FadD9重組蛋白在活動(dòng)性肺結(jié)核診斷中的價(jià)值

張君麗， 林 晨， 王玉臣， 劉 軍， 袁 俐， 潘稚芬， 張 鷺

（1.復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200438；2.新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆 石河子 832002；3. 嘉興學(xué)院附屬第一醫(yī)院 嘉興市第一醫(yī)院結(jié)核科，浙江 嘉興 314000）

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的傳染性疾病，是單病因致死率較高的疾病之一。世界衛(wèi)生組織2018年的報(bào)告顯示，全球有近1/4的人口（約23億人）被MTB感染過，每年新增結(jié)核病患者約960萬(wàn)例，約有150萬(wàn)死于結(jié)核病[1]。我國(guó)是全球22個(gè)結(jié)核病高危國(guó)家和地區(qū)之一，MTB的感染人數(shù)已超5億，結(jié)核病發(fā)病數(shù)約為450萬(wàn)例[1]。MTB進(jìn)入宿主后根據(jù)機(jī)體的免疫水平會(huì)呈現(xiàn)3種不同的結(jié)果：（1）被免疫系統(tǒng)清除；（2）未被徹底清除而發(fā)展成潛伏性結(jié)核感染（latent tuberculosis infection，LTBI）；（3）形成活動(dòng)性結(jié)核（active tuberculosis，ATB）。約有90%的MTB感染會(huì)發(fā)展成為L(zhǎng)TBI[2]。LTBI是一種未出現(xiàn)臨床癥狀的持續(xù)性感染狀態(tài)，表現(xiàn)為結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)陽(yáng)性，但痰培養(yǎng)陰性且無(wú)影像學(xué)檢查征象[3]。隨著廣泛耐藥結(jié)核（extensive drug-resistant tuberculosis，XDR-TB）患者及結(jié)核病合并人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染患者的增多，結(jié)核病防控形勢(shì)尤為嚴(yán)峻，主要的原因包括缺乏快速、準(zhǔn)確的診斷技術(shù)，缺乏有效的抗結(jié)核疫苗和過長(zhǎng)的結(jié)核病藥物療程（9～12個(gè)月）?，F(xiàn)有的用于診斷MTB感染及區(qū)分ATB和LTBI的方法，如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)（enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT）和γ-干擾素釋放試驗(yàn)（interferongamma release assay，IGRA）等都或多或少存在一些缺陷，敏感性與特異性難以兼顧[4]。篩選、優(yōu)化哪些抗原或多肽用于MTB感染的診斷是研究者首先需要面對(duì)的難題，也是突破這一瓶頸的關(guān)鍵。目前，早期分泌靶抗原6（early secretory antigenic target-6，ESAT-6）和培養(yǎng)濾液蛋白10（culture filtrate protein-10，CFP-10）是現(xiàn)有診斷方法的核心抗原，但在不同高危人群中進(jìn)行活動(dòng)性結(jié)核病篩查時(shí)，這2個(gè)抗原的檢測(cè)結(jié)果有時(shí)會(huì)不一致[5]，其原因尚待進(jìn)一步研究。因此，篩選更多可用于臨床鑒別診斷的MTB候選抗原是提高結(jié)核病診斷能力的重要環(huán)節(jié)。fadD9（Rv2590）是MTB的一個(gè)脂質(zhì)代謝相關(guān)基因，作為脂肪酸-CoA連接酶參與細(xì)菌脂質(zhì)降解，具體功能還有待進(jìn)一步探索。本研究團(tuán)隊(duì)前期通過生物信息學(xué)表位預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)fadD9是一個(gè)很有潛力的診斷候選靶基因。為此，本研究擬探討通過基因表達(dá)和蛋白純化得到的FadD9重組蛋白在診斷MTB感染中的潛在價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

1.1.1 用于FadD9特異性抗體水平檢測(cè)的人群 選取2017年3月—2018年12月新疆石河子大學(xué)附屬醫(yī)院確診的活動(dòng)性肺結(jié)核患者145例（活動(dòng)性肺結(jié)核組），其中男65例、女80例，年齡（55.56±15.76）歲。選取同期與結(jié)核病患者有1年以上密切接觸史者38名（MTB密切接觸組），其中男17名、女21名，年齡（60.42±9.74）歲。選取同期新疆石河子大學(xué)附屬醫(yī)院體檢健康者101名（正常對(duì)照組），其中男51名、女50名，年齡（41.50±19.52）歲，均無(wú)結(jié)核病史及臨床結(jié)核病狀，且不曾與結(jié)核病患者接觸過。所有研究對(duì)象均無(wú)HIV感染，均有卡介苗接種史。以上人群的所有樣本均委托新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院項(xiàng)目合作組收集、鑒定。生物醫(yī)學(xué)研究倫理學(xué)審查經(jīng)新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過。

1.1.2 用于基于FadD9重組蛋白的IGRA檢測(cè)的人群 選取嘉興市第一醫(yī)院2018年8—10月確診的肺結(jié)核患者58例，其中男40例、女18例，年齡（53±40）歲，均為痰涂片陽(yáng)性或X線檢查具有結(jié)核影像學(xué)表現(xiàn)，且有相應(yīng)的臨床癥狀。以同期嘉興市第一醫(yī)院就診的未感染MTB的其他患者34例作為對(duì)照（非肺結(jié)核組），其中男16例、女18例，年齡（51±35）歲，均無(wú)結(jié)核病史及臨床結(jié)核癥狀，且不曾與結(jié)核病患者有密切接觸史。所有研究對(duì)象均無(wú)HIV感染，均有卡介苗接種史。以上人群的所有樣本均委托嘉興市第一醫(yī)院收集。生物醫(yī)學(xué)研究倫理學(xué)審查經(jīng)嘉興市第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過。

1.2 方法

1.2.1 FadD9重組蛋白的制備和鑒定 在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）上獲取fadD9基因序列（基因 ID：888574）。以MTBH37Rv基因組為模板，用fadD9基因的上、下游引物（上游引物為5'-GT GGGATCCATGTCGATCAACGATCAGCGACT GAC-3'，下游引物為5'-TATAAGCTTTCACAG CAGCCCGAGCAGTCGCAG-3'）進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）。PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后連接至pET28a載體中，將構(gòu)建好并經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸埃希菌BL21（DE3）中，涂布在含50 μg/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)過夜，隨機(jī)挑取單個(gè)菌落接種至5 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)至1 L。待菌液濁度達(dá)到0.6[600 nm處的吸光度（A）值]時(shí)加入1 mL異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropylbeta-D-thiogalactoside，IPTG）（終濃度為1 mmol/L）繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)3～4 h，12 000×g離心1 min，收集菌體并用超聲裂解，4 ℃ 12 000×g離心10 min，收集上清液。FadD9重組蛋白的N末端帶有pET28a載體上的6個(gè)組氨酸標(biāo)簽，可與鎳離子螯合，因此將Ni-NTA His·Bind Resin介質(zhì)（美國(guó)Novagen公司）與收集的上清液混合后加入到空色譜柱中，按照介質(zhì)說明書中的步驟進(jìn)行純化，獲得FadD9重組蛋白。純化好的蛋白采用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）鑒定純度。

1.2.2 FadD9抗原免疫原性分析 選取C57BL/6小鼠8只，每組4只，進(jìn)行皮下免疫注射，其中FadD9免疫組注射50 μL FadD9蛋白與等體積弗氏佐劑（美國(guó)Sigma公司）的混合物，陽(yáng)性對(duì)照組注射50μL Ag85a蛋白（陽(yáng)性參照抗原）與等體積弗氏佐劑的混合物，陰性對(duì)照組注射等量的磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）。小鼠分別在第1、3、5周進(jìn)行免疫注射，第1次免疫注射使用弗氏完全佐劑，第2、3次使用弗氏不完全佐劑。首次免疫8周后分離小鼠脾臟淋巴細(xì)胞和小鼠血清，用ELISA分別檢測(cè)脾細(xì)胞γ-干擾素（interferon-gamma，IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）和白細(xì)胞介素-2（interleukin 2，IL-2）釋放水平及FadD9重組蛋白的特異性IgG抗體水平。

1.2.3 血清中FadD9重組蛋白與特異性抗體的反應(yīng)性 以FadD9重組蛋白和Ag85A蛋白為抗原包被96孔板，以活動(dòng)性肺結(jié)核組、MTB密切接觸組和正常對(duì)照組的血清樣本分別作為一抗，按1∶100稀釋，二抗為過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗人IgG（美國(guó)CMCTAG公司），用前1∶3 000稀釋。檢測(cè)各組FadD9重組蛋白和Ag85A蛋白抗原抗體特異性反應(yīng)水平。

1.2.4 FadD9重組蛋白T細(xì)胞表位預(yù)測(cè)分析 使用NetMHCcons 1.1 Server和NetMHCⅡ2.3 Server在線網(wǎng)站，對(duì)選定的等位基因逐一進(jìn)行分析，記錄預(yù)測(cè)得到的FadD9重組蛋白T細(xì)胞表位，分析FadD9重組蛋白與主要組織相容性復(fù)合物（major histocompatibility complex，MHC）-Ⅰ和MHC-Ⅱ的結(jié)合能力[6-7]。

1.2.5 FadD9重組蛋白診斷結(jié)核病的價(jià)值 將FadD9重組蛋白和Ag85A蛋白作為抗原與肺結(jié)核組和非肺結(jié)核組的全血樣本37 ℃共孵育20～24 h后，離心分離血漿并進(jìn)行IGRA，試劑盒（ELISA）購(gòu)自北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)股份有限公司。將檢測(cè)結(jié)果與試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)管進(jìn)行比對(duì)，檢測(cè)FadD9重組蛋白和Ag85A蛋白在臨床血漿樣本中激起的細(xì)胞免疫水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad prism 8.0.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以±s表示，2個(gè)組之間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評(píng)估FadD9重組蛋白診斷肺結(jié)核的價(jià)值。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FadD9重組蛋白的制備和鑒定結(jié)果

FadD9重組蛋白均以可溶形式表達(dá)。純化后的FadD9重組蛋白經(jīng)10%SDS-PAGE鑒定，蛋白純度＞95%。見圖1。

2.2 FadD9重組蛋白的免疫原性評(píng)估結(jié)果

檢測(cè)抗原免疫后小鼠血清中的IgG（H+L）效價(jià)可評(píng)估抗原激起的體液免疫水平。FadD9重組蛋白的A值變化與陽(yáng)性參照抗原Ag85A蛋白基本一致，均高于陰性對(duì)照組。FadD9重組蛋白的血清抗體滴度達(dá)1∶12 800，與陽(yáng)性參照抗原Ag85A蛋白接近。見圖2。

圖1 FadD9重組蛋白的制備和鑒定結(jié)果

采用ELISA分別檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞的IFN-γ、TNF-α和IL-2水平。FadD9免疫組IFN-γ、TNF-α和IL-2水平分別為390.12、226.52、125.84 pg/mL ，三者比例為3.1∶1.8∶1.0。陽(yáng)性對(duì)照組分別為333.97、190.84、159.0 pg/mL，三者比例為2.1∶1.2∶1.0。說明FadD9重組蛋白具有良好的免疫原性。

2.3 活動(dòng)性肺結(jié)核組、MTB密切接觸組與正常對(duì)照組FadD9重組蛋白和Ag85A蛋白的特異性抗體水平比較

活動(dòng)性肺結(jié)核組抗FadD9抗體水平高于MTB密切接觸組和正常對(duì)照組（P＜0.000 1），MTB密切接觸組與正常對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）?？笰g85A抗體水平3組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3。

圖2 FadD9免疫小鼠血清抗體水平

圖3 活動(dòng)性肺結(jié)核組、MTB密切接觸組及正常對(duì)照組FadD9重組蛋白和Ag85A蛋白特異性抗體水平的比較

2.4 FadD9蛋白T細(xì)胞表位預(yù)測(cè)結(jié)果

FadD9天然蛋白與不同人群的人白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）-DR、HLA-A和HLA-B受體具有結(jié)合位點(diǎn)。使用NetMHCⅠ和NetMHCⅡ數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)FadD9重組蛋白T細(xì)胞表位進(jìn)行初步分析。FadD9在2個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中的19個(gè)亞型中至少具有4個(gè)以上強(qiáng)結(jié)合位點(diǎn)以及33個(gè)以上弱結(jié)合位點(diǎn)。見圖4。

2.5 FadD9重組蛋白診斷肺結(jié)核的效能

將FadD9重組蛋白和Ag85A蛋白作為抗原與肺結(jié)核組和非肺結(jié)核組的全血樣本37 ℃共孵育20～24 h，然后進(jìn)行IGRA，將檢測(cè)結(jié)果與試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)管進(jìn)行比對(duì)。ROC曲線分析結(jié)果顯示，F(xiàn)adD9重組蛋白診斷肺結(jié)核的曲線下面積（area under curve，AUC）為0.682，最佳臨界值為0.343，敏感性為96.8%，特異性為37.5%。見表2、圖5。

圖4 FadD9重組蛋白T細(xì)胞表位預(yù)測(cè)結(jié)果

表2 FadD9重組蛋白和IGRA標(biāo)準(zhǔn)管診斷肺結(jié)核的ROC曲線參數(shù)

圖5 FadD9重組蛋白與IGRA標(biāo)準(zhǔn)管診斷肺結(jié)核的ROC曲線

3 討論

FadD9（Rv2590）是MTB的脂質(zhì)代謝相關(guān)基因，可能與脂質(zhì)降解有關(guān)，但更多的生理功能仍有待進(jìn)一步研究。NORTH等[8]的研究結(jié)果顯示，在小鼠模型中，F(xiàn)adD9抗原能夠誘導(dǎo)輔助性T細(xì)胞1（T helper cell 1，Th1）型細(xì)胞因子，尤其是IFN-γ，而IFN-γ被認(rèn)為是控制MTB感染最重要的細(xì)胞因子，也是IGRA的效應(yīng)因子，足量的IFN-γ分泌是IGRA診斷成功的前提。同樣由Th1分泌的TNF-α可將免疫細(xì)胞招募至感染部位，控制MTB在體內(nèi)的散播，同時(shí)在肉芽腫的形成過程中也發(fā)揮著重要作用[9]。IL-2可促進(jìn)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的增殖[10]。這些細(xì)胞因子水平的升高提示FadD9蛋白在病原體-宿主相互作用的過程中發(fā)揮重要的細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用，具有用于診斷試劑和疫苗開發(fā)的潛力。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)adD9重組蛋白激發(fā)的小鼠血清特異性抗體的水平與陽(yáng)性參照抗原Ag85A蛋白接近，提示FadD9重組蛋白可同時(shí)在MTB感染者體內(nèi)激起較高水平的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。另外，活動(dòng)性肺結(jié)核組抗FadD9抗體水平高于MTB密切接觸組和正常對(duì)照組（P＜0.000 1），MTB密切接觸組與正常對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示FadD9重組蛋白可用于活動(dòng)性結(jié)核患者的相關(guān)血清學(xué)診斷試驗(yàn)。

抗原激發(fā)細(xì)胞免疫的水平取決于其一級(jí)結(jié)構(gòu)中細(xì)胞表位的數(shù)量。本研究選擇HLA-DRB、HLA-A和HLA-B亞群作為分析對(duì)象，HLA-DRB屬于MHC-Ⅱ型受體，可以識(shí)別超過90%的已知MTB抗原表位（約500個(gè)），刺激更多CD4+T細(xì)胞活化，釋放大量細(xì)胞因子，發(fā)揮抗結(jié)核的中心反應(yīng)。HLA-A和HLA-B屬于MHC-Ⅰ型受體，可活化CD8+T細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒效應(yīng)，在抗結(jié)核免疫中起重要作用[11-12]。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)adD9蛋白具有大量的T細(xì)胞表位，在人群中具有廣泛的一致性。結(jié)合FadD9蛋白能夠在小鼠中誘導(dǎo)出較強(qiáng)的Th1型細(xì)胞免疫反應(yīng)，提示FadD9蛋白或許能在結(jié)核病患者中激發(fā)出具有診斷意義的細(xì)胞免疫反應(yīng)。ROC曲線分析結(jié)果顯示，F(xiàn)adD9重組蛋白診斷結(jié)核病的AUC為0.682，表明FadD9重組蛋白具有用于以細(xì)胞免疫反應(yīng)為基礎(chǔ)的IGRA的潛力。雖然與IGRA試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)管相比，F(xiàn)adD9重組蛋白的敏感性較低，特異性也有待提高，但考慮到IGRA試劑盒使用的抗原為2種以上的抗原組合，因此FadD9重組蛋白及部分表位肽或可作為新型抗原組合的候選成分。

目前，結(jié)核病的診斷金標(biāo)準(zhǔn)依然是病原學(xué)檢查，但大量痰培養(yǎng)陰性結(jié)核病、潛伏感染人群的存在以及MTB生長(zhǎng)緩慢等特點(diǎn)，限制了病原學(xué)診斷的即時(shí)性和準(zhǔn)確性。而免疫學(xué)檢測(cè)方法具有快速、靈敏和特異性高的優(yōu)勢(shì)。目前，用于MTB感染診斷的免疫學(xué)方法較多，如ELISA、ELISPOT、IGRA等。ELISA是采用血清學(xué)方法診斷結(jié)核病，針對(duì)的是體液免疫。ELISPOT和IGRA針對(duì)的是細(xì)胞免疫，這2種方法的原理都是基于MTB感染后機(jī)體內(nèi)存在具有抗原特異性的記憶T細(xì)胞，用特定抗原刺激記憶T細(xì)胞，使其迅速活化增殖，ELISPOT檢測(cè)的是合成IFN-γ的細(xì)胞數(shù)量，IGRA則檢測(cè)IFN-γ的分泌量。ELISPOT和IGRA使用的核心抗原均為ESAT-6和CFP-10，對(duì)ATB的診斷有較好的表現(xiàn)，但無(wú)法很好地鑒別LTBI。因此只適用于MTB感染的輔助診斷，無(wú)法區(qū)分新近感染和既往感染，其結(jié)果仍存在假陽(yáng)性、對(duì)于LTBI敏感性低等缺點(diǎn)，尚無(wú)法替代痰涂片、培養(yǎng)或影像學(xué)等其他較為經(jīng)典的診斷方法[13-14]。實(shí)現(xiàn)結(jié)核病的早期、快速、特異性診斷還有很長(zhǎng)的一段路要走，改進(jìn)或開發(fā)新型、高效的檢測(cè)試劑意義重大，其核心是病原菌關(guān)鍵抗原（簇）的發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證。本研究結(jié)果顯示，與陽(yáng)性參照抗原Ag85A蛋白比較，F(xiàn)adD9重組蛋白表現(xiàn)出了良好的免疫原性，并能引起較高的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)水平，具有用于開發(fā)成診斷試劑的潛力。后續(xù)將根據(jù)抗原T細(xì)胞表位預(yù)測(cè)結(jié)果，合成不同的抗原表位，進(jìn)一步研究不同抗原表位用于結(jié)核病診斷的潛力；同時(shí)將FadD9重組蛋白/多肽與市售其他核心抗原混合使用，提高現(xiàn)有診斷抗原的敏感性和特異性，為診斷抗原的補(bǔ)充、檢測(cè)方法的優(yōu)化提供拓展性思路與方法[15-16]。

總之，尋找新型的MTB生物標(biāo)志物，提高診斷和鑒別診斷結(jié)核病的能力，對(duì)于結(jié)核病的早期診斷、療效監(jiān)測(cè)及制定相關(guān)的防疫措施至關(guān)重要。