一株產(chǎn)腸毒素大腸桿菌短尾噬菌體分離與鑒定

魏炳棟，叢 聰，于 維，徐永平,*，李紀彬，李淑英

（1.吉林省農(nóng)業(yè)科學院畜牧分院，吉林 公主嶺 136100；2.大連賽姆生物工程技術(shù)有限公司博士后科研工作站，遼寧 大連 116620；3.吉林省吉嘉飼料添加劑有限公司，吉林 公主嶺 136100；4.大連理工大學生物工程學院，遼寧 大連 116024）

產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC）是動物腹瀉的主要致病菌，ETEC可產(chǎn)生一種或幾種腸毒素，腸毒素通過影響腸細胞壁通透性，使水和電解質(zhì)流向腸腔，導致水樣性腹瀉[1]。其中以仔豬感染ETEC引發(fā)的腹瀉尤為嚴重，發(fā)病率為20%～100%，死亡率為10%～60%，初次發(fā)病率高達100%，再次感染發(fā)病率則大幅降低[2]。目前，主要采用抗菌藥物治療ETEC。但抗菌藥物大量使用，尤其作為飼料添加劑長期使用，致病性大腸桿菌產(chǎn)生耐藥性，嚴重威脅人類健康和公共衛(wèi)生安全。

噬菌體（Bacteriophage，簡稱phage）是一類可感染細菌、真菌、放線菌或螺旋菌等微生物的病毒總稱，是自然界中多樣性和數(shù)量最為豐富的生物。噬菌體最先由英國科學家Frederick Twort（1915年）[3]和加拿大微生物學家Felix D'Herelle（1917年）[4]發(fā)現(xiàn)，后者首次提出“噬菌體”概念。此后，科研和治療機構(gòu)研發(fā)商業(yè)化的噬菌體制劑對抗細菌感染。直至20世紀40年代，由于抗生素量產(chǎn)及噬菌體療法存在缺陷，噬菌體研究一度陷入中斷。20世紀80年代，由于多重耐藥菌出現(xiàn)，噬菌體研究重新受到重視，以期尋求抗生素替代品。目前噬菌體應(yīng)用研究范圍較廣，不僅針對人類疾病預(yù)防與治療，還涉及動物、食品及飼料中病原菌清除、細菌生物被膜裂解等方面。

本研究以豬源ETEC為宿主菌，從養(yǎng)殖場污水中分離一株裂解性噬菌體，對其開展生物學特性及全基因組分析，旨在為防控ETEC感染提供新的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品來源

大腸桿菌 （Escherichia coli,E.coli） E5、E6、E8、E11和E13分離自吉林省農(nóng)業(yè)科學院畜牧分院養(yǎng)豬場排泄物，由吉林省農(nóng)業(yè)科學院畜牧分院抗生素替代品實驗室保存，宿主菌ETEC K88及用于鑒定宿主譜所選大腸桿菌236、233、238和F18等菌種購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心（CVCC），大腸桿菌12588購自北納生物（BNCC），產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌（Shiga toxin-producing E.coli,STEC）10668、志賀氏菌屬（Shigella spp.）、沙門氏菌屬（Salmonella spp.）和變形桿菌屬（Proteus spp.）菌種均購自中國普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC）。采集豬場污水用于分離噬菌體。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，溶于1 L純凈水中，pH 7.0，121℃滅菌20 min，常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

LB固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，瓊脂粉18 g溶于1 L純凈水中，pH 7.0，121℃滅菌20 min，常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

LB半固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，瓊脂粉9 g溶于1 L純凈水中，pH 7.0，121℃滅菌20 min，常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 噬菌體分離與鑒定

噬菌體分離與鑒定參照文獻[5]。噬菌體分離：采集污水用濾紙過濾，去除固體雜質(zhì)后，取污水樣50 mL，12 000 r·min-1離心6 min，0.22 μm 濾膜過濾得上清液；取上清液30 mL加入30 mL LB液體培養(yǎng)基和5 mL處于對數(shù)期宿主菌液，混勻后于37℃，160 r·min-1恒溫搖床培養(yǎng)過夜；取1 mL培養(yǎng)液，12 000 r·min-1離心6 min，0.22 μm濾膜過濾得上清液，即為噬菌體原液。取100 μL噬菌體原液與200 μL對數(shù)期宿主菌混合，加入約 8 mL半固體LB培養(yǎng)基中，混合均勻后倒入含有LB固體培養(yǎng)基平板，待上層凝固后，37℃恒溫箱過夜培養(yǎng)。出現(xiàn)透明斑，則說明噬菌體存在。通過連續(xù)6次單斑分離，即獲得純化后噬菌體。

1.2.2 噬菌體感染復(fù)數(shù)（Multiplicity of infection，MOI）測定

噬菌體感染復(fù)數(shù)測定參照文獻[5]。將已知效價的噬菌體與宿主菌各200 μL按照0.0001、0.001、0.01、0.1、1和10比例混合，37 ℃，160 r·min-1震蕩培養(yǎng)5 h，12 000 r·min-1，離心6 min，收集上清后，0.22 μm濾膜過濾；取濾液梯度稀釋后，利用雙層平板法測噬菌體效價，所測得效價最高感染復(fù)數(shù)組即為最佳感染復(fù)數(shù)（Optimal muhiplieity of in?fection，OMOI）。每個試驗重復(fù)3次。

1.2.3 噬菌體一步生長曲線（One-step growth curve）測定

噬菌體一步生長曲線參照文獻[6]。按照最佳MOI將1 mL培養(yǎng)至對數(shù)期宿主菌與噬菌體混合，37 ℃孵育15 min，12 000 r·min-1離心10 min，棄上清；2 mL 37℃預(yù)熱LB液體培養(yǎng)基洗滌兩次；加入2 mL 37℃預(yù)熱LB液體培養(yǎng)基重懸，加入10 mL 37℃預(yù)熱LB液體培養(yǎng)，充分混勻，迅速置于37℃振蕩培養(yǎng)，同時開始計時T0=0，每隔10 min采樣，連續(xù)采樣120 min，采用雙層平板法測定效價，以時間為橫坐標，效價為縱坐標，繪制噬菌體一步生長曲線。

1.2.4 噬菌體溫度和pH敏感性測定

分別取1 mL噬菌體裂解液加入1.5 mL無菌離心管中，再將離心管分別置于40、50、60、70、80℃水浴鍋中，按照20、40、60、80、100、120 min不同時間點從離心管中取出100 μL噬菌體裂解液，冷卻至室溫，雙層平板法測其效價，每組3個重復(fù)。利用1 mol·L-1HCl和1 mol·L-1NaOH溶液將LB培養(yǎng)基pH調(diào)至2～12，分別取900 μL不同pH培養(yǎng)基加入1.5 mL離心管，加入100 μL上述噬菌體裂解液，37℃恒溫培養(yǎng)1 h，利用雙層平板法測噬菌體效價，每組3個平行。

1.2.5 噬菌體氯仿敏感性

取1 mL噬菌體，按1%體積加入氯仿溶液，充分混合后置于室溫靜置30 min，待分層后取上層溶液測定效價。

1.2.6 噬菌體宿主譜測定

噬菌體測定采用點滴法，具體過程如下：將宿主菌液均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基，待其晾干后，吸取5 μL噬菌體裂解液滴于培養(yǎng)基，37℃倒置培養(yǎng)10～12 h，觀察是否出現(xiàn)噬菌斑，若噬菌斑出現(xiàn)說明噬菌體對該菌株有裂解作用。

1.2.7 噬菌體透射電鏡觀察

首先將噬菌體制備成濃縮顆粒，制備噬菌體濃縮顆粒步驟如下：在噬菌體原液中加入NaCl，使其終濃度為1 mol·L-1，攪拌充分溶解后冰浴1 h，12 000 r·min-1離心5 min，得到上清液，然后加入PEG 8 000濃度達10%（w/v），玻璃棒緩慢攪拌使其充分溶解，冰浴過夜，10 000 r·min-1離心5 min，棄上清，將離心管倒置20 min至管內(nèi)液體全部流干，然后5 mL SM緩沖液重懸，4℃保存。電鏡觀察步驟如下：將制備重懸液10 μL滴于銅網(wǎng)上，待其自然沉淀10 min，濾紙從側(cè)面小心吸干多余液體，加少量2%磷鎢酸到銅網(wǎng)上，染色3 min，待銅網(wǎng)干燥后電鏡觀察。

1.2.8 噬菌體基因組測序

噬菌體基因組提取采用苯酚-氯仿法[7]。將提取DNA沉淀室溫干燥后，用適量雙蒸水重懸，-20℃冷凍保存。

1.2.9 噬菌體全基因組測序及生物信息學分析

噬菌體基因組測序由上海派森諾生物公司完成。采用Illumina Hiseq測序平臺，TruSeqTMDNA Sample Prep Kit構(gòu)建DNA文庫?；蚪M序列拼裝結(jié)果由上海派森諾生物公司提供。利用NCBI在線工具BLASTp（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）對噬菌體基因組開放閱讀框作功能注釋；利用tRNAscan-SE預(yù)測噬菌體全基因組tRNA[8]；軟件MEGA7.0對噬菌體末端酶大亞基序列構(gòu)建進化樹；利用CGView Serve(http://cgview.ca)對噬菌體全基因組作環(huán)狀圖[9]。利用在線軟件（https://cge.cbs.dtu.dk/services/ResFinder/和 https://cge.cbs.dtu.dk/services/Virulence?Finder/）預(yù)測抗生素耐藥基因和毒力因子。

2 結(jié)果與分析

2.1 噬菌體分離與鑒定

以產(chǎn)腸毒素大腸桿菌ETEC K88為宿主菌，從養(yǎng)殖場污水中分離噬菌體vB_EcoP_E21，經(jīng)純化6次后，在雙層平板上產(chǎn)生直徑1～2 mm噬菌斑。

2.2 噬菌體形態(tài)學特點

透射電鏡照片顯示，噬菌體vB_EcoP_E21具有典型二十面體結(jié)構(gòu)和非收縮尾部，其頭部直徑約為50 nm，尾部長度約為10 nm，符合短尾噬菌體科（Podoviridae）特點（見圖1）。

2.3 噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)

由表1可知，當MOI=0.1時，噬菌體vB_EcoP_E21效價達到最大9.94 log PFU·mL-1，說明噬菌體vB_EcoP_E21最佳感染復(fù)數(shù)為0.1。

圖1 噬菌體vB_EcoP_E21透射電鏡圖Fig.1 Transmission electron micrograph of phage vB_EcoP_E21

表1 噬菌體vB_EcoP_E21感染復(fù)數(shù)測定Table 1 Determination titer of phage vB_EcoP_E21 at different MOI

2.4 噬菌體一步生長曲線

由圖2可知，噬菌體vB_EcoP_E21潛伏期約為20 min，隨后效價急劇增加后趨于穩(wěn)定，則噬菌體vB_EcoP_E21爆發(fā)期約為20 min，根據(jù)公式裂解量=裂解末期噬菌體效價/感染初期宿主菌濃度，計算裂解量為3.7×109/1×107=370 PFU · cell-1。

圖2 噬菌體vB_EcoP_E21一步生長曲線Fig.2 One-step growth curve of phage vB_EcoP_E21

2.5 噬菌體溫度和pH敏感性測定

由圖3可知，噬菌體vB_EcoP_E21對溫度有較強穩(wěn)定性，40、50和60℃作用120 min效價基本保持穩(wěn)定，70℃作用40 min后，效價開始下降，80℃作用40 min后，效價急劇下降，120 min時達到最低4.63 log PFU·mL-1；噬菌體vB_EcoP_E21在pH 4～10范圍內(nèi)保持較高效價，當pH為2或12時，效價為0。

圖3 噬菌體vB_EcoP_E21對溫度（A）和pH（B）耐受性Fig.3 Temperature(A)and pH(B)tolerance of phage vB_EcoP_E21

2.6 噬菌體氯仿敏感性

由表2可知，氯仿處理前噬菌體效價為（9.84±0.05）log PFU·mL-1，處理后為（9.83±0.03）log PFU·mL-1。氯仿對噬菌體效價無明顯影響，說明噬菌體vB_EcoP_E21衣殼或尾絲中不含脂類物質(zhì)，對氯仿不敏感，后續(xù)試驗操作中可加入氯仿處理。

2.7 噬菌體宿主譜測定

由表2可知，噬菌體vB_EcoP_E21裂解譜較廣，對試驗所選大腸桿菌有裂解作用，但對產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌10668、志賀氏菌屬、沙門氏菌屬及變形桿菌屬的菌株無裂解作用。

表2 噬菌體vB_EcoP_E21裂解譜Table 2 Host range of phage vB_EcoP_E21

2.8 噬菌體全基因組分析

2.8.1 噬菌體全基因組概況

噬菌體vB_EcoP_E21基因組為線性雙鏈DNA，GeneBank登錄號為MN604053。基因組長度為58 536 bp，（G+C）%含量為46.89%，基因組A、G、T和C堿基含量分別為25.13%、22.33%、24.56%和27.98%。通過與Rfam數(shù)據(jù)庫比對[10]，非編碼RNA（ncRNA）為0，利用tRNAscan-SE在線軟件預(yù)測，未檢測到tRNA。未預(yù)測出已知相關(guān)抗生素耐藥基因和毒力因子，表明噬菌體基因組安全性。

該基因組有66個開放閱讀框，其中有23個為功能編碼序列（Coding sequence,CDS），開放閱讀框總長度51 627 bp，ORFs密度為1.128 Genes/kb，開放閱讀框平均GC含量47.29%。根據(jù)基因不同功能可將已知功能基因分為4類，分別為噬菌體結(jié)構(gòu)和包裝基因、DNA復(fù)制及調(diào)控基因、宿主裂解功能基因及其他功能。功能編碼序列注釋與對比分析見表3。

表3 噬菌體vB_EcoP_E21蛋白功能預(yù)測Table 3 Predicted protein function of phage vB_EcoP_E21

其中與噬菌體結(jié)構(gòu)和包裝功能相關(guān)的基因有頭尾交聯(lián)蛋白（ORF1），終末端大、小亞基（ORF2和3），結(jié)構(gòu)域蛋白（ORF4和5），尾部蛋白（ORF48、49、50、51、52和53），卷尺蛋白（ORF54），結(jié)構(gòu)蛋白（ORF56）和衣殼蛋白（ORF61）；與DNA復(fù)制及調(diào)控相關(guān)基因有DNA聚合酶Ⅰ（ORF6），引物酶（ORF11），重組酶（ORF29），轉(zhuǎn)移酶（ORF35），修飾蛋白（ORF62）及其他蛋白酶（ORF63和64）；與噬菌體裂解相關(guān)有裂解酶A和B（ORF41和42），但未預(yù)測到穿孔素蛋白序列。

2.8.2 同源進化樹

為了解噬菌體vB_EcoP_E21與其他噬菌體之間進化關(guān)系，選用噬菌體保守基因且具有進化意義末端酶大亞基（ORF2）和衣殼蛋白（ORF63）氨基酸序列，采用MEGA軟件Neighbor-joining方法構(gòu)建同源進化樹（見圖4和5）。由圖4可知，噬菌體vB_EcoP_E21與變形桿菌噬菌體P16-2532、PM87和pPM 01親緣關(guān)系較近，由圖5可知，與變形桿菌噬菌體pPM 01和Saba親緣關(guān)系較近，與大腸桿菌噬菌體lambda、T4、T1、T5和T7等親緣關(guān)系較遠，變形桿菌噬菌體P16-2532、PM87、pPM 01和Saba均屬于長尾噬菌體科（Siphoviridae），而噬菌體vB_EcoP_E21屬于短尾噬菌體，說明vB_EcoP_E21是一株新型產(chǎn)腸毒素大腸桿菌噬菌體。

2.8.3 噬菌體vB_EcoP_E21全基因圖譜

采用在線軟件CGView Server繪制噬菌體vB_EcoP_E21環(huán)狀全基因圖譜（見圖6），功能基因分別用噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白（藍色），宿主裂解（紅色），DNA裝配與復(fù)制（綠色）及假定蛋白（灰色）表示。

圖4 基于噬菌體vB_EcoP_E21末端酶大亞基構(gòu)建同源進化樹Fig.4 Based on the terminase large subunit protein showing the neighbor-joining phylogenetic tree of phage vB_EcoP_E21

圖5 基于噬菌體vB_EcoP_E21主要衣殼蛋白構(gòu)建同源進化樹Fig.5 Based on the major capsid protein showing the neighbor-joining phylogenetic tree of phage vB_EcoP_E21

3 討論與結(jié)論

養(yǎng)殖場污水是目前分離動物致病菌噬菌體最佳來源，尤其是曾發(fā)生過宿主菌感染的養(yǎng)殖場，噬菌體分離成功率更高[11]。研究表明，噬菌體在污水中分離成功率（23.8%）高于糞便（2.7%），溫暖季節(jié)（6～8月）分離成功率（32.1%）高于寒冷季節(jié)（未分離出）[12]。本研究在養(yǎng)殖場污水中分離一株裂解性噬菌體vB_EcoP_E21，根據(jù)透射電鏡觀察其頭部直徑約為50 nm，尾部長度約為10 nm，符合短尾噬菌體特點。短尾噬菌體（14%）、長尾噬菌體（61%）和肌尾噬菌體（25%）共同構(gòu)成有尾噬菌體目，絕大多數(shù)噬菌體（96%）均屬于有尾噬菌體。一般來說，所選宿主菌和噬菌體來源不同，可分離篩選出不同噬菌體。付麗娜以豬源ETEC為宿主菌，在大連養(yǎng)殖場污水中分離出2株長尾裂解性噬菌體[13]；周艷等以禽源ETEC為宿主，分離出一株肌尾T4樣裂解性噬菌體[14]。

噬菌體宿主特異性主要取決于其尾部專一性結(jié)合蛋白與細菌表面受體的結(jié)合，宿主菌細胞壁、莢膜、菌毛或鞭毛上存在特異性受體，這些受體以蛋白質(zhì)、多糖或脂多糖形式存在，受體在細胞表面分布、密度對噬菌體特異性和裂解譜發(fā)揮重要作用。本研究噬菌體vB_EcoP_E21可裂解養(yǎng)殖場分離的大腸桿菌（6、8、11、F1、F2和13）臨床分離株及大腸桿菌O157、12588和236等標準菌株，但對STEC 10668、志賀氏菌屬、沙門氏菌屬及變形桿菌屬菌株無裂解作用，說明該噬菌體對大腸桿菌具有較寬裂解譜，同時也具有較強宿主專一性。

噬菌體和宿主菌濃度對噬菌體發(fā)揮裂解作用有重要影響。本研究中，噬菌體vB_EcoP_E21的OMOI為0.1，表明噬菌體在裂解細菌時所需數(shù)量較少，且實際應(yīng)用中較低MOI會降低純化及應(yīng)用成本。一步生長曲線可揭示噬菌體在感染宿主菌時活動規(guī)律，還可計算潛伏期、爆發(fā)期、裂解量等參數(shù)，噬菌體vB_EcoP_E21潛伏期和爆發(fā)期均為20 min，裂解量為370 PFU·cell-1，表明該噬菌體與宿主菌吸附直至下一代噬菌體合成所需時間較短，增殖效率高。目前報道大腸桿菌噬菌體潛伏期為10～30 min，爆發(fā)期60～120 min，裂解量研究結(jié)果差異較大[15-17]。

噬菌體吸附宿主菌過程極易受外界因素影響，尤其是以水、空氣、飼料等為媒介的復(fù)雜養(yǎng)殖環(huán)境。因此，研究噬菌體對環(huán)境溫度及pH穩(wěn)定性具有重要意義。大多數(shù)研究表明，噬菌體吸附最佳溫度為30～45℃，當溫度超過50℃，吸附受到抑制，也有研究結(jié)果顯示，革蘭氏陽性菌噬菌體特異性受體為細胞表面糖類，溫度較低時也可吸附。本研究分離噬菌體vB_EcoP_E21對溫度有較強穩(wěn)定性，溫度40～60℃活性基本保持穩(wěn)定，當溫度達70℃以上時，活性受到抑制。由于在酸性環(huán)境下蛋白質(zhì)易變性，噬菌體活性受到抑制，斷奶仔豬采食前胃pH 1～2，采食后快速升至4～5，要求噬菌體具有較高酸度耐受性。目前大多數(shù)研究表明，噬菌體最佳pH為5～7，而且大多數(shù)噬菌體可耐受pH 3～4或8～9，當pH 1～2或高于10時噬菌體失活[12]，本文結(jié)果與上述研究一致，在pH 4～10內(nèi)噬菌體活性保持不變，當pH為2或12時，噬菌體失活[12,18-19]。

在噬菌體濃縮或純化時，需加入氯仿去除細菌碎片等雜質(zhì)，某些噬菌體衣殼或尾絲中含有脂類物質(zhì)，氯仿脂溶性破壞噬菌體結(jié)構(gòu)，影響噬菌體活性。本研究分離噬菌體在氯仿處理前后效價無顯著差異，說明噬菌體vB_EcoP_E21衣殼或尾絲中不含脂類物質(zhì)，后續(xù)提取基因組試驗操作可加入氯仿處理。

相對于細菌而言，噬菌體全基因組較小，且結(jié)構(gòu)簡單。截至2020年3月，NCBI上公開噬菌體基因組完整序列近33 000條（www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/browse#!/overview/），其中大腸桿菌噬菌體833條，這些基因組序列長度集中在3.4～316 kb。噬菌體vB_EcoP_E21全基因組長度為58 536 bp，（G+C）%含量為46.89%，無明顯GC偏向性，非編碼RNA為0，不含tRNA，無相關(guān)抗生素耐藥基因和毒力因子，代表該噬菌體在基因水平上的安全性。該噬菌體基因組有66個開放閱讀框（ORFs），其中23個（占34.8%）為已知功能編碼序列（CDS），其余均為未知功能假定蛋白（占65.2%），說明該噬菌體大部分基因組序列功能尚不清楚。通過噬菌體CDS序列比對分析，可將功能基因分為3部分，分別為噬菌體結(jié)構(gòu)和包裝基因、DNA復(fù)制及調(diào)控基因與宿主裂解功能基因。其中與噬菌體結(jié)構(gòu)和包裝功能相關(guān)基因有頭尾連接蛋白，結(jié)構(gòu)域蛋白，尾絲蛋白，卷尺蛋白，結(jié)構(gòu)蛋白和衣殼蛋白等。噬菌體吸附主要發(fā)生在尾部特有結(jié)合蛋白與細菌表面特殊受體結(jié)合，本研究預(yù)測6個尾絲蛋白序列；噬菌體末端酶是由大、小亞基組成的異源寡聚體，編碼大、小亞基的基因序列通常為相鄰或為重疊基因，在噬菌體包裝過程中發(fā)揮重要作用[20]，末端酶大亞基是多功能酶，可特異性結(jié)合噬菌體衣殼孔蛋白、金屬離子和ATP，在溶液中以單體形式存在，具有ATP酶、核酸內(nèi)切酶和DNA解旋酶活性[21]；小亞基可特異性識別與結(jié)合噬菌體核酸及ATP，在溶液中以寡聚體形式存在并呈雙層環(huán)狀排列，末端酶、噬菌體DNA及門蛋白共同構(gòu)成噬菌體包裝機制，在包裝過程中相互協(xié)調(diào)，缺一不可[20]。本研究預(yù)測末端酶大、小亞基為相鄰基因編碼序列，其中大亞基由675個氨基酸組成，小亞基由194個氨基酸組成，但未預(yù)測到門蛋白序列；衣殼蛋白不僅保護噬菌體本身遺傳信息的傳遞，且在噬菌體組裝、感染等過程發(fā)揮重要作用，預(yù)測該噬菌體的衣殼蛋白由355個氨基酸組成。

有尾噬菌體可在復(fù)制晚期誘導宿主菌編碼合成裂解酶，用于水解細胞壁肽聚糖層，但大部分噬菌體裂解酶由于缺少信號肽而無法穿透細胞膜，需穿孔素協(xié)同作用裂解宿主菌，形成穿孔素/裂解酶體系。穿孔素是一種在侵染晚期階段合成的小分子極性跨膜蛋白，可在細胞膜上形成穩(wěn)定跨膜孔，裂解酶可通過跨膜孔達到細胞壁水解肽聚糖層，達到釋放子代噬菌體目的，該噬菌體預(yù)測出兩個裂解酶基因，分別由234和104個氨基酸組成，但未預(yù)測出穿孔素蛋白序列，其作用機理需深入研究。

為進一步說明噬菌體進化關(guān)系，選用噬菌體保守且具有進化意義序列如末端酶大亞基、主要衣殼蛋白或尾絲蛋白構(gòu)建同源進化樹，本研究選用末端酶大亞基和主要衣殼蛋白序列構(gòu)建同源進化樹，且比較全基因組序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)噬菌體vB_EcoP_E21與變形桿菌噬菌體Proteus phage P16-2532、PM87、pPM 01和Saba親緣關(guān)系較近，與大腸桿菌噬菌體lambda、T4、T1、T5和T7等親緣關(guān)系較遠，且變形桿菌噬菌體P16-2532、PM87、pPM 01和Saba均屬于長尾噬菌體科，從宿主譜中也可見噬菌體vB_EcoP_E21無法侵染變形桿菌標準菌株，需進一步鑒定并開展機制機理研究。

與傳統(tǒng)抗生素相比，噬菌體療法存在特異性強、增殖能力強、研發(fā)周期短及成本低等優(yōu)勢，但實際應(yīng)用存在一定局限性，如噬菌體裂解譜較窄、缺乏安全高效給藥方式、難以確定最佳劑量等，因此深入研究噬菌體劑型、給藥途徑、安全性等問題是今后研究重點。本研究已對分離ETEC噬菌體作生物學特性和全基因組分析，將繼續(xù)在動物應(yīng)用、劑型選擇及安全性等方面開展研究，使噬菌體成為理想抗生素替代品，在防控動物細菌性感染方面發(fā)揮作用。