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    表達(dá)單克隆抗體的CHO細(xì)胞培養(yǎng)工藝放大模型的研究

    2020-07-01 01:49吳琰瑜金穎張光明呂紅
    關(guān)鍵詞:細(xì)胞培養(yǎng)模型策略

    吳琰瑜 金穎 張光明 呂紅

    摘 要:本文以表達(dá)單克隆抗體的CHO細(xì)胞為研究對(duì)象,在15L反應(yīng)器和200L反應(yīng)器中進(jìn)行逐漸放大,研究放大策略及規(guī)模放大模型的建立,為后續(xù)商業(yè)化生產(chǎn)的進(jìn)一步放大提供穩(wěn)定可靠的放大策略及操作模型,為抗體藥物生產(chǎn)提供支持。

    關(guān)鍵詞:細(xì)胞培養(yǎng);放大;策略;模型

    0 引言

    生物反應(yīng)器的規(guī)模放大是細(xì)胞培養(yǎng)工藝過(guò)程開(kāi)發(fā)的基本組成部分。在研究哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工藝放大的過(guò)程中,有很多需要重點(diǎn)考察的因素,例如:混合時(shí)間,氧氣轉(zhuǎn)移和二氧化碳去除等。目前在生物制藥工業(yè)生產(chǎn)中,主要通過(guò)研究這些關(guān)鍵因素,進(jìn)而建立大規(guī)模、高密度的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工藝。中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞是目前生物制藥細(xì)胞培養(yǎng)中最常用的宿主細(xì)胞,常被用于生產(chǎn)各種重組蛋白。

    目前細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的工藝開(kāi)發(fā),通常先在小規(guī)模的生物反應(yīng)器中進(jìn)行,鎖定工藝后,將其逐級(jí)放大,直至用于商業(yè)化生產(chǎn)的更大的生物反應(yīng)器。目前國(guó)內(nèi)行業(yè)的反應(yīng)器規(guī)模一般可分為中試規(guī)模(200L、500L)和生產(chǎn)規(guī)模(1000L、5000L),而國(guó)外的大規(guī)模生產(chǎn)的反應(yīng)器可達(dá)到15000L。

    培養(yǎng)工藝在反應(yīng)器的規(guī)模放大一直以來(lái)都是工業(yè)界具有挑戰(zhàn)性的工作。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,大型反應(yīng)器相較于小型反應(yīng)器,在混合和傳質(zhì)效果上的降低會(huì)引起二氧化碳逃逸效果變差、混合時(shí)間變長(zhǎng)等問(wèn)題,進(jìn)而導(dǎo)致在小規(guī)模反應(yīng)器確立的培養(yǎng)工藝放大至生產(chǎn)的大規(guī)模反應(yīng)器時(shí)會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)不如預(yù)期,表現(xiàn)為細(xì)胞密度降低、培養(yǎng)周期縮短、產(chǎn)量大幅下降或者產(chǎn)物質(zhì)量難以控制等一系列問(wèn)題。

    近年來(lái),隨著質(zhì)量源于設(shè)計(jì)(Quality by Design,QbD)

    的理念在生物制藥領(lǐng)域的推廣和應(yīng)用,越來(lái)越多的企業(yè)開(kāi)始在工藝開(kāi)發(fā)階段就開(kāi)始應(yīng)用QbD的理念。因此建立合適的適用于細(xì)胞培養(yǎng)工藝規(guī)模放大的策略和模型,對(duì)進(jìn)行穩(wěn)定的大規(guī)模生產(chǎn),有著十分重要的意義。

    1 培養(yǎng)工藝的規(guī)模放大策略及可能存在的問(wèn)題

    1.1 放大策略

    細(xì)胞培養(yǎng)工藝過(guò)程中的參數(shù)可以分為兩類(lèi):與體積相關(guān)的參數(shù)和與體積無(wú)關(guān)的參數(shù)。不隨反應(yīng)器規(guī)模大小變化而變化的參數(shù),例如:pH、DO、溫度、補(bǔ)料時(shí)間等,這些參數(shù)在放大過(guò)程中前后兩級(jí)保持一致即可。隨著反應(yīng)器規(guī)模大小變化而變化的參數(shù),例如:通氣速率、攪拌轉(zhuǎn)速、補(bǔ)料體積等,在放大過(guò)程中會(huì)根據(jù)反應(yīng)器通氣孔徑的大小和方式,以及攪拌槳的大小和形式而發(fā)生變化。一般來(lái)說(shuō),隨著反應(yīng)器體積的變大,通氣速率一般呈線性上升的趨勢(shì)。通氣流速的放大一般采用單位體積單位時(shí)間的通氣量(vvm)恒定的方法。其中,O2和CO2流速的放大方法在實(shí)際的操作過(guò)程中還要根據(jù)反應(yīng)器中DO和pH控制器的類(lèi)型以及工藝要求的控制策略做適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。在參數(shù)放大過(guò)程中,反應(yīng)器攪拌轉(zhuǎn)速的放大需要考慮的因素比較多。大型反應(yīng)器的攪拌速度需要考慮既能夠?yàn)榉磻?yīng)器提供足夠的混合能力,還要避免造成由于高轉(zhuǎn)速條件下剪切力所引起的不必要的細(xì)胞損傷。轉(zhuǎn)速對(duì)體積氧傳遞系數(shù)(KLa)的影響,也是在放大過(guò)程中需要考慮的一個(gè)重要因素。另外,補(bǔ)料體積等參數(shù)屬于與體積相關(guān)的參數(shù),需要根據(jù)培養(yǎng)體積放大倍數(shù)做一定的調(diào)整。

    1.2 可能存在的問(wèn)題

    在反應(yīng)器細(xì)胞培養(yǎng)工藝規(guī)模放大研究過(guò)程中,目前主要集中在流體剪切力、氧傳遞、溶解二氧化碳的移除以及反應(yīng)器混合能力四個(gè)方面,這些問(wèn)題已經(jīng)成為哺乳動(dòng)物細(xì)胞在放大過(guò)程中公認(rèn)的技術(shù)難題,是規(guī)模放大過(guò)中導(dǎo)致放大效果低于預(yù)期或?qū)е路糯笫〉闹饕?。也是目前哺乳?dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中最具挑戰(zhàn)的難點(diǎn)。

    2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

    2.1 反應(yīng)器放大策略

    反應(yīng)器規(guī)模放大模型的建立采用以下策略:①非體積相關(guān)的參數(shù)保持不變,如pH、DO、溫度、接種密度、培養(yǎng)時(shí)間、補(bǔ)料時(shí)間等;②體積相關(guān)的參數(shù)(線性),如培養(yǎng)體積、補(bǔ)料添加量等;③體積相關(guān)的參數(shù)(非線性),如轉(zhuǎn)速、通氣量等。

    2.2 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備

    2.3 實(shí)驗(yàn)方法

    流加培養(yǎng)方法不變,按照補(bǔ)料策略S11每次流加初始培養(yǎng)體積F1和F2;每天根據(jù)葡萄糖濃度檢測(cè)結(jié)果,在葡萄糖低于4g/L時(shí),補(bǔ)加葡萄糖濃縮液至濃度6g/L。培養(yǎng)收獲時(shí)間設(shè)定為14天。

    15L反應(yīng)器2批,200L反應(yīng)器培養(yǎng)3批,對(duì)15L和200L

    反應(yīng)器的培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。

    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

    3.1 反應(yīng)器規(guī)模放大與縮小

    3.1.1 細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞活率

    按照設(shè)定好的工藝在2批15L和3批200L反應(yīng)器中進(jìn)行驗(yàn)證,如圖1所示,隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加,活細(xì)胞密度不斷增加。15L反應(yīng)器與200L反應(yīng)器在細(xì)胞生長(zhǎng)保持一致,從第10天開(kāi)始細(xì)胞密度維持在一個(gè)較高的水平,出現(xiàn)輕微下降的趨勢(shì)。

    在細(xì)胞活率方面,如圖2所示。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加,細(xì)胞活率在逐漸降低,但降低幅度較低。培養(yǎng)結(jié)束第14天時(shí)15L反應(yīng)器中細(xì)胞活率是90.5%,在200L反應(yīng)器中是93.5%,均處于一個(gè)活率較高的水平,并且15L反應(yīng)器與200L反應(yīng)器中的細(xì)胞活率的趨勢(shì)保持一致。

    3.1.2 細(xì)胞代謝

    由圖3可知,2批15L和3批200L反應(yīng)器的乳酸代謝情況基本一致,從第0天到第4天為乳酸生成階段,此階段乳酸快速生成,第四天達(dá)到最高,之后進(jìn)入乳酸消耗階段,到第9天左右乳酸完全耗光。

    由圖4可知,整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中氨都是持續(xù)累計(jì)的過(guò)程,在培養(yǎng)前期反應(yīng)器中銨離子濃度較低,從第8天開(kāi)始反應(yīng)器中銨離子濃度逐漸增大,15L反應(yīng)器與200L反應(yīng)器中氨的代謝趨勢(shì)一致。

    3.2 蛋白表達(dá)

    圖5所示為培養(yǎng)工藝在2批15L和3批200L反應(yīng)器中的蛋白表達(dá)情況對(duì)比。由圖可知,15L和200L反應(yīng)器的蛋白表達(dá)情況基本一致,培養(yǎng)結(jié)束時(shí)產(chǎn)量均在3g/L左右。

    3.3 蛋白質(zhì)量

    圖6所示為2批15L和3批200L反應(yīng)器上的抗體SEC純度對(duì)比,由圖可知,不同規(guī)模反應(yīng)器的抗體SEC純度無(wú)顯著差異,最終蛋白純度均在98%左右。

    綜上所述,從2批15L和3批200L反應(yīng)器中進(jìn)行的細(xì)胞工藝,在細(xì)胞密度、細(xì)胞活率、乳酸代謝、氨代謝、蛋白表達(dá)和蛋白質(zhì)量六個(gè)方面進(jìn)行對(duì)比,各參數(shù)在兩級(jí)反應(yīng)器中趨勢(shì)基本一致,可說(shuō)明該培養(yǎng)工藝按照既定放大策略能夠穩(wěn)定的放大至較大規(guī)模的反應(yīng)器中。

    4 小結(jié)

    本文首先對(duì)15L反應(yīng)器放大到200L反應(yīng)器中工藝的各參數(shù)進(jìn)行了分析討論,建立了反應(yīng)器規(guī)模放大的策略,之后在15L和200L反應(yīng)器上進(jìn)行了放大生產(chǎn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明15L反應(yīng)器與200L反應(yīng)器是表現(xiàn)一致。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,首先將放大參數(shù)按照非體積相關(guān)的參數(shù)和體積相關(guān)的參數(shù)進(jìn)行分類(lèi)。非體積相關(guān)的參數(shù)在放大的過(guò)程中保持不變。體積相關(guān)的參數(shù)按照線性相關(guān)和非線性相關(guān)的參數(shù)進(jìn)行分類(lèi),然后選擇相關(guān)參數(shù)合適的放大準(zhǔn)則。最后,在2批15L和3批200L反應(yīng)器進(jìn)行了放大的實(shí)施和對(duì)比,結(jié)果表明細(xì)胞在生長(zhǎng)、代謝、蛋白表達(dá)和蛋白質(zhì)量方面等方面表現(xiàn)基本一致。

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