實時熒光定量PCR結合探針檢測MP的臨床價值及MP耐藥情況分析

杜金龍， 馮 燕， 李恒濤

（1.上海市奉賢區(qū)奉城醫(yī)院檢驗科，上海 201411；2.上海市奉賢區(qū)奉城醫(yī)院兒科，上海 201411）

肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae，MP）感染可發(fā)生在不同年齡段兒童，據(jù)相關流行病學研究報道，MP年感染發(fā)生率為10.6%～67.6%，是兒童急性上、下呼吸道感染的病原體之一[1]。目前臨床常用大環(huán)內酯類抗菌藥物（如阿奇霉素）對兒童MP感染進行治療，但臨床報道MP對此類抗菌藥物的耐藥性呈階梯式增高。早期準確診斷對減少抗菌藥物濫用及降低患兒病死率有著重要意義[2]。目前MP感染診斷主要依靠實驗室MP培養(yǎng)，但是MP培養(yǎng)不僅技術要求高、耗時長而且陽性率低，在臨床早期診斷中應用受限[3]。近年來，MP核酸檢測[實時熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）]在臨床上應用的報道越來越多，而核酸擴增技術對提高病原檢出率有著積極作用，但因MP-DNA序列突變所致的對大環(huán)內酯類抗菌藥物的耐藥現(xiàn)象愈發(fā)嚴重[4]。因此，有必要對MP耐藥突變開展核酸鑒定。本研究評價實時熒光定量PCR技術結合探針檢測MP-DNA及耐藥突變位點的方法對MP感染診斷的準確性，并分析相關影響因素及耐藥突變率，為臨床早期診斷與目標用藥提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取上海市奉賢區(qū)奉城醫(yī)院兒科2017年9月—2019年8月收治入院的70例MP感染患兒作為MP組，選取同期入院的30例非MP感染患兒作為對照組。此次研究在上海市奉賢區(qū)奉城醫(yī)院倫理委員會指導下開展，入組患兒家長均簽署知情同意書。

1.2 納入標準與排除標準

1.2.1 納入標準 （1）MP感染兒童納入標準。均符合《兒童肺炎支原體肺炎診治專家共識》（2015年版）[5]中相關診斷標準；以發(fā)熱、咳嗽為主要癥狀，且多為陣發(fā)性干咳；胸X線檢查結果可見肺實質陰影、肺門淋巴結腫大或全肺野彌漫性陰影等；單份血清標本MP-IgM抗體滴度≥1∶160，或急性期及恢復期（間隔2～4周）血清標本抗體滴度呈4倍或4倍以上變化（升高或降低）；未合并其他病原體感染。（2）對照組患兒納入標準。經臨床胸X線檢查與癥狀診斷，排除MP感染的其他類型肺炎；單份血清標本抗體滴度≤1∶80；其肺炎類型均能檢測出確切的病原體。

1.2.2 排除標準 （1）MP感染患兒排除標準。因反復呼吸道感染入院；合并免疫缺陷性疾??；經實驗室檢測合并病毒或細菌感染；結核病患兒。（2）對照組患兒排除標準。合并免疫缺陷性疾??；排除MP感染但病原體不明。

1.3 患兒治療與基本資料采集

采集入組患兒的性別、年齡、入院時病程、入院前大環(huán)內酯類抗菌藥物治療史以及治療4周內單份/雙份血清抗體滴度等臨床資料，進行定義與分組：（1）長病程組。入院時病程超過7 d患兒；（2）短病程組。入院時病程在7 d及以內患兒；（3）完成1個療程組。入院前已接受阿奇霉素治療，單次給藥10 mg/（kg·d），首劑加倍，規(guī)律服藥＞3 d，末次服藥距首次服藥時間滿5 d，或連續(xù)服用其他大環(huán)內酯類抗菌藥物（如紅霉素）推薦劑量滿5 d患兒；（4）未完成1個療程組。口服阿奇霉素或其他大環(huán)內酯類抗菌藥物不足1個療程患兒；（5）未服用組。未服用大環(huán)內酯類抗菌藥物治療患兒；（6）雙份血清4倍變化組。治療期間急性期及恢復期血清抗體滴度呈4倍或4倍以上變化（增高或降低）患兒；（7）單份血清變化組。治療期間單份血清標本抗體滴度≥1∶160，未出現(xiàn)雙份血清滴度變化患兒。

1.4 方法

1.4.1 MP核酸檢測 采集患兒入院12 h內咽拭子標本，置于無菌玻璃管，采用0.9%氯化鈉溶液進行樣本處理，保存于-20 ℃待測。采用MP核酸及耐藥突變位點檢測試劑盒（實時熒光定量PCR）（杭州美聯(lián)生物科技有限公司）進行MP基因組DNA提取與檢測。采用ABI 7500實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司）進行擴增，擴增條件：50℃ 2 min，95 ℃ 2 min；91℃15 s，64℃ l min，40個循環(huán)。MP核酸及耐藥突變位點檢測試劑盒采用VIC、FAM與CY5這3種熒光進行實驗，其中VIC信號指示MP，F(xiàn)AM信號指示23SrRNA2063位點或2064位點A：G突變，CY5信號指示內標。當待測樣本FAM信號循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct）＜35.33、VIC信號Ct＜35.01時指示MP檢測陽性且發(fā)生A2063G和/或A2064G耐藥突變；當待測樣本FAM信號Ct≥35.33、VIC信號Ct＜35.01時指示MP檢測陽性但未發(fā)生A2063G或A2064G耐藥突變；當待檢測樣本VIC信號Ct＞35.01時判定為陰性。

1.4.2 MP-IgM抗體檢測 抽取患者靜脈血2 mL并分離血清，使用人肺炎支原體抗體IgM（MPIgM）酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測試劑盒[艾柏森（北京）生物科技有限公司]進行MP-IgM抗體檢測，檢測過程嚴格按照試劑盒檢測說明書進行。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，其中計數(shù)資料以[例（百分比）]表示，組間陽性率比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 患兒基本資料

根據(jù)本研究納入標準，MP組患兒共70例，其中男38例 （54.3%）、女32例（45.7%），年齡0.5～17.2歲，中位年齡7.4歲，平均病程9.4 d。MP組患兒中長病程患兒38例，短病程組32例；完成1個療程患兒28例 ，未完成1個療程患兒29例，未服用患兒13例；單份血清變化患兒45例，雙份血清4倍變化患兒25例。對照組（非MP感染）患兒共30例，其中10例為細菌性肺炎，12例為病毒性肺炎，8例為肺結核。

2.2 實時熒光定量PCR結合熒光探針診斷MP的準確性及其影響因素分析

70例MP感染患兒中MP-DNA陽性56例，陽性率為80.0%。患兒性別、病程、大環(huán)內酯類抗菌藥物治療史對檢出率均無明顯影響（χ2=0.001、0.705、1.103，P＞0.05）；雙份血清4倍變化組MP-DNA陽性檢出率（92.0%）明顯高于單份血清變化組MP-DNA陽性檢出率（71.1%），組間比較差異有統(tǒng)計學意義（χ2=4.165，P＜0.05）。見表1。

表1 MP感染患兒MP-DNA陽性檢出率比較例（%）

2.3 56例MP-DNA陽性患者耐藥突變分析

56例MP-DNA陽性患兒中有48例檢測出耐藥突變，其MP耐藥突變陽性率高達85.7%；不同性別之間的MP耐藥突變陽性率差異無統(tǒng)計學意義（χ2=2.550，P=0.110）；完成1個療程組、未完成 1個療程組及未服用組的MP耐藥突變率分別為90.5%（19/21）、80.0%（20/25）及50.0%（5/10），3個組比較差異有統(tǒng)計學意義（χ2=6.646，P=0.036）。見表2。

表2 56例MP-DNA陽性患者耐藥突變分析 例（%）

3 討論

MP是引起兒童呼吸道感染的主要病原體之一。近3年來，上海市奉賢區(qū)奉城醫(yī)院接診的MP感染患兒數(shù)量呈上升趨勢，且發(fā)現(xiàn)MP對大環(huán)內酯類抗菌藥物的耐藥率由2008年的3.2%增至2018年的30.5%。2016年馮真英等[6]和2018年倪珊珊等[7]先后報道培養(yǎng)分離到對大環(huán)內酯類抗菌藥物耐藥的MP，且其耐藥率遠高于以往文獻報道。早期、準確地診斷是否有MP感染及耐藥情況對避免抗菌藥物濫用、提高臨床療效和促進患兒預后意義重大。

MP培養(yǎng)是目前公認的診斷MP感染的金標準，但由于實驗室培養(yǎng)敏感性、特異性差，且所需時間較長，故不適用于早期診斷[8]。核酸檢測因具有診斷準確性高、檢測步驟簡單、耗時短等優(yōu)點已被廣泛應用于臨床[9-10]。本研究采用實時熒光定量PCR結合探針檢測的方法對MP患兒進行診斷，其結果顯示，PCR結合探針診斷MP感染的陽性率為80.0%（56/70），相比于其他MP核酸檢測方法，PCR擴增結合探針顯示出相近或更高的診斷準確性。馮雪莉等[11]探討恒溫擴增檢測MP-RNA在兒童MP感染中的診斷價值，結果其敏感性達75.0%，特異性達89.7%。顧文婧等[9]采集MP感染患兒鼻咽抽吸物進行MP-DNA檢測，發(fā)現(xiàn)病程≤1周患兒檢出率為69.0%。雖然MP-DNA檢測的診斷準確性較高，但應考慮到在病原微生物死亡后DNA還可以在體內存留一定時間，此時MP-DNA檢測結果陽性并不代表病原體處于存活狀態(tài)，因而在對患兒進行診斷與用藥時，臨床醫(yī)生還應根據(jù)臨床癥狀來進行綜合性判斷[12]。

本研究還對PCR結合探針診斷準確性的影響因素進行了分析，發(fā)現(xiàn)有81.4%（57/70）的患兒入院前已在其他醫(yī)療機構接受大環(huán)內酯類抗菌藥物治療。有研究報道患兒發(fā)病初期MP-DNA的陽性率較高，提示MP在機體內有感染與復制[13]。本研究中完成1個療程組、未完成1個療程組及未服用組的MP-DNA陽性檢出率差異無統(tǒng)計學意義（χ2=1.213，P=0.545）。入院前使用大環(huán)內酯類抗菌藥物進行治療的患兒，入院時的MP-DNA陽性檢出率未見有效降低，這也有可能是我們接診的MP肺炎患兒攜帶的MP耐藥菌株比例較高。

目前對MP的診斷主要依賴于血清學抗體檢測，具有敏感性高、特異性強的特點，但耗時長、價格昂貴、對技術人員要求高，制約了其在臨床中的普及。患兒MP感染后，機體內最早產生的抗體即為MP-IgM抗體，然而其形成尚需一段時間，一般在感染后7～10 d可被檢測到，3～4周達高峰，并可持續(xù)數(shù)月，采集急性期與恢復期雙份血清標本進行MP-IgM抗體檢測對臨床診斷具有參考價值。雙份血清MP-IgM抗體滴度呈4倍或4倍以上升高或降低對MP感染的早期診斷有意義。在本研究中，雙份血清4倍變化組MP-DNA陽性檢出率（92.0%）明顯高于單份血清變化組（71.1%），組間比較差異有統(tǒng)計學意義（χ2=4.165，P=0.041）。此外，顧文婧等[9]也報道，實時熒光定量PCR對MP-DNA的陽性檢出率與雙份血清抗體滴度呈4倍變化的一致性較高，提示臨床診斷MP肺炎時以雙份血清抗體滴度呈4倍或4倍以上升高或降低作為診斷標準，可獲得更高的診斷準確率。

近年來，國內外均有文獻報道分離出對大環(huán)內酯類抗菌藥物耐藥的菌株。根據(jù)目前對MP耐藥機制的研究發(fā)現(xiàn)[14]，其主要機制是抗菌藥物作用靶位基因的點突變，主要為核糖體的23SrRNA V區(qū)中心環(huán)的點突變，而MP在23SrRNA基因的A2063G與A2064G堿基突變通過使大環(huán)內酯與MP核糖體親和力降低而產生耐藥。本研究結果顯示，56例MP-DNA陽性患兒中有48例檢測出A2063G和/或A2064G突變，其中檢測出單純A2063G突變65例、單純A2064G突變68例、A2063G聯(lián)合A2064G突變35例，其MP耐藥突變陽性率高達85.7%，另規(guī)律完成大環(huán)內酯類治療1個療程組的MP耐藥突變率為90.5%，明顯高于未完成1個療程組（80.0%）及未服用組（50.0%），3個組比較差異有統(tǒng)計學意義（χ2=6.646，P=0.036）。該結果提示，MP肺炎對大環(huán)內酯類抗菌藥物具有嚴重的耐藥性，其耐藥機制主要是23SrRNA基因位點突變，也進一步證實了MP肺炎患兒對大環(huán)內酯類抗菌藥物的耐藥形勢相當嚴峻，提示MP核酸檢測可為臨床用藥調整提供依據(jù)，具有較為廣闊的臨床應用價值。

綜上所述，應用實時熒光定量PCR結合探針對MP肺炎進行診斷，其敏感性和特異性均較高，從本研究結果來看，MP-DNA耐藥突變率較高，臨床對MP患兒的治療用藥應根據(jù)耐藥性予以調整。