的雙載核殼納米粒，優(yōu)化后的顆粒觀察到更高的細(xì)胞毒性，可作為乳腺癌治療聯(lián)合用藥。這些文獻(xiàn)均提示鞣花酸對肺癌細(xì)胞等癌細(xì)胞具有顯著抑制作用。但關(guān)于石榴鞣花酸提取物誘導(dǎo)A549肺癌細(xì)胞凋亡的研究報道較少，其作用機(jī)制和凋亡通路更是缺乏研究。本文明確了石榴鞣花酸提取物對A549肺癌細(xì)胞的凋亡作用以及作用機(jī)制，可以拓展石榴鞣花酸的應(yīng)用領(lǐng)域，進(jìn)一步指導(dǎo)該天然產(chǎn)物在抗癌功能上的應(yīng)用。