抗腫瘤候選藥物Gedatolisib在體外血漿和人工胃/腸液中的穩(wěn)定性研究及其降解產(chǎn)物分析
2020-07-01 14:28:09武婷婷張宇杜瑤陳瑞王麗麗彭鴻曼湯磊王穎張吉泉
中國(guó)藥房 2020年12期
武婷婷 張宇 杜瑤 陳瑞 王麗麗 彭鴻曼 湯磊 王穎 張吉泉
中圖分類號(hào) R969.1;R979.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2020）12-1452-07
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.12.09
摘 要 目的：考察抗腫瘤候選藥物Gedatolisib在體外血漿和人工胃/腸液中的穩(wěn)定性，并分析其在體外血漿中可能的降解產(chǎn)物。方法：采用高效液相色譜法，以吲哚美辛為內(nèi)標(biāo)，分別檢測(cè)Gedatolisib在SD大鼠（雄性）血漿中孵育0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 h和在空白人工胃液（pH 1.3，不含酶）、空白人工腸液（pH 6.8，不含酶）、人工胃液（pH 1.3，含胃蛋白酶）、人工腸液（pH 6.8，含胰蛋白酶）中孵育0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0 h的含量變化，計(jì)算其剩余百分比;利用超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF/MS）技術(shù)分析空白血漿和血漿孵育樣品的總離子流圖，比較差異峰并通過(guò)MS圖推測(cè)降解產(chǎn)物。結(jié)果：Gedatolisib在大鼠血漿中孵育2.0 h時(shí)的剩余百分比約為63%，繼續(xù)孵育無(wú)明顯變化;在空白人工腸液中孵育不同時(shí)間的剩余百分比均在（99.18±2.15）%～（103.20±3.41）%范圍內(nèi);在人工腸液中孵育2.0 h的剩余百分比降至（88.76±1.53）%，在空白人工胃液中孵育2.0 h的剩余百分比降至（85.63±1.55）%，繼續(xù)孵育均無(wú)明顯變化;在人工胃液中孵育的剩余百分比從0 h的（94.94±3.52）%降至6.0 h的（16.19±1.17）%。UPLC-Q-TOF/MS的總離子流圖顯示，血漿孵育樣品與空白血漿的差異峰出現(xiàn)在正離子模式掃描下的6.42 min處，該峰掃描通道可見(jiàn)m/z 616.335 1、632.327 7、630.317 0、602.278 6[M+H]+的分子離子峰，推測(cè)Gedatolisib在大鼠血漿中可能生成1-（4-（3-（4，6-雙嗎啉-1，3，5-三嗪-2-基）苯基）脲基）苯甲?；?N，N-二甲基哌啶-4-氧化胺、1-（4-（4-（二甲基氨基）哌啶-1-羰基）苯基）-3-（4-（4-嗎啉-6-（3-氧代嗎啉）-1，3，5-三嗪-2-基）苯基）脲和1-（4-（3-（4-（4，6-雙嗎啉-1，3，5-三嗪-2-基）苯基）脲基）苯甲酰基）-N-甲基哌啶等3個(gè)降解產(chǎn)物。結(jié)論：Gedatolisib在大鼠血漿中不穩(wěn)定，可能發(fā)生末端氮原子氧化、嗎啉環(huán)氧化和末端氮脫甲基化等反應(yīng);在人工腸液和空白人工胃/腸液中穩(wěn)定性良好，在胃蛋白酶存在下發(fā)生明顯降解。
關(guān)鍵詞 抗腫瘤候選藥物;Gedatolisib;體外血漿;人工胃液;人工腸液;穩(wěn)定性;降解產(chǎn)物
Study on the Stability of Antitumor Candidate Gedatolisib in Plasma in vitro and Simulated Gastric/intestinal Fluid and Its Catabolites Analysis
WU Tingting1，ZHANG Yu1，DU Yao1，CHEN Rui2，WANG Lili3，PENG Hongman4，TANG Lei2，WANG Ying1，ZHANG Jiquan1，2（1. College of Pharmacy， Guizhou Medical University， Guiyang 550025， China; 2. Guizhou Provincial Engineering Technology Research Center for Chemical Drug R&D，Guizhou Medical University，Guiyang 550025，China; 3. School of Medicine and Health Management， Guizhou Medical University， Guiyang 550025， China;4. Dept. of Clinical Teaching， Guiyang Maternal and Child Health Hospital， Guiyang 550003， China）
ABSTRACT ? OBJECTIVE： To investigate the stabilities of antitumor candidate Gedatolisib in plasma in vitro and simulated gastric/intestinal fluids，and to analyze the possible catabolites in plasma. METHODS： HPLC method was adopted. Using indometacin as internal standard，the contents of Gedatolisib incubated in plasma of SD rats （male） for 0， 0.5， 1.0， 1.5， 2.0， 3.0 h and blank simulated gastric fluid （pH 1.3， no enzyme）， blank simulated intestinal fluid（pH 6.8，no enzyme）， simulated gastric fluid （pH 1.3， containing pepsin） and simulated intestinal fluid （pH 6.8， containing trypsin） for 0， 0.5， 1.0， 2.0， 3.0， 4.0， 6.0 h were determined. The remaining percentage of Gedatolisib was calculated. UPLC-Q-TOF/MS was used to analyze the TIC of blank plasma and incubated samples. The differential peaks were compared， and catabolites were inferred by MS chromatograms. RESULTS： The remaining percentage in plasma of rats for 2.0 h was about 63%， and there was no significant change after continued incubation. The remaining percentage of Gedatolisib incubated in blank simulated intestinal fluid for different time ranged（99.18±2.15）%-（103.20±3.41）%. The remaining percentage in simulated intestinal fluids for 2.0 h ranged （88.76±1.53）%. The remaining percentage in blank simulated gastric fluids for 2.0 h was ranged （85.63±1.55）%， and there was no significant change after continued incubation. The remaining percentage in simulated gastric fluid was from （94.94±3.52）% （0 h）to （16.19±1.17）%（6.0 h）. TIC of UPLC-Q-TOF/MS showed that the differential peaks of incubated samples and blank plasma was 6.42 min under positive mode scanning， molecular ion peak of m/z 616.335 1， simulated 632.327 7， 630.317 0， 602.278 6 [M+H]+ could be found in scanning channel. It was speculated that Gedatolisib could generate 1-（4-（3-（4，6-dimorpholino-1，3，5-triazin-2-yl）phenyl）urea）benzoyl）-N， N-dimethylpiperidin-4-amine oxide， 1-（4-（4-（dimethylamino）piperidine-1-carbonyl）phenyl）-3-（4-（4-morpholino-6-（3-oxomorpholino）-1，3，5-triazin-2-yl）phenyl）urea and 1-（4-（3-（4-（4，6-dimorpholino-1，3，5-triazin-2-yl）phenyl）urea）benzoyl）-N-methylpiperidine. CONCLUSIONS： Gedatolisib is not stable in rat plasma， and it may undergo terminal N oxidation， morpholine ring oxidation and terminal N demethylation. Gedatolisib is stable in artificial intestinal fluid and blank artificial gastric/intestinal fluid， and degrades obviously in the presence of pepsin.
KEYWORDS ? Antitumor candidate; Gedatolisib; Plasma; Simulated gastric fluid; Simulated intestinal fluid; Stability; Catabolite
小分子靶向抗腫瘤候選藥物Gedatolisib由美國(guó)Pfizer公司開(kāi)發(fā)，目前處于Ⅱ期臨床研究階段。該化合物能夠通過(guò)抑制磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（PI3K-Akt-mTOR）通路中的PI3Kα、PI3Kγ及mTOR，有效抑制人乳腺癌細(xì)胞MDA-361和人前列腺癌細(xì)胞PC3-MM2的增殖[1]。有臨床研究表明，靜脈注射Gedatolisib對(duì)乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌等多種腫瘤細(xì)胞均有顯著的抑制作用[2]。
口服藥物進(jìn)入生物體內(nèi)發(fā)揮藥效，必須經(jīng)歷吸收、分布、代謝、排泄的復(fù)雜過(guò)程。例如，化合物在血漿和消化道中易受血漿酶、胃腸pH、胃腸液酶的影響，使其降解失活甚至生成毒性產(chǎn)物，直接影響化合物的有效性和安全性[3-4]，故對(duì)Gedatolisib的血漿和胃腸液穩(wěn)定性進(jìn)行研究并探討其影響因素顯得尤為重要。自Gedatolisib開(kāi)展臨床研究以來(lái)，均采用靜脈注射的方式給藥。Gedatolisib具有較高的脂溶性（clogP=1.2）和大于500的分子量（615.739 0）[1]，以上兩點(diǎn)均可能導(dǎo)致其水溶性差。該化合物雖不適合口服，但至今尚無(wú)相關(guān)文獻(xiàn)解釋其臨床研究中僅以靜脈注射給藥的原因，也未見(jiàn)對(duì)其穩(wěn)定性及代謝物分析的研究報(bào)道。本課題組前期成功合成了Gedatolisib[5]，在此基礎(chǔ)上，本研究采用高效液相色譜法（HPLC），以吲哚美辛為內(nèi)標(biāo)，考察Gedatolisib在SD大鼠體外血漿和人工胃/腸液中的穩(wěn)定性;同時(shí)，本研究利用超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)（UPLC-Q-TOF/MS），對(duì)空白血漿和血漿孵育樣品的圖譜進(jìn)行比較，利用UNIFI 1.8.2數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)Gedatolisib可能的降解產(chǎn)物進(jìn)行解析，挖掘其潛在代謝位點(diǎn)，從而初步闡明Gedatolisib可能的體內(nèi)代謝行為，旨在填補(bǔ)Gedatolisib穩(wěn)定性研究方面的空白，為其后續(xù)結(jié)構(gòu)改造與優(yōu)化提供理論參考。Gedatolisib和吲哚美辛的結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。
1 材料
1.1 儀器
Xevo G2-XS 型UPLC-Q-TOF/MS 儀（包括MassLynx V4.1型質(zhì)譜工作站、UNIFI 1.8.2數(shù)據(jù)庫(kù)）和e2695型HPLC儀（美國(guó)Waters公司）;XH-B型旋渦混合器（江蘇康健醫(yī)療用品有限公司）;JN300-2型氮?dú)獯祾邇x（蘇州吉米諾儀器有限公司）;KH-600E型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）;FA805N型十萬(wàn)分之一電子天平（上海菁海儀器有限公司）。
1.2 藥品與試劑
Gedatolisib原料藥（貴州醫(yī)科大學(xué)藥物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制，批號(hào)：20190410，純度：>99.0%）;吲哚美辛對(duì)照品（內(nèi)標(biāo)，大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：J0526A5，純度：>98%）;肝素鈉（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：325D025）;甲醇、乙腈為色譜純;磷酸等其余試劑均為分析純，水為超純水。
1.3 動(dòng)物
清潔級(jí)SD大鼠，雄性，8～12周，體質(zhì)量220～230 g，購(gòu)自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0014。
2 方法與結(jié)果
2.1 Gedatolisib含量測(cè)定的色譜條件
色譜柱：Waters Symmetry C18（150 mm×4.5 mm，5 μm）;保護(hù)柱：Waters Symmetry C18 VanGuard Cartidge（5 mm×3.9 mm，5 μm）;流動(dòng)相：甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～7 min，45%A→95%A;7～10.5 min，95%A;10.5～12 min，95%A→45%A;12～12.5 min，45%A）;流速：1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm;柱溫：35 ℃;進(jìn)樣量：20 μL。
2.2 降解產(chǎn)物定性分析的UPLC-Q-TOF/MS條件
色譜柱：Waters BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）;流動(dòng)相：0.01%甲酸水溶液（A）-0.01%甲酸乙腈溶液（B），梯度洗脫（0～2 min，95%A;2～8 min，95%A→45%A;8～12 min，45%A→5%A;12～13 min，5%A;13～15 min，5%→95%A）;流速：0.40 mL/min;柱溫：40 ℃;進(jìn)樣量：2 μL;分析時(shí)間：15 min。離子源：電噴霧離子源（ESI）;采集模式：正離子;毛細(xì)管電壓：1.5 kV;離子源溫度：120 ℃;溶劑氣溫度：400 ℃;脫溶劑氣流量：800 L/h;錐孔氣流量：50 L/h;掃描方式：MSE Continuum模式;掃描范圍：m/z 50～1 200。
2.3 溶液的制備
2.3.1 Gedatolisib對(duì)照品貯備液及對(duì)照品溶液
精密稱取Gedatolisib原料藥適量，以甲醇溶解并定容至5 mL量瓶中，制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的對(duì)照品貯備液，于4 ℃貯存。使用前用甲醇稀釋得到相應(yīng)質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液。
2.3.2 內(nèi)標(biāo)貯備液及內(nèi)標(biāo)溶液
精密稱取內(nèi)標(biāo)對(duì)照品適量，以甲醇溶解并定容至5 mL量瓶中，制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的內(nèi)標(biāo)貯備液，于4 ℃貯存。使用前用甲醇稀釋得到相應(yīng)質(zhì)量濃度的內(nèi)標(biāo)溶液。
2.3.3 空白人工胃液的制備
按文獻(xiàn)方法[6]，取稀鹽酸16.4 mL，加水800 mL，用0.1 mol/L 鹽酸溶液調(diào)pH至1.3，再加水稀釋并定容至1 000 mL，即得空白人工胃液。
2.3.4 人工胃液的制備
按文獻(xiàn)方法[6]，取稀鹽酸16.4 mL，加水800 mL、胃蛋白酶10 g，搖勻使其溶解，用0.1 mol/L 鹽酸溶液調(diào)pH至1.3，再加水稀釋并定容至1 000 mL，即得人工胃液。
2.3.5 空白人工腸液的制備
按文獻(xiàn)方法[6]，取磷酸二氫鉀6.8 g，加水500 mL，搖勻使其溶解，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH至6.8，再加水稀釋并定容至1 000 mL，即得空白人工腸液。
2.3.6 人工腸液的制備
按文獻(xiàn)方法[6]，取磷酸二氫鉀6.8 g，加水500 mL，搖勻使其溶解，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH至6.8;另稱取胰蛋白酶10 g，加適量水溶解;將上述兩種溶液混合后，再加水稀釋并定容至1 000 mL，即得人工腸液。
2.4 樣品采集、配制與處理
2.4.1 空白血漿采集
取清潔級(jí)大鼠6只，于股動(dòng)脈采血，分別置于含肝素鈉的離心管中，于4 ℃下以3 000×g離心10 min，取上層血漿于-80 ℃貯存，備用。
2.4.2 血漿樣品配制
按文獻(xiàn)方法[6]，取大鼠空白血漿198 μL，分別加入低、中、高質(zhì)量濃度（2、10、30 μg/mL）的Gedatolisib對(duì)照品溶液（含醇量為1%）2 μL，振蕩混勻，在37 ℃水浴中孵育0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 h。
2.4.3 人工胃/腸液樣品配制
精密量取質(zhì)量濃度為1 mg/mL的Gedatolisib對(duì)照品溶液4份，每份50 μL，分別置于5 mL EP管中，分別用空白人工胃液、空白人工腸液、人工胃液、人工腸液稀釋至刻度（含醇量均為1%）;再用EP管分裝200 μL，振蕩混勻，于37 ℃水浴中孵育0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0 h。
2.4.4 血漿樣品處理
取“2.4.2”項(xiàng)下樣品200 μL，加入質(zhì)量濃度為5 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液400 μL，渦旋5 min混勻，于4 ℃下以20 000×g離心10 min，取上清液于37 ℃下以氮?dú)饬鞔蹈?，殘?jiān)蛹状?00 μL復(fù)溶，渦旋5 min混勻，于4 ℃下以20 000×g離心10 min，取上清液備測(cè)。
2.4.5 人工胃/腸液樣品處理
取“2.4.3”項(xiàng)下樣品200 μL，加入質(zhì)量濃度為5 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液400 μL，渦旋5 min混勻，于4 ℃下以20 000×g離心10 min，取上清液備測(cè)。
2.5 生物樣品定量分析方法學(xué)考察
2.5.1 專屬性考察
分別取空白血漿、空白血漿+Gedatolisib對(duì)照品（100 μg/mL）、血漿樣品（10 μg/mL Gedatolisib孵育0.5 h），除空白血漿不加入內(nèi)標(biāo)外其余均按“2.4.4”項(xiàng)下方法處理，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖;另取空白人工胃液、空白人工腸液、人工胃液、人工腸液、人工胃液+Gedatolisib對(duì)照品（100 μg/mL）、人工腸液+Gedatolisib對(duì)照品（100 μg/mL）、人工胃液樣品（10 μg/mL Gedatolisib孵育0.5 h）、人工腸液樣品（10 μg/mL Gedatolisib孵育0.5 h），除空白人工胃腸液和人工胃腸液不加入內(nèi)標(biāo)外其余均按“2.4.5”項(xiàng)下方法處理，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果，在該色譜條件下，Gedatolisib和內(nèi)標(biāo)均能同時(shí)被檢出，保留時(shí)間分別為6.94、9.42 min，分離度良好，不受內(nèi)源性物質(zhì)干擾，詳見(jiàn)圖2。
2.5.2 線性關(guān)系考察
取大鼠空白血漿、空白人工胃液、空白人工腸液、人工胃液和人工腸液各198 μL，分別精密加入不同質(zhì)量濃度的Gedatolisib對(duì)照品溶液2 μL，制成Gedatolisib質(zhì)量濃度依次為0.5、1、2、5、10、20、40 μg/mL的樣品溶液（含醇量為1%），渦旋5 min混勻，分別按“2.4.4”“2.4.5”項(xiàng)下方法處理，記錄峰面積。以Gedatolisib峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)（y）、Gedatolisib的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）進(jìn)行回歸分析，得Gedatolisib在空白血漿中的回歸方程為y=0.034 5x-0.008 9（R2=0.999 6），在空白人工胃液中的回歸方程為y=0.035 1x-0.004 3（R2=0.999 1）、在空白人工腸液中的回歸方程為y=0.033 4x-0.005 2（R2=0.999 5）、在人工胃液中的回歸方程為y=0.034 4 x-0.008 6（R2=0.999 3）、在人工腸液中的回歸方程為y=0.033 8x-0.001 8（R2=0.999 4）。結(jié)果表明，Gedatolisib檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍均為1～40 μg/mL，定量下限均為1 μg/mL。
2.5.3 準(zhǔn)確度、精密度、穩(wěn)定性試驗(yàn)
取大鼠空白血漿、空白人工胃液、空白人工腸液、人工胃液和人工腸液各198 μL，分別精密加入不同質(zhì)量濃度的Gedatolisib對(duì)照品溶液2 μL，制成定量下限質(zhì)量濃度（1 μg/mL）樣品溶液和低、中、高質(zhì)量濃度（2、10、30 μg/mL）質(zhì)控樣品溶液（含醇量為1%），每質(zhì)量濃度平行5份，分別按“2.4.4”“2.4.5”項(xiàng)下方法處理，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算Gedatolisib含量，以測(cè)得值與真實(shí)值進(jìn)行比較，考察準(zhǔn)確度。以含量的RSD考察日內(nèi)精密度;連續(xù)進(jìn)樣3 d，同法考察日間精密度。將上述處理后的樣品溶液于室溫下放置12 h，再進(jìn)樣分析，以含量的RSD考察穩(wěn)定性。結(jié)果見(jiàn)表1（表中結(jié)果均以檢測(cè)值范圍表示）。
2.6 Gedatolisib在SD大鼠血漿中的穩(wěn)定性考察
按“2.4.2”項(xiàng)下方法配制血漿樣品，按“2.4.4”項(xiàng)下方法處理，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算各樣品中藥物的質(zhì)量濃度。每樣品平行測(cè)定3次。以孵育前各樣品中藥物的理論質(zhì)量濃度（分別為2、10、30 μg/mL）計(jì)算各孵育時(shí)間點(diǎn)的藥物剩余百分比。結(jié)果，Gedatolisib在大鼠血漿中孵育2.0 h時(shí)剩余百分比約為63%（n=3），繼續(xù)孵育Gedatolisib的剩余百分比無(wú)明顯變化，推測(cè)降解反應(yīng)達(dá)到平衡，詳見(jiàn)表2。
2.7 Gedatolisib在人工胃/腸液中的穩(wěn)定性考察
按“2.4.3”項(xiàng)下方法配制人工胃/腸液樣品，按“2.4.5”項(xiàng)下方法處理，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算各樣品中藥物的質(zhì)量濃度。每樣品平行測(cè)定3次。以孵育前各樣品中藥物的理論質(zhì)量濃度（10 μg/mL）計(jì)算各孵育時(shí)間點(diǎn)的藥物剩余百分比。結(jié)果，Gedatolisib在空白人工腸液中孵育不同時(shí)間的剩余百分比均在（99.18±2.15）%～（103.20±3.41）%范圍內(nèi);在人工腸液中孵育至2.0 h時(shí)剩余百分比低至（88.76±1.53）%，之后隨著時(shí)間延長(zhǎng)，剩余百分比無(wú)明顯變化;Gedatolisib在空白人工胃液中孵育2.0 h時(shí)剩余百分比低至約（85.63±1.55）%，之后隨著時(shí)間延長(zhǎng)，剩余百分比無(wú)明顯變化;在人工胃液中的剩余百分比從0 h的（94.94±3.52）%下降至6.0 h的（16.19±1.17）%，詳見(jiàn)表3。
2.8 Gedatolisib的降解產(chǎn)物檢測(cè)試驗(yàn)
由于孵育時(shí)間內(nèi)人工胃液中藥物剩余百分比過(guò)低，剩余量無(wú)法保證有效濃度，難以保證藥效發(fā)揮;另外，在空白人工胃液、空白人工腸液、人工腸液中Gedatolisib表現(xiàn)穩(wěn)定，此外因Gedatolisib以靜脈注射給藥，所以僅選取血漿樣品進(jìn)行降解產(chǎn)物分析。采集在“2.6”項(xiàng)下穩(wěn)定性試驗(yàn)中Gedatolisib剩余百分比最低的孵育體系（即質(zhì)量濃度為10 μg/mL孵育2.0 h的血漿樣品）為體外孵育樣品，并以未加入Gedatolisib的孵育溶液（空白血漿）為空白樣品，按“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，比較空白樣品和體外孵育樣品的總離子流圖（見(jiàn)圖3），找出差異峰;通過(guò)MSE Continuum模式獲得各色譜峰的準(zhǔn)分子離子及碎片離子信息;利用UNIFI 1.8.2數(shù)據(jù)庫(kù)推測(cè)Gedatolisib的降解產(chǎn)物。
由圖3可見(jiàn)，體外孵育樣品與空白樣品的差異峰出現(xiàn)在正離子模式掃描下的6.42 min處。該差異峰的MS掃描通道可見(jiàn)m/z 616.335 1、632.327 7、630.317 0、602.278 6[M+H]+的分子離子峰。其中，準(zhǔn)分子離子峰m/z ?616.335 1[M+H]+為原型化合物Gedatolisib（見(jiàn)圖4）;根據(jù)降解產(chǎn)物中的準(zhǔn)分子離子峰m/z 632.327 7[M+H]+推測(cè)，Gedatolisib結(jié)構(gòu)中的末端氮原子可能發(fā)生氧化，生成降解產(chǎn)物
3 討論
定量分析方法驗(yàn)證的目的與意義在于考察Gedatolisib、內(nèi)標(biāo)與所含基質(zhì)組分是否能夠有效分離以及在所建立的檢測(cè)條件下是否能夠準(zhǔn)確定量。因此，本研究前期考察了孵育體系中存在的緩沖鹽、血漿中各種酶對(duì)待測(cè)物定量分析的影響。結(jié)果顯示，Gedatolisib和內(nèi)標(biāo)均能有效分離，且內(nèi)源性物質(zhì)無(wú)干擾。
化合物通過(guò)在體外與血漿共同孵化，能夠快速確定該化合物在血漿中是否易發(fā)生降解及其降解的程度。參考文獻(xiàn)研究[4]和前期試驗(yàn)，Gedatolisib在SD大鼠血漿中穩(wěn)定性的孵育時(shí)間選定在3.0 h，在人工胃腸液中穩(wěn)定性的孵育時(shí)間選定為6.0 h。
Gedatolisib分子末端是由富余電子的氮原子和兩個(gè)供電子的甲基構(gòu)成，二甲氨基結(jié)構(gòu)中氮弱堿性導(dǎo)致其極易被氧化，也常發(fā)生末端脫甲基化。與其他含氮雜環(huán)（如哌啶或嘧啶）相比，Gedatolisib結(jié)構(gòu)中的嗎啉環(huán)由于氧原子的誘導(dǎo)作用和氮原子的弱堿性，形成了一個(gè)相對(duì)缺電子的雜環(huán)體系，使得嗎啉環(huán)易被氧化成內(nèi)酯或內(nèi)酰胺，該結(jié)構(gòu)在酸性環(huán)境下易發(fā)生開(kāi)環(huán)[7]。
本研究在Gedatolisib的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在血漿中孵育一段時(shí)間后Gedatolisib剩余百分比能夠達(dá)到平衡，而在人工胃液（pH 1.3）中，Gedatolisib則呈現(xiàn)出不可逆的降解。這可能是該化合物在多項(xiàng)臨床試驗(yàn)中均采用靜脈給藥而非口服給藥的重要原因。
本研究建立了在血漿、人工胃/腸液等生物樣品中Gedatolisib的含量測(cè)定方法，考察了Gedatolisib在上述生物樣品中孵育3～6 h的穩(wěn)定性;同時(shí)，利用UPLC-Q- TOF/MS技術(shù)結(jié)合UNIFI 1.8.2數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)體外血漿中Gedatolisib的降解產(chǎn)物進(jìn)行分析，初步確定找到了Gedatolisib結(jié)構(gòu)中易發(fā)生降解的部位，為后續(xù)同類衍生物的結(jié)構(gòu)改造以及該化合物的劑型開(kāi)發(fā)和聯(lián)合用藥方案提供重要參考。
參考文獻(xiàn)
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（收稿日期：2020-02-20 修回日期：2020-05-12）
（編輯：鄒麗娟）
