利用2型重組腺相關(guān)病毒抑制子宮腔上皮Plekhs1基因表達對小鼠生育能力的影響

馬興紅，張其法，姜 南，李世杰，王一妹

（東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱 150030）

在體靶向基因功能研究是生命科學領(lǐng)域新策略，其中病毒載體作為安全、有效基因治療工具受到關(guān)注。主流病毒載體包括：腺病毒（Adenovi?rus）、慢病毒（Lentivirus）、腺相關(guān)病毒（AAV，Ad?enovirus associated virus）[1]。腺相關(guān)病毒相比其他病毒具有免疫原性低、病毒顆粒小、滴度高、血清型多、安全性高、表達穩(wěn)定等優(yōu)點，是最具潛力基因轉(zhuǎn)導(dǎo)工具[2]。rAAV載體在各類疾病研究領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[3]。2013年，歐洲藥品管理局（EMA）批準首個腺相關(guān)病毒基因藥物用于治療遺傳性代謝疾病[4]。子宮作為哺乳動物雌性生殖器官重要組成，是胚胎著床和胎兒發(fā)育重要場所，研究不同發(fā)育階段子宮基因功能具有重要意義[5]。探尋在體靶向子宮特定基因研究有效途徑尤為必要。

決定AAV介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移效率關(guān)鍵因素為病毒載體對靶細胞轉(zhuǎn)染程度，其中注射方式為組織細胞中轉(zhuǎn)染效率決定因素，主要包括靜脈注射、腹腔注射及定點注射等[6-7]。靜脈注射和腹腔注射操作簡單、組織損傷較??；AAV具有器官靶向性，但也分布于非靶器官，因此非靶器官基因改變可能影響基因在特定組織或細胞類型功能。同時AAV血清型較多，篩選特異性侵染靶器官血清型工作量大。BALB/c小鼠尾靜脈注射血清型1、5、6、8AAV發(fā)現(xiàn)，AAV1和AAV8在卵巢子宮中轉(zhuǎn)染效率高，AAV5在卵巢中無分布[8]。以AAV8為載體治療大鼠純合性家族高膽固醇血癥時發(fā)現(xiàn)，AAV8在雌性雄性性腺中均有表達，但分布較少[9]，表明靜脈注射存在不確定性。定點注射可在預(yù)定時間和生理狀態(tài)下在組織細胞中條件性表達基因，增加載體在靶器官分布量，提高轉(zhuǎn)染效率，但操作技術(shù)難度高，損傷組織。

借鑒腺病毒子宮角注射小鼠子宮研究經(jīng)驗，腺病毒在子宮內(nèi)特異性感染腔上皮組織，但上皮基底膜作為屏障阻止病毒顆粒侵染基質(zhì)細胞[10]。研究發(fā)現(xiàn)子宮上皮特異性表達基因Plekhs1與子宮接受態(tài)轉(zhuǎn)變密切相關(guān)，當子宮處于中性狀態(tài)時Plekhs1高表達，處于非接受態(tài)時Plekhs1不表達[11]。因此，本研究構(gòu)建包裝可沉默Plekhs1表達2型重組腺相關(guān)病毒（rAAV2-PL3），通過子宮角直接注射方法研究腺相關(guān)病毒在子宮組織中表達規(guī)律及干擾Plekhs1表達對小鼠生育能力影響，探索子宮細胞中條件性沉默特定基因可行性方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料

8周齡性成熟昆明小鼠（體重18～22 g），購自哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院實驗動物中心。病毒載體質(zhì)粒AAV.U6.ShRLuc（AAV2）和輔助質(zhì)粒pAAV 2.9、pAdDeltaF6均由蘇州大學心血管病研究所胡士軍教授饋贈。

1.1.2 試驗動物模型

①rAAV2-PL3在小鼠子宮表達規(guī)律試驗：試驗組，30只8周齡雌鼠隨機分為5組，通過手術(shù)于兩側(cè)子宮角注射20 μL rAAV2-PL3，分別在5 d、2、4、6、8周采集子宮組織；對照組6只成年雌鼠注射20 μL PBS（陰性對照）。

②rAAV2-PL3/SCR干擾Plekhs1表達及對生殖影響試驗：24只8周齡雌鼠隨機分為2組，試驗組通過手術(shù)從兩側(cè)子宮角注射20 μL rAAV2-PL3，對照組注射等體積rAAV2-SCR（空白對照）；病毒注射兩周后與昆明雄鼠合籠，隔夜發(fā)現(xiàn)栓塊后單獨飼養(yǎng)，見栓第4天每組隨機取6只小鼠，采集子宮組織；每組剩余6只小鼠，繼續(xù)飼養(yǎng)直至產(chǎn)仔，記錄小鼠產(chǎn)仔數(shù)。

1.2 方法

1.2.1 rAAV2載體構(gòu)建

在NCBI搜索小鼠Plekhs1基因轉(zhuǎn)錄本序列（NM_172641.3:80-1504）；通過 thermofisher shR?NA設(shè)計網(wǎng)站設(shè)計5組Plekhs1 shRNA序列（見表1），送上海生工生物公司合成。MluⅠ、Bam HⅠ核酸內(nèi)切酶雙酶切AAV2質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳膠回收；合成shRNA片段退火；T4連接酶載體重新連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞，挑取單菌落送上海生工生物公司測序。

1.2.2 rAAV2制備

293T細胞接種150 mm培養(yǎng)皿中，細胞密度80%，10 mL 10%FBS DMEM/F12培養(yǎng)基；12 h后開始轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染體系：rAAV 12 μg、pAAV2.9 10 μg、pAdDeltaF6 6 μg、Opti培養(yǎng)基 600 μL、PEI（1 mg·mL-1）110 μL，6～8 h更換培養(yǎng)基；5%CO2、37℃，培養(yǎng)72 h后收集病毒（見圖1D）。添加培養(yǎng)基1/80體積 0.5 mol·L-1EDTA（pH 8.0）消化細胞，收集細胞轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，4℃2 000 g 10 min；去除上清液，將細胞轉(zhuǎn)移至同1支離心管中，4℃2 000 g 5 min，去上清液；2 mL HBSS緩沖液吹散細胞，渦旋震蕩2 min；液氮和37℃水浴鍋快速凍融3次，每循環(huán)約10 min；4℃，5 000～7 000 g，10 min；使用Millex-HV（0.45 μm）過濾上清；上清轉(zhuǎn)移至Amicon ultra-15（100 ku）濾器中，2 000 g，15℃，5 min，離心濃縮到合適體積（約200 μL）分裝，-80℃保存。

表1 Plekhs1基因shRNA序列Table 1 shRNA sequence of Plekhs1 genes

1.2.3 rAAV2子宮角注射

8周齡性成熟雌鼠，腹腔注射200 μL鹽酸賽拉嗪；麻醉后子宮角注射20 μL rAAV2-PL3，手術(shù)后連續(xù)1周腹腔注射10 000單位雙抗。

1.2.4 綠色熒光成像檢測

子宮冰凍切片（7 μm），55℃展片10～15 s；轉(zhuǎn)移至4%多聚甲醛（PFA），暗環(huán)境固定1 h；1×PBS清洗3次，每次5 min；DAPI染色10 s，1×PBS清洗2次，每次5 min；抗熒光猝滅劑封片，避光放置，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5 免疫組織化學檢測

石蠟組織切片烘箱（60℃）烘片；脫蠟進水處理；檸檬酸鈉修復(fù)液中抗原修復(fù)，3%H2O2處理；濕盒內(nèi)10%馬血清封閉；10%馬血清稀釋一抗孵育（Plekhs1(P-15)，1∶100稀釋）（GFP，1∶200稀釋）；二抗孵育（山羊抗兔IgG，1∶200），DAB顯色，蘇木精復(fù)染，稀鹽酸分色，氨水反藍；乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察。

1.2.6 小鼠子宮內(nèi)膜上皮原代細胞分離培養(yǎng)

發(fā)情期小鼠，取出子宮清洗干凈后翻轉(zhuǎn)子宮；子宮組織轉(zhuǎn)移至0.2%胰酶消化液中：4℃1 h，室溫60 min，37℃水浴30 min；終止消化，以105細胞密度接種至培養(yǎng)皿35 mm中；37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)20～30 min，未貼壁細胞懸液轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)皿（35 mm）中，去除基質(zhì)細胞。

1.2.7 RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄、Real-time PCR

TRIzol法提取總RNA，Nano Drop 2000c測RNA濃度；promega GoScript? Reverse Transcrip?tion Mix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄；real-time PCR使用TaKaRa試劑盒TB Green?Premix Ex Taq，Plekhs1引物序列：Forward Primer-GTTCAAGTGCCACCCA?GATG，Reverse Primer-TTCTCCTGTCATGGCCAAT；GAPDH引物序列：Forward Primer-GCCTTCCGT?GTTCCTACCC Reverse Primer-ACCTTTGGGCTTAC TCCA。PCR 在 Amplied Biosystems?7300 Real-Time PCR System儀器中反應(yīng)，以GAPDH基因為內(nèi)參，以 2-ΔΔCT作數(shù)據(jù)分析。

1.2.8 統(tǒng)計分析

GraphPad Prism 5.0軟件繪圖并分析數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)用Mean±SEM表示，組間比較采用Student's t檢驗，檢驗水準（α）為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 rAAV2載體構(gòu)建及病毒包裝

AAV2病毒基因組質(zhì)粒載體見圖1 A，合成shR?NA片段（見表1）插入Bam HⅠ、MluⅠ酶切位點之間，shRNA由U6啟動子啟動，載體上有外源插入EGFP組件。質(zhì)粒雙酶切后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定獲得約5 000 bp條帶，參照陰性對照，酶切結(jié)果符合預(yù)期結(jié)果（見圖1B）；T4連接酶將酶切載體與退火合成shRNA片段重新連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細胞，挑取單菌落送上海生工生物公司測序，測序結(jié)果與設(shè)計shRNA序列一致（見圖1C），重組載體構(gòu)建成功，載體重新命名為rAAV2-GFP-shRNA-Plekhs1；rAAV2-GFP-shRNA-scramble；重組病毒質(zhì)粒與兩個輔助質(zhì)粒通過PEI轉(zhuǎn)染試劑共轉(zhuǎn)染293T細胞中，轉(zhuǎn)染48 h后熒光顯微鏡觀察（見圖1 D），293T細胞狀態(tài)良好，EGFP在細胞中高表達，說明病毒基因組質(zhì)粒在細胞中表達。

圖1 rAAV2載體構(gòu)建及病毒包裝Fig.1 rAAV2 vector construction and virus packaging

2.2 rAAV2侵染小鼠子宮上皮原代細胞

rAAV2侵染小鼠子宮內(nèi)膜上皮原代細胞，48 h后熒光顯微鏡觀察細胞侵染率達100%（見圖2A、B），結(jié)果表明2型腺相關(guān)病毒可有效侵染小鼠子宮內(nèi)膜上皮細胞；Real-time PCR檢測各組rAAV2沉默Plekhs1基因表達效果，每組cDNA樣品3組平行樣，其中rAAV2-PL3沉默效果顯著（見圖2C），制備高濃度rAAV2-PL3用于在體注射試驗。

圖2 rAAV2介導(dǎo)的Plekhs1 shRNA抑制Plekhs1基因表達Fig.2 Plekhs1-shRNA mediated by rAAV2 inhibits Plekhs1 gene expression

2.3 探究rAAV2-PL3注射小鼠子宮表達規(guī)律

小鼠子宮角注射rAAV2-PL3，不同時間點觀察病毒侵染效果，通過熒光檢測、EGFP基因免疫組化檢測（見圖3）發(fā)現(xiàn)隨侵染時間延長，EGFP信號持續(xù)增強，信號主要在腔上皮和腺上皮細胞中表達，陰性對照注射同體積PBS，子宮組織中無EGFP信號出現(xiàn)，子宮角注射病毒5 d即可檢測到EGFP信號，轉(zhuǎn)染6周信號最強，8周仍可檢測到較強表達信號。

2.4 rAAV2-PL3沉默Plekhs1基因表達

由圖4可知，通過免疫組化試驗檢測發(fā)現(xiàn)，注射PBS陰性對照組見栓第4天小鼠子宮組織中EGFP不表達，Plekhs1在上皮細胞中表達（見圖4A、C）；注射rAAV2-PL3見栓第4天小鼠子宮中EGFP表達，Plekhs1不表達（見圖4B、D）；通過Real-time PCR技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)注射rAAV2-PL3小鼠子宮比注射rAAV2-SCR小鼠Plekhs1表達明顯降低（見圖4E），表明Plekhs1被成功在體內(nèi)抑制。

2.5 注射rAAV2-PL3后產(chǎn)仔數(shù)統(tǒng)計

小鼠子宮角注射rAAV2-PL3 2周后，與正常雄鼠交配，隔天早上檢查陰道栓，見栓21 d后統(tǒng)計小鼠出生情況。由表2可知，注射rAAV2-PL3試驗組小鼠產(chǎn)仔數(shù)分別為3、6、6、7、5只；注射rAAV2-SCR對照組小鼠產(chǎn)仔數(shù)分別為12、11、12、10、11只；可見試驗組比對照組產(chǎn)仔數(shù)減少，說明干擾Plekhs1對生殖有較大影響。F1代小鼠生育情況統(tǒng)計學分析，注射rAAV2-PL3小鼠產(chǎn)仔數(shù)明顯減少（P＜0.05）（見圖5）。

圖3 rAAV2-PL3病毒侵染小鼠子宮EGFP表達規(guī)律Fig.3 Expression pattern of EGFP in mouse uterus infected by rAAV2-PL3 virus

圖4 rAAV2-PL3沉默子宮上皮Plekhs1表達Fig.4 rAAV2-PL3 silences uterine epithelial Plekhs1 expression

表2 子宮腔注射rAAV2-PL3/SCR病毒小鼠，F(xiàn)1代生育統(tǒng)計Table 2 Uterine cavity injection virus mice,fertility statistics of F1generation

圖5 F1代生育情況統(tǒng)計分析Fig.5 F1generation statistical analysis of fertility

3討 論

隨著基因工程技術(shù)快速發(fā)展，條件性基因敲除鼠成為研究某一基因在體內(nèi)功能重要方法，但制作條件性基因敲除鼠費時費力[12]。腺相關(guān)病毒作為最有潛力基因治療載體可在多種組織中穩(wěn)定表達外源基因，感染分裂細胞和非分裂細胞，在體內(nèi)長期表達且對人體無致病性，因此AAV為一種安全病毒載體[13]。腺相關(guān)病毒在子宮基因功能應(yīng)用目前尚無報道。

3.1 重組腺相關(guān)病毒制備及沉默Plekhs1效果篩選

RNAi特異性沉默基因表達，廣泛應(yīng)用于基因功能研究領(lǐng)域。將雙鏈小干擾RNA(siRNA)高效傳遞至體內(nèi)靶細胞是RNAi成功用于疾病治療的關(guān)鍵。腺相關(guān)病毒載體介導(dǎo)RNAi成功解決這一難題，同時有效解決RNAi轉(zhuǎn)染效率低、轉(zhuǎn)基因表達時間短、成本高等問題[14]。Wakimoto等將AAV-shRNA應(yīng)用于小鼠心臟疾病研究[15]。Plekhs1為小鼠子宮上皮特異性表達基因，與子宮接受態(tài)轉(zhuǎn)化密切相關(guān)[11]。本研究針對Plekhs1 mRNA設(shè)計shRNA序列，成功構(gòu)建、包裝rAAV2病毒；侵染小鼠子宮內(nèi)膜上皮原代細胞，Real-time PCR篩選沉默效果最強rAAV2-PL3病毒。

3.2 檢測子宮角注射rAAV2-PL3表達規(guī)律

注射方式為腺相關(guān)病毒介導(dǎo)基因在靶細胞轉(zhuǎn)染效率關(guān)鍵因素。心血管疾病研究發(fā)現(xiàn)，尾靜脈注射AAV9對心臟組織有較強感染能力，同時在腦組織、肺組織、肝臟組織也有較強感染能力，影響試驗結(jié)果，王惠等通過心肌層注射方法增加病毒在心臟組織分布并長期表達[16]。Chen等靜脈注射AAV在子宮表達量低，表達時間短，難以滿足試驗需要[9]。本研究首先驗證腺相關(guān)病毒rAAV2-PL3直接子宮角注射有利于條件性靶向轉(zhuǎn)染子宮細胞。通過熒光檢測、免疫組化技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染第5天在腔上皮檢測到EGFP信號，轉(zhuǎn)染6周時信號最佳，隨著轉(zhuǎn)染時間延長EGFP信號不斷增強，累積效果明顯，信號顯示范圍擴大。值得注意的是，病毒侵染信號主要集中在腔上皮和腺上皮細胞，上皮結(jié)構(gòu)完整，表明上皮基底膜細胞可作為屏障阻止病毒顆粒侵染基質(zhì)細胞[10]。

3.3 rAAV2-PL3沉默子宮上皮Plekhs1表達及對生育影響

馬珍子等研究發(fā)現(xiàn)正常妊娠過程中見栓第4天腔上皮細胞PLEKHS1高表達[11]，本研究通過免疫組化技術(shù)檢測rAAV2-PL3感染小鼠見栓第4天子宮細胞Plekhs1表達，發(fā)現(xiàn)小鼠子宮腔上皮細胞Plekhs1蛋白表達明顯減弱；通過Real-time PCR進一步驗證Plekhs1已被沉默。研究人員檢測AAV侵染后的生殖細胞及子代體內(nèi)病毒基因表達，研究腺相關(guān)病毒在生殖系統(tǒng)應(yīng)用是否存在安全問題。Calcedo等發(fā)現(xiàn)在新生兒體內(nèi)即可檢測到AAV抗體，野生型AAV侵染人體是必然事件[17]；Couto等利用AAV2侵染小鼠成熟精子，人工受精后胚胎移植，在后代中未檢測到AAV2基因表達，表明AAV2無法整合于生殖細胞[18]。本研究子宮角注射對照病毒rAAV2-SCR，小鼠產(chǎn)仔數(shù)量未受影響，表明子宮角注射腺相關(guān)病毒方法對子宮功能無影響。為驗證rAAV2-PL3沉默Plekhs1表達是否對小鼠生育能力造成影響，統(tǒng)計注射rAAV2-PL3與對照病毒rAAV2-SCR小鼠產(chǎn)仔數(shù)，分析發(fā)現(xiàn)注射rAAV2-PL3小鼠產(chǎn)仔量比對照組減少約50%。結(jié)果表明，沉默Plekhs1表達降低生育能力，Plekhs1在妊娠過程中發(fā)揮重要作用。

綜上，腺相關(guān)病毒介導(dǎo)shRNA通過子宮角注射是實現(xiàn)子宮特定基因條件性干擾的可行方法，有助于研究妊娠過程子宮基因潛在功能。但因腺相關(guān)病毒無法突破阻礙進入子宮基質(zhì)，研究子宮基質(zhì)細胞基因功能的方法需進一步完善。