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    基于PI3K/Akt通路探討脈絡(luò)寧注射液對早期糖尿病視網(wǎng)膜病變的作用

    2020-07-01 14:31:42梅子寒楊杰王煒曹鵬楊艷李鵬飛朱可夫江滔張夢婷
    中醫(yī)眼耳鼻喉雜志 2020年1期
    關(guān)鍵詞:脈絡(luò)高糖內(nèi)皮細(xì)胞

    梅子寒 楊杰 王煒 曹鵬 楊艷 李鵬飛 朱可夫 江滔 張夢婷

    糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)是一種嚴(yán)重的致盲性糖尿病眼部并發(fā)癥。對中國1990~2017年45歲以上的糖尿病患者調(diào)查發(fā)現(xiàn),DR 發(fā)病率為17.22%[1]。幾乎所有病程在 10 年以上的糖尿病患者都存在不同程度的視網(wǎng)膜病變[2]。DR導(dǎo)致的失明占所有失明人數(shù)的8.9%[3]??梢?,DR的患病率高,致盲率高,嚴(yán)重影響國民生存質(zhì)量,因此早期診斷、積極治療DR是防治糖尿病并發(fā)癥病變的一項(xiàng)重要內(nèi)容。脈絡(luò)寧注射液由南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院(江蘇省中醫(yī)藥研究院)研制,由玄參、石斛、牛膝、金銀花、黨參等藥物提取后制成的中藥復(fù)方制劑,具有清熱化陰、活血化瘀的功效[4]。大量臨床研究證實(shí)該藥在糖尿病視網(wǎng)膜病治療方面療效顯著[5-8]。該藥能抑制體外高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,對高糖環(huán)境下的視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞有保護(hù)作用[9]。DR的發(fā)生發(fā)展是由多種細(xì)胞因子參與、炎癥、離子通道和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)代謝酶共同調(diào)控的復(fù)雜過程。PI3K/Akt通路在細(xì)胞生長、增殖,分化過程中起著重要的作用,Akt 在視網(wǎng)膜組織中是一個內(nèi)源性的視網(wǎng)膜生存因子。在高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變模型中,高糖環(huán)境直接或間接的抑制了內(nèi)源性 Akt 的生成及表達(dá),造成視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡增加,增殖減少。在糖尿病發(fā)生和發(fā)展過程中,持續(xù)的高血糖能夠促進(jìn)PI3K/Akt通路活化,從而促使多種細(xì)胞因子合成與釋放,最終加速DR的發(fā)展過程。本研究基于PI3K/Akt信號通路在維持正常視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞存活中所起的關(guān)鍵作用[10],我們擬從該信號通路研究脈絡(luò)寧注射液防止早期糖尿病視網(wǎng)膜病變的作用機(jī)制,將進(jìn)一步明確脈絡(luò)寧注射液在DR早期的治療作用及分子機(jī)制,并進(jìn)一步為揭示DR早期病變的發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 實(shí)驗(yàn)動物及細(xì)胞

    SPF級SD雄性大鼠30只,體重200~220 g,由青島市藥檢所實(shí)驗(yàn)動物中心提供。所有大鼠均飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)化動物中心,單籠標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng),自由進(jìn)食和飲水,室溫18~22 ℃。人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞HRCEC(購自北京協(xié)和庫)。

    2 實(shí)驗(yàn)試劑及設(shè)備

    鏈脲佐菌素(Sigma公司產(chǎn)品);血糖儀、血糖試紙(美國強(qiáng)生Lifescan公司);脈絡(luò)寧注射液(金陵藥業(yè)股份有限公司南京金陵制藥廠);葡萄糖(Sigma公司產(chǎn)品);DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco公司產(chǎn)品);Akt、p-Akt、PI3K、Bcl2、caspase抗體(美國Santa Cruz公司)、二抗(美國Cell Signalling公司);熒光定量PCR儀7500型(南京鈦格威生物技術(shù)有限公司);Odyssey近紅外雙色激光成像系統(tǒng)(美國LICOR公司);微量移液器(艾本德公司)。

    3 DR模型的建立、分組及給藥

    將30只SD雄性大鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型組、脈絡(luò)寧組,每組10只。待各組大鼠體重在200~250 g時采用鏈脲佐菌素 (Streptozotocin,STZ)誘發(fā)糖尿病造模。造模前,將各組大鼠禁食12 h。用0.01 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液配成10 g/L的STZ,實(shí)驗(yàn)組大鼠按60 mg/kg劑量左下腹腔內(nèi)注射STZ,對照組大鼠注射等量的溶劑(0.01 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液)72 h后取尾血測血糖及尿糖。凡血糖≥16.7 mmol/L及尿糖陽性的大鼠定為糖尿病模型。自造模成功后開始進(jìn)行脈絡(luò)寧注射液腹腔注射,每日一次,劑量為0.92 mL/kg(按照人臨床給藥量為10 mL,一日一次,大鼠換算系數(shù)為5.5進(jìn)行劑量換算),連續(xù)給藥12 w??瞻讓φ战M和模型組腹腔注射等體積的生理鹽水。

    4 檢測磷酸化Akt蛋白在大鼠視網(wǎng)膜組織中的表達(dá)

    給藥結(jié)束時處死各組大鼠取出左側(cè)眼球,沿著角膜緣剪開眼球的角膜,去除角膜、晶狀體和玻璃體后,用眼科刀將視網(wǎng)膜取出。Western blot檢測各組大鼠視網(wǎng)膜組織中p-Akt、Akt蛋白以及PI3K、Bcl2、Caspase 3水平。利用RIPA裂解液裂解4C°離心收集上清測定蛋白濃度,使用 2×還原上樣緩沖液調(diào)節(jié)各組蛋白濃度一致,100℃水浴保溫 5min,SDS-PAGE 電泳后,將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,1% BSA 封閉2 h,一抗4C°振蕩孵育過夜,TBST振蕩清洗三次,每次5 min。二抗室溫?fù)u床振蕩孵育1 h,TBST振蕩清洗三次,每次5 min。HRP標(biāo)記二抗用ECL顯色曝光,對照Marker記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

    5 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

    5.1體外培養(yǎng)HRCEC(人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞)

    HRCEC細(xì)胞在含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞處于對數(shù)生長時,調(diào)整細(xì)胞數(shù)為 2×105/mL,每孔2 mL接種于6孔培養(yǎng)板中。將細(xì)胞分為三組:正常對照組、高糖組、脈絡(luò)寧組。除正常對照組外,其余各組均采用25 mmol/L葡萄糖進(jìn)行高糖培養(yǎng)來模擬體內(nèi)高糖環(huán)境,同時脈絡(luò)寧組加入0.8 μg/mL脈絡(luò)寧注射液,處理時間均為72 h。

    5.2Westen blot檢測HRCEC細(xì)胞中Akt、p-Akt、PI3K、Bcl2、Caspase的蛋白水平

    收集各組細(xì)胞,用PIPA裂解,4C°離心收集上清測定蛋白濃度,使用2×還原上樣緩沖液調(diào)節(jié)各組蛋白濃度一致,100C°水浴保溫5min,SDS-PAGE電泳后,將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,1% BSA封閉2 h,一抗4 ℃振蕩孵育過夜,TBST振蕩清洗三次,每次5 min。二抗室溫?fù)u床振蕩孵育1 h,TBST振蕩清洗三次,每次5 min。HRP標(biāo)記二抗用ECL顯色曝光,對照Marker記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

    5.3檢測動物實(shí)驗(yàn)組大鼠視網(wǎng)膜中的中Akt、PI3K、Bcl2和Caspase 3 mRNA水平

    6 統(tǒng)計學(xué)方法

    7 結(jié)果

    7.1絡(luò)寧注射液抑制HRCEC 細(xì)胞中p-Akt蛋白的表達(dá)

    與正常對照組比較,高糖誘導(dǎo)組細(xì)胞中p-Akt蛋白水平明顯增加;脈絡(luò)寧給藥組p-Akt蛋白表達(dá)量明顯低于高糖誘導(dǎo)組(圖一)。可見,脈絡(luò)寧可以抑制高糖誘導(dǎo)的HRCEC 細(xì)胞中高水平的p-Akt的表達(dá)。

    7.2脈絡(luò)寧注射液可降低糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中p-Akt及其上游激酶PI3K以及下游促凋亡蛋白Bcl2、Caspase蛋白水平

    與正常對照組大鼠比較,糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中 p-Akt水平明顯增加,脈絡(luò)寧注射液給藥能抑制糖尿病大鼠中高水平的p-Akt,而AKT總蛋白在正常對照組、糖尿病組、脈絡(luò)寧給藥組之間無明顯變化。促進(jìn)Akt發(fā)生磷酸化的上游激酶PI3K以及Akt下游的促凋亡蛋白Bcl2、Caspase的蛋白水平在各組間顯示出與p-Akt相同的變化趨勢,由此可見,脈絡(luò)寧注射液能抑制糖尿病大鼠中高水平的pAkt、PI3K、Bcl2和Caspase的蛋白表達(dá)(圖1)。

    圖1 脈絡(luò)寧給藥對高糖誘導(dǎo)的pAkt表達(dá)的影響

    7.3脈絡(luò)寧注射液可降低糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中PI3K以及促凋亡的基因Bcl2、Caspase 3的表達(dá)

    通過Real-time PCR的方法對Akt上下游相關(guān)的基因的檢測結(jié)果表明 AKT 的mRNA水平在正常對照組、糖尿病組、脈絡(luò)寧給藥組三組間的表達(dá)無顯著性差異(P>0.05)(表1);與正常對照組比較,PI3K的mRNA水平在糖尿病組和脈絡(luò)寧給藥組中均顯著升高(P<0.01);與糖尿病組比較,脈絡(luò)寧顯著下調(diào)了PI3K的mRNA水平(P<0.05); Bcl2、Caspase mRNA在糖尿病組和模型組中均表達(dá)增加,脈絡(luò)寧干預(yù)后其表達(dá)水平均顯著降低。脈絡(luò)寧注射液顯著抑制了糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中PI3K、Bcl2和Caspase的mRNA的表達(dá)。

    圖2 脈絡(luò)寧給藥對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中中各Akt相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

    Fig.2 The effect of mailuoning on the expression of Akt related proteins in diabetic rat retinal tissue

    表1 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中Akt、PI3K、Bcl2、caspase mRNA相對表達(dá)量比較

    注:采用單因素方差分析,與空白對照組比較,##:P<0.01,###:P<0.005;與模型組比較,*:P<0.05,**:P<0.01,***:P<0.005

    8 討論

    DR是糖尿病微血管病變在眼底獨(dú)特環(huán)境中的表現(xiàn),長期慢性的高血糖癥是其發(fā)病的基礎(chǔ)。DR發(fā)病的中心環(huán)節(jié)是高血糖癥及其引起的組織缺血缺氧導(dǎo)致的一系列病理改變,包括視網(wǎng)膜微血管的滲漏、閉鎖,進(jìn)而造成視網(wǎng)膜組織水腫(尤其是黃斑水腫)、滲出、出血以及組織缺血缺氧引起的新生血管的形成,可進(jìn)一步發(fā)展為玻璃體出血和牽拉性視網(wǎng)膜脫離,最終導(dǎo)致盲目[11]。DR的早期變化為視網(wǎng)膜的損傷,毛細(xì)血管基底膜增厚,周細(xì)胞和視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞(retinal microvascular endothelial cells,RMECs)喪失,其喪失的性質(zhì)為細(xì)胞凋亡[12]。視網(wǎng)膜缺血使促血管生成物質(zhì)增加,引起視網(wǎng)膜新生血管形成,從而導(dǎo)致增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生。周細(xì)胞對內(nèi)皮細(xì)胞起支持作用,且具有收縮功能,可調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜毛細(xì)血管局部的血流量和血管通透性,對于微血管結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定起著重要的作用;內(nèi)皮細(xì)胞之間以緊密連接的方式相互連接,構(gòu)成的血視網(wǎng)膜屏障 (blood retinal barrier,BRB)是其中最為重要的內(nèi)屏障[13]。因此內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性對維持視網(wǎng)膜毛細(xì)血管的穩(wěn)定性具有十分重要的作用,成為早期糖尿病視網(wǎng)膜病變治療的關(guān)鍵。

    PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路由Akt、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)、促凋亡因子Bad(bcl-2-associated death protein,Bad)等一系列相關(guān)因子組成,通過促進(jìn)細(xì)胞生長、增殖、凋亡等生命活動,來參與糖尿病、腫瘤等多種疾病的病理過程,是體內(nèi)細(xì)胞存活的一條重要的通路[14-16]。大量研究表明Akt信號通路的激活能夠抑制各種各樣細(xì)胞凋亡刺激所誘導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡,且顯負(fù)性Akt干擾正常AKT信號能夠促進(jìn)生長因子誘導(dǎo)的細(xì)胞生存[17-20]。在高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變模型中,高糖環(huán)境直接或間接的抑制了內(nèi)源性Akt的生成及表達(dá),促進(jìn)磷酸化Akt的產(chǎn)生,造成視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡增加,增殖及遷移減少,大量的血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡造成血管閉塞,形成視網(wǎng)膜無灌注區(qū)。本實(shí)驗(yàn)中,體外HRCEC細(xì)胞水平研究發(fā)現(xiàn)脈絡(luò)寧能抑制高糖誘導(dǎo)的HRCEC細(xì)胞中的pAkt水平的增加。體內(nèi)糖尿病模型小鼠上研究發(fā)現(xiàn),脈絡(luò)寧能抑制糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中的高表達(dá)的pAkt并且也能抑制糖尿病大鼠中Akt的上游激酶PI3K以及下游促凋亡蛋白Bcl-2、Csapase3的基因mRNA的表達(dá)以及蛋白水平的增加。

    綜上所述,我們通過大鼠糖尿病模型上的體內(nèi)藥效試驗(yàn)和在人視網(wǎng)膜細(xì)胞HRCEC上的高糖誘導(dǎo)的損傷模型上的研究揭示了脈絡(luò)寧注射液通過調(diào)控PI3K/Akt信號通路來介導(dǎo)對糖尿病視網(wǎng)膜細(xì)胞的保護(hù)作用從而改善早期糖尿病視網(wǎng)膜脈絡(luò)病變的作用。

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