沙門菌分離、篩檢和確認(rèn)流程技術(shù)關(guān)鍵點(diǎn)分析

劉 玥， 張紅芝， 顧其芳， 劉 誠， 朱穎瑩， 許學(xué)斌

（上海市疾病預(yù)防控制中心，上海 200336）

2015年，世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）評(píng)估全球31種食源性疾病病例約為6億例，死亡42萬例[1]，其中非傷寒和副傷寒病例約9 400萬例[2]。沙門菌也是我國優(yōu)勢(shì)食源致病菌，以培養(yǎng)為主的檢測標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用于臨床、獸醫(yī)和流通監(jiān)管領(lǐng)域，標(biāo)準(zhǔn)滯后會(huì)影響行業(yè)發(fā)展和政府公信力[3-4]。美國食品藥品監(jiān)督管理局（U. S. Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）2018年新頒布的食品沙門菌檢測標(biāo)準(zhǔn)突出了高敏感性的特點(diǎn)[5]。本研究集成2006年區(qū)域性WHO沙門菌檢測流程的技術(shù)關(guān)鍵點(diǎn)挖掘和評(píng)估方法，結(jié)合國內(nèi)外食品沙門菌檢測標(biāo)準(zhǔn)的梯度增菌和選擇性分離原則，構(gòu)建由沙門菌選擇性增菌液和分離平板構(gòu)成的多維組合檢測流程，評(píng)估菌落甄別、篩檢效率和方法敏感性，為各級(jí)標(biāo)準(zhǔn)提供全流程及多變量解析證據(jù)，以滿足不同機(jī)構(gòu)對(duì)沙門菌的更高敏感性檢測方法的需求。

1 材料和方法

1.1 參比菌株

典型和非典型沙門菌包括傷寒沙門菌（CMCC 50071）、甲型副傷寒沙門菌（ATCC 9150）、豬霍亂沙門菌（ATCC 7001）、鼠傷寒沙門菌（ATCC 14028）、豬霍亂沙門菌孔成道夫變種（ATCC 12011）；非沙門菌腸桿菌包括肺炎克雷伯菌（ATCC 700603）、奇異變形桿菌（ATCC 35659）、弗勞地枸櫞酸桿菌（ATCC 43864）和大腸埃希菌（ATCC 25922）。

1.2 儀器與試劑

菌液濁度儀及細(xì)菌鑒定質(zhì)譜儀（法國生物梅里埃公司）。非選擇性增菌液[緩沖蛋白凍水（buffered peptone water，BPW）]，選擇性增菌液[亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（selenite cystine broth，SC）、四硫磺酸鈉煌綠增菌液（tetrathionate broth，TTB）、羅伯特增菌液（Rappaport Vassiliadis broth，RV）、亞硒酸鹽煌綠增菌液（selenite brilliant green broth，SBG）]；沙門菌選擇性平板按原理和配方分為3類：沙門菌顯色平板（CHORMagarSalmonella，CAS）、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽平板（xylose lysine deoxycholate，XLD）和木糖賴氨酸十四烷基硫酸鈉平板（xylose lysine tergitol 4 agar，XLT4）屬中選擇性；亞硫酸鉍平板（bismuth sulphite agar，BS）和赫氏腸道菌平板（Hektoen enteric agar，HE）屬強(qiáng)選擇性。增菌液和平板均為自配，試劑購自美國BD公司，10℃以下避光保存，有效期內(nèi)使用。其他試劑：血平板、哥倫比亞瓊脂斜面、沙門菌誘導(dǎo)軟瓊脂和腸道菌篩選雙糖管（廣州迪景微生物公司），API20E氧化酶試劑及生化鑒定條（法國生物梅里埃公司），130種沙門菌分型血清（丹麥SSI診斷公司），平板和血清等均于10℃以下避光保存，有效期內(nèi)使用。

1.3 方法

1.3.1 參比菌株生化特征驗(yàn)證 復(fù)蘇和純化5株沙門菌和4株非沙門菌，取單個(gè)菌落接種腸道菌篩選雙糖管和CAS進(jìn)行表型生化初篩及系統(tǒng)生化、質(zhì)譜鑒定復(fù)核。見圖1。

1.3.2 比較沙門菌選擇性增菌液的定量回收 （1）靶菌回收。5株沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌株經(jīng)血平板純化后取1～3個(gè)純菌落制成0.5麥?zhǔn)蠞舛染海?.9%氯化鈉溶液梯度稀釋成10-1～10-10懸液。取各稀釋度的菌液100 μL分別加入TTB、RV、SC和SBG中。TTB和RV 41.5 ℃、SC和SBG 36 ℃孵育。18 h后分別取10 μL增菌液接種XLD和CAS，36 ℃放置24 h，記錄菌株生長濃度。（2）模擬樣加標(biāo)回收。取市售豬肉糜56 ℃ 30 min預(yù)處理，按圖1流程：取25 g模擬樣，加入225 mL BPW，取制備好的標(biāo)準(zhǔn)菌株懸液10-1～10-10各0.1 mL加入對(duì)應(yīng)模擬樣與BPW混合物，36 ℃放置8 h取1 mL各稀釋度BPW于TTB、SC、SBG和RV，TTB和RV置41.5 ℃、SC和SBG置36 ℃，18 h后分別取10 μL增菌液接種XLD和CAS，36 ℃放置24 h后，記錄靶菌在模擬樣中的生長濃度。

圖1 沙門菌方法學(xué)評(píng)價(jià)技術(shù)路線流程圖

1.3.3 驗(yàn)證沙門菌選擇平板的典型菌株特征 將5株沙門菌和4株非沙門菌純化，制成0.5麥?zhǔn)蠞舛染?，并?00 μL菌液涂布于XLD、XLT4、CAS和BS、HE，36 ℃放置24 h后觀察菌落特征。預(yù)期生長典型菌落：XLD和XLT4均為中心黑色的淡紅色濕潤菌落，CAS為酒紅色光滑濕潤菌落，BS為金屬光澤棕黑色菌落，HE為中心黑色淡綠色濕潤菌落。

1.3.4 沙門菌檢測流程的應(yīng)用和技術(shù)關(guān)鍵點(diǎn)評(píng)估 2019年7—9月，定點(diǎn)采集市售肉制品和水產(chǎn)品84件，單獨(dú)包裝待檢。按圖1流程完成BPW和TTB、RV、SC、SBG兩步增菌及XLD、CAS接種，選擇疑似典型菌落進(jìn)行生化初篩，用系統(tǒng)生化與質(zhì)譜（經(jīng)血平板純化新鮮菌落）鑒定和血清分型。定義統(tǒng)計(jì)參數(shù)：將各選擇性平板上生長的符合典型特征的菌落視為疑似陽性菌（數(shù)）；將符合腸道菌篩選雙糖管初篩的菌落數(shù)視為初篩陽性菌（數(shù)）；將系統(tǒng)生化和質(zhì)譜儀鑒定結(jié)果視為確認(rèn)陽性菌（數(shù)）；將各平板確認(rèn)的最終陽性菌落視為篩檢菌落的真陽性；基于各平板確認(rèn)不同沙門菌型株（數(shù)）交集值視為檢測真陽性，分別統(tǒng)計(jì)各平板和增菌流程篩檢沙門菌的敏感性和陽性預(yù)測值[6]。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株生化表型驗(yàn)證

5株沙門菌包括傷寒沙門菌、副傷寒沙門菌和非傷寒沙門菌，豬霍亂沙門菌為硫化氫陰性沙門菌，經(jīng)腸道菌篩選雙糖管和CAS驗(yàn)證均符合沙門菌初篩表型特征。4株非沙門菌除奇異變形桿菌不能排除沙門菌，需要進(jìn)一步生化確認(rèn)外，其余包括產(chǎn)生硫化氫的弗勞地枸櫞酸桿菌初篩驗(yàn)證均可排除沙門菌，見表1。

表1 驗(yàn)證測試參比菌株在初篩流程的表型特征

2.2 沙門菌選擇性增菌液定量回收試驗(yàn)

靶菌對(duì)RV、TTB和SBG回收結(jié)果無顯著差異。SC回收傷寒沙門菌和甲型副傷寒沙門菌的梯度均高于RV、TTB和SBG 1個(gè)稀釋度，回收豬霍亂沙門菌及其孔成道夫變種的梯度均低于RV、TTB和SBG 2～3個(gè)稀釋度。模擬樣加標(biāo)對(duì)RV、TTB、SBG回收結(jié)果也無顯著差異。見表2。

表2 4種沙門菌選擇性增菌液靶菌回收和模擬樣加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

2.3 沙門菌選擇性平板的預(yù)期典型菌落生長狀況

CAS驗(yàn)證5株沙門菌皆呈典型菌落，其余平板對(duì)傷寒豬霍亂沙門菌、副傷寒豬霍亂沙門菌和豬霍亂沙門菌因24 h內(nèi)硫化氫陰性和菌落小而無法判斷為典型菌落。XLD典型菌落為鼠傷寒沙門菌、豬霍亂沙門菌孔成道夫變種，XLT4為鼠傷寒沙門菌，BS為鼠傷寒沙門菌，HE為鼠傷寒沙門菌，見圖2。XLT4和BS驗(yàn)證4株非沙門菌未見預(yù)期典型菌落，而CAS（奇異變形桿菌）、XLD和HE（均為弗勞地枸櫞酸桿菌）驗(yàn)證結(jié)果均為假陽性菌落，見圖3。

圖2 沙門菌參比菌株在不同類型沙門菌選擇性平板生長24 h的菌落特征

2.4 沙門菌的實(shí)樣檢測

84件樣品包括畜肉22件、禽肉32件和水產(chǎn)品30件。經(jīng)多種選擇性增菌液和選擇性平板的多維組合分離、初篩和表型確認(rèn)，陽性樣品數(shù)為25件，分離沙門菌42株：畜肉27株、禽肉14株、水產(chǎn)品1株。血清型：鼠傷寒7株、羅森5株、倫敦5株、腸炎4株、德比4株、鴨4株、黃金海岸3株、科瓦利斯2株、明斯特1株、火雞1株、哈達(dá)爾1株、科特布斯1株、肯塔基1株、湯卜遜1株、利文斯通1株和胥戈成格隆1株。

圖3 非沙門菌在不同類型沙門菌選擇性平板生長24 h的菌落特征

2.4.1 選擇性增菌液和選擇性平板多維組合分離效果 經(jīng)RV、TTB、SBG、SC梯度增菌、CAS和XLD篩檢沙門菌的敏感性分別為88%、84%、72%和0。將SC視作偏移，RV和TTB、RV和SBG、TTB和SBG雙組合篩檢沙門菌的敏感性分別為100%、92%和88%。見表3。

2.4.2 選擇性平板的分離效果 RV和TTB分離敏感性均為CAS高于XLD，CAS分別為68%、48%，XLD分別為68%、60%；SBG則相反，分別為48%、56%；而沙門菌的菌型敏感性均為CAS高于XLD，以RV-CAS（88.10%）、SBGCAS（85.71%）敏感度較高，見表3。

2.4.3 選擇性平板菌落甄別、初篩和確認(rèn)效率評(píng)估 除SC外，各組選擇性增菌液分離平板后的疑似菌落數(shù)在34～50個(gè)，經(jīng)生化初篩后確認(rèn)除3株為非沙門菌的腸桿菌科干擾菌，其余均為沙門菌；生化初篩排除的非沙門菌經(jīng)系統(tǒng)生化和質(zhì)譜確認(rèn)無漏檢。腸道菌篩選雙糖管篩檢沙門菌疑似典型菌落具備高特異性，除1株CAS產(chǎn)紅色脂溶性色素的液化沙雷菌存在誤判，其余符合初篩陽性菌落和系統(tǒng)生化、質(zhì)譜比對(duì)的確認(rèn)結(jié)果均為100%符合，提示腸道菌篩選雙糖管篩檢沙門菌疑似典型菌落具備高陽性預(yù)測值。見表3。

表3 選擇性增菌液和平板組合分離、篩選和確認(rèn)沙門菌的參數(shù)統(tǒng)計(jì)

3 討論

有效增菌能提高腸道沙門菌檢測敏感性，以達(dá)到精準(zhǔn)診斷的要求[7]。沙門菌腹瀉的優(yōu)勢(shì)病原菌為鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌，腸外優(yōu)勢(shì)血清型為豬霍亂、甲型副傷寒和傷寒等侵襲性血清型[8-11]。醫(yī)療診斷和風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測可為改善診療行為、優(yōu)化抗菌藥物使用和暴發(fā)病例溯源與防控提供參考[12-13]。為了給我國食品沙門菌檢測標(biāo)準(zhǔn)的修訂提供科學(xué)依據(jù)，本研究根據(jù)國內(nèi)外食品沙門菌相關(guān)檢測標(biāo)準(zhǔn)構(gòu)建多維度組合篩檢流程，基于菌株驗(yàn)證、回收試驗(yàn)和實(shí)樣檢測進(jìn)行多維度組合測試、評(píng)價(jià)。

食品沙門菌的檢測包括兩步法增菌和選擇性分離。本研究依據(jù)沙門菌到達(dá)增菌曲線峰值時(shí)間（18～24 h）設(shè)計(jì)4種不同選擇性增菌液的回收試驗(yàn)[14]，結(jié)果表明，SBG、RV和TTB的回收率較一致，SC對(duì)傷寒沙門菌和甲型副傷寒沙門菌的回收較前3種增菌液高1個(gè)稀釋度（10倍），對(duì)鼠傷寒沙門菌、豬霍亂沙門菌及其孔成道夫變種的回收明顯低于前3種增菌液2個(gè)稀釋度度（100倍），間接證實(shí)了國家標(biāo)準(zhǔn)[3]中SC重點(diǎn)針對(duì)傷寒沙門菌和副傷寒沙門菌；模擬試驗(yàn)證實(shí)，食品的物理特性對(duì)沙門菌增殖效率的影響為1個(gè)稀釋度（10倍）。SC增菌實(shí)樣檢測未分離到沙門菌，提示亞硒酸鹽類增菌液有效增菌時(shí)間為8～12 h，過峰值后樣品中的雜菌會(huì)掩蓋沙門菌導(dǎo)致平板分離出現(xiàn)假陰性[14]。GB對(duì)傷寒沙門菌和副傷寒沙門菌的傾向性間接降低了非傷寒沙門菌的檢測敏感性，與我國實(shí)際監(jiān)測的人源和食源性沙門菌菌型分布并不匹配[8，15]。

CAS和中等選擇性平板（XLD）組合幾乎不會(huì)漏檢增菌后糞便樣本中的沙門菌[16]。有食品標(biāo)準(zhǔn)[17]中注釋用強(qiáng)選擇性平板（BS、HE）可提高復(fù)雜樣品篩選效率和傷寒及乳糖陽性沙門菌的選擇性。本研究用硫化氫有差異的沙門菌驗(yàn)證平板結(jié)果符合預(yù)期：除CAS外，其他4種以硫化氫為篩選原理的平板均無法呈典型菌落，而其他非沙門菌（產(chǎn)硫化氫腸桿菌）疑似典型菌落篩選結(jié)果為無效篩選，降低了檢測特異性；相關(guān)食品標(biāo)準(zhǔn)[17]注釋對(duì)強(qiáng)選擇性平板延遲至48 h是緣于24 h菌落較?。ㄏ啾萖LD和XLT4），而檢測時(shí)效是臨床實(shí)驗(yàn)室方法評(píng)價(jià)、應(yīng)用的重要前提。

本研究選擇性增菌液和平板組合基本滿足國內(nèi)外食品沙門菌檢測的標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)樣檢測證實(shí)SC不適用于非傷寒沙門菌的選擇性增菌。其他3種增菌液經(jīng)CAS、XLD（單增菌液和單平板）組合分離敏感性為48%～68%、雙平板分離敏感性為72%～88%，提示單增菌液檢測食品樣品沙門菌的敏感性存在局限性，2種增菌液和多種平板搭配可提高敏感性。以國家標(biāo)準(zhǔn)方法（SC、TTB和BS、HE）檢測肉制品沙門菌陽性檢出率為11.11%～21.50%[15，18-19]，更換選擇性平板（SC/TTB和CAS/XLT4）后肉制品沙門菌的陽性檢出率為26.50%[20]，更換選擇性增菌液（SBG和CAS/XLD）后生鮮肉制品沙門菌的陽性檢出率為26.10%[21]，本研究多增菌液和雙平板組合檢測陽性率為29.76%，證實(shí)RV適用于食品沙門菌的增菌。

除有效增菌和菌落識(shí)別外，沙門菌疑似菌的簡易甄別、篩選也是重要的特異性指標(biāo)，質(zhì)譜儀對(duì)臨床腸道菌屬（沙門菌屬）的鑒定依賴經(jīng)純化的培養(yǎng)物[22]，非傷寒沙門菌存在多個(gè)血清型的硫化氫表型異質(zhì)性[23]。瑞典與血清型有關(guān)的硫化氫陰性鼠傷寒單相變種的食源性暴發(fā)提示診療技術(shù)面臨新的挑戰(zhàn)[24]。本研究未漏檢不典型沙門菌（豬霍亂沙門菌和甲型副傷寒沙門菌）的原理是基于腸道菌生化篩選組合——?jiǎng)恿?吲哚-尿酶[25]。

綜上所述，梯度增菌、菌落甄別、簡易篩選為沙門菌檢測的技術(shù)關(guān)鍵點(diǎn)。FDA食品沙門菌標(biāo)準(zhǔn)重視硫化氫陰性和乳糖陽性等表型異質(zhì)沙門菌，我國修訂中的感染性腹瀉診斷標(biāo)準(zhǔn)推薦分別選用SBG和TTB作為首選和次選增菌液，均是以敏感性為導(dǎo)向的規(guī)則轉(zhuǎn)變[4-5，7]。