99Tcm-3PRGD2 SPECT顯像用于胰腺癌荷瘤裸鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床轉(zhuǎn)化研究

靳曉娜，鄭 堃，石希敏，賈 兵，董誠巖，鄭連芳，杜延榮，霍 力，李 方，*

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 核醫(yī)學(xué)科，北京 100730；2.核醫(yī)學(xué)科分子靶向診療北京重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100730；3.北京大學(xué) 醫(yī)學(xué)部 同位素中心，北京 100191；4.通用電氣醫(yī)療(中國)，北京 100004

整合素(integrin) αvβ3在某些腫瘤細(xì)胞和新生血管內(nèi)皮細(xì)胞表面高表達(dá)，但在成熟血管和正常的器官系統(tǒng)很少表達(dá)或不表達(dá)，此特點(diǎn)使其成為腫瘤新生血管顯像及治療的靶點(diǎn)[1-3]。研究證實(shí)含有RGD(Arg-Gly-Asp，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)三肽序列的配體與整合素αvβ3具有特異性和高親和力[4-5]。3PRGD2是一種新型RGD二聚體，在兩個(gè)RGD模序之間引入PEG4作為連接基團(tuán)。99Tcm標(biāo)記的3PRGD2可與整合素αvβ3特異性結(jié)合，并進(jìn)行單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像(SPECT)。

近幾年整合素受體顯像已經(jīng)被用于肺癌、乳腺癌、甲狀腺癌肺轉(zhuǎn)移的臨床診斷及療效評(píng)估，以及腦梗、心梗后的血管新生的評(píng)估中，本研究團(tuán)隊(duì)也積累了大量的經(jīng)驗(yàn)[6-8]，但國內(nèi)外尚無其在胰腺癌中應(yīng)用的報(bào)道。胰腺癌是一種具有高度侵襲性和快速進(jìn)展性疾病[9-10]。在西方發(fā)達(dá)國家，胰腺癌是第9個(gè)最常見的惡性腫瘤和第4個(gè)癌癥相關(guān)的死亡原因，平均5年生存率不到5%[10]。大多數(shù)患者的胰腺癌第一次被發(fā)現(xiàn)時(shí)，已經(jīng)出現(xiàn)了嚴(yán)重的局部浸潤和/或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，從而錯(cuò)過了根治性手術(shù)切除最佳時(shí)機(jī)，因此可早期診斷和準(zhǔn)確評(píng)估腫瘤分期的影像學(xué)方法顯得尤為重要。因此本研究擬進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及初步臨床轉(zhuǎn)化，探索99Tcm-3PRGD2SPECT顯像應(yīng)用于胰腺癌的價(jià)值。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

HYNIC-3PEG4-E[c(RGDfK)2藥盒(藥盒中含有5 mg三苯基膦三間磺酸鈉、6.5 mg三羥甲基甘氨酸、40 mg 甘露醇、20 μg HYNIC-3PRGD2以及琥珀酸鹽緩沖液成分)，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部同位素中心王凡教授惠贈(zèng)；胰腺癌PANC-1細(xì)胞，由北京協(xié)和醫(yī)院基本外科實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；Sep-Pak C18反相萃取柱，美國Waters公司；Muhiscreen抽濾板，美國Millipore公司；Na99TcmO4洗脫液，北京原子高科股份有限公司；鼠抗人整合素αvβ3單克隆抗體，美國Chemicon公司；異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的羊抗鼠IgG、3-氨丙基-3-甲氧基硅烷(3-aminopropyl-triethoxysilane, APES)，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)，美國Biotium公司。

CRC-15R放射性活度計(jì)，美國Capintec公司；ITLC-SG紙條，美國Agilent公司；AR-2000放射性掃描儀，Bioscan公司；E.CAM單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描儀(SPECT)、biography 128 TrueVTrueX正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描儀/電子計(jì)算機(jī)X射線斷層掃描儀(PET/CT)，西門子公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和荷瘤鼠模型的建立 將PANC-1胰腺癌細(xì)胞用含10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)胎牛血清(BSA)的低糖DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)傳代。荷瘤鼠模型的建立：取4～5周齡BALB/c裸鼠，于上肢肩部接種PANC-1胰腺癌細(xì)胞，每只接種5×106個(gè)細(xì)胞，飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房。待腫瘤平均直徑達(dá)到0.8～1.0 cm時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2免疫組化實(shí)驗(yàn)

(1) 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)設(shè)2個(gè)平行組，每組設(shè)2個(gè)平行樣。一組將待檢PANC-1細(xì)胞以1×105mL-1接種到小玻片(細(xì)胞爬片)上，培養(yǎng)過夜，用4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛固定20 min。磷酸鹽緩沖溶液(PBS，0.01 mol/L，pH=7.4)洗后用含有1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)BSA的PBS封閉1 h。封閉后分別加入鼠抗人整合素αvβ3單克隆抗體( 1∶100稀釋)和人源IgG，4 ℃孵育過夜。用含0.1%(體積分?jǐn)?shù)，下同)Tween-20的PBS洗3次后加入FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG (1∶200稀釋)和DAPI(用含5%BSA的PBS稀釋成100 ng/L)溶液，室溫下孵育1 h。用PBS洗3次。用蒸餾水沖去鹽分，甘油緩沖液封片。另一組用人源IgG代替鼠抗人整合素αvβ3單克隆抗體。最后置于激光共聚顯微鏡下觀察。

(2) 組織實(shí)驗(yàn)設(shè)2個(gè)平行組，每組設(shè)2個(gè)平行樣，將胰腺癌組織冰凍切片取出風(fēng)干，用冰丙酮溶液浸泡固定10 min，空氣干燥10 min。加含5%BSA的PBS室溫孵育1 h。一組加鼠抗人整合素αvβ3單克隆抗體(1∶100稀釋)，37 ℃孵育1 h。用PBS洗3次，加FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶200稀釋)和DAPI溶液，37 ℃孵育1 h。用PBS洗3次。用蒸餾水沖去鹽分，甘油緩沖液封片。另一組用人源IgG代替鼠抗人整合素αvβ3單克隆抗體。最后使用激光共聚顯微鏡觀察。

1.2.399Tcm-3PRGD2標(biāo)記、質(zhì)控及安全性檢測 取1 mL Na99TcmO4洗脫液740～1 300 MBq (20～35 mCi)加入到3PRGD2藥盒中。充分振蕩使藥盒中固體樣品徹底溶解至澄清，100 ℃加熱20 min。反應(yīng)完成后，冷卻至室溫，用0.22 μm無菌濾膜過濾。用無菌生理鹽水稀釋到所需劑量濃度。標(biāo)記完成后，用無菌注射器取1滴產(chǎn)物溶液點(diǎn)于快速硅膠薄層紙(ITLC-SG)，點(diǎn)樣后分別用檸檬酸-檸檬酸三鈉二水合物緩沖液(體系1，pH=5)和乙腈與生理鹽水混合體系(體系2，體積比1∶1)兩種展開體系上行展開，將層析紙條晾干后，使用Bioscan放射性薄層掃描儀進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，數(shù)據(jù)采集完成后獲取圖像、各放射性百分比及Rf值，用于計(jì)算藥品的放化純度。產(chǎn)品低溫保存，質(zhì)控合格后使用。標(biāo)記3批次，將產(chǎn)品進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)及細(xì)菌內(nèi)毒素檢測。

1.2.4急性毒性試驗(yàn) 取6周齡昆明鼠8只，體重(20±5) g，5只為實(shí)驗(yàn)組，3只為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組每只鼠尾靜脈注射99Tcm-3PRGD22 mCi/0.5 mL(1 Ci=3.7×1010Bq)。本研究擬以0.3 mCi/kg的劑量給患者注射99Tcm-3PRGD2，則所給實(shí)驗(yàn)組鼠的劑量是人體的333倍。對(duì)照組鼠尾靜脈注射生理鹽水0.5 mL。均于5 s內(nèi)勻速注射完畢。

1.2.5荷瘤裸鼠全身平面顯像 4只荷瘤裸鼠分別自尾靜脈注射99Tcm-3PRGD2(200 μL，14.8 MBq)，并于注射后0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 h時(shí)，將裸鼠腹腔注射10%水合氯醛(劑量3 mL/kg)麻醉后仰臥于配有平行孔低能高分辨準(zhǔn)直器的雙探頭SPECT上進(jìn)行平面顯像。全身采集計(jì)數(shù)分別為300 k，矩陣大小為128×128。觀察腫瘤對(duì)示蹤劑的攝取以及全身分布情況。在腫瘤(T)和健康側(cè)對(duì)應(yīng)部位(NT)勾畫的感興趣區(qū)(ROI)，獲取感興趣區(qū)內(nèi)最高放射性計(jì)數(shù)，并計(jì)算其放射性攝取比值T/NT，分析它們隨時(shí)間變化的規(guī)律。

1.2.6初步臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用 本臨床研究獲得中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。對(duì)6例CT發(fā)現(xiàn)胰腺腫瘤患者行99Tcm-3PRGD2SPECT顯像，患者均為男性，年齡51～67(62.4±3.4)歲。靜脈注射99Tcm-3PRGD2，每kg體重注射劑量0.3 mCi(±10%)，注射后1 h排尿后行前后位全身掃描，掃描速率為10 cm/min，后行腹部斷層顯像，約為注射示蹤劑后1.5 h±10 min，其中5例患者于2周內(nèi)行常規(guī)18F-FDG PET/CT檢查。

2 結(jié)果與討論

2.1 免疫組化實(shí)驗(yàn)

胰腺癌PANC-1細(xì)胞和腫瘤組織切片對(duì)鼠抗人整合素 αvβ3單克隆抗體顯示出強(qiáng)陽性免疫染色，以人源IgG作為陰性對(duì)照的免疫熒光染色結(jié)果為陰性證實(shí)了結(jié)合的特異性，表明了PANC-1胰腺癌細(xì)胞和腫瘤組織中表達(dá)整合素αvβ3(圖1)。此結(jié)果為本工作的后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了分子水平的理論依據(jù)。

2.2 99Tcm-3PRGD2標(biāo)記、質(zhì)控及安全性檢測

(a)和(c)分別為以鼠抗人整合素αvβ3單克隆抗體為一抗腫瘤細(xì)胞和腫瘤組織切片的染色結(jié)果，強(qiáng)陽性；(b)和(d)分別為以IgG作為一抗腫瘤細(xì)胞和腫瘤組織切片的染色結(jié)果，為陰性圖1 胰腺癌PANC-1細(xì)胞及腫瘤組織免疫組化染色Fig.1 Integrin αvβ3 expression in PANC-1 cells and tumor tissue by immunofluorescence staining

99Tcm-3PRGD2：(a)——Rf=0.0，(b)——Rf=0.9～1.0圖2 ITLC-SG法質(zhì)控結(jié)果Fig.2 Quality control results of ITLC-SG method

2.3 急性毒性試驗(yàn)

注射99Tcm-3PRGD2觀察48 h內(nèi)小鼠無死亡，120 h內(nèi)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠飲食、活動(dòng)均正常。注射后120 h時(shí)處死并解剖小鼠，實(shí)驗(yàn)組小鼠各臟器顏色、形態(tài)與對(duì)照組無明顯差異。急性毒性試驗(yàn)提示安全性強(qiáng)。

2.4 荷瘤裸鼠全身平面顯像

荷瘤裸鼠全身平面顯像(圖3)提示99Tcm-3PRGD2主要分布于腫瘤、肝臟、雙腎和膀胱，排尿后膀胱內(nèi)放射性分布明顯減少。心臟、雙肺、肌肉和骨骼對(duì)示蹤劑攝取低。 腫瘤在0.5 h即可清晰顯影，肌肉本底較低，說明99Tcm-3PRGD2能夠快速與整合素受體結(jié)合，且靶/本底比值較高，T/NT為1.58±0.15。從圖3所示的全身分布情況看，雙腎及膀胱放射性分布多，肝臟次之，腦、心臟、雙肺分布最少，說明99Tcm-3PRGD2主要經(jīng)腎臟代謝后以尿液形式排出體外。受肝、脾、雙腎及膀胱影響，未觀察到胰腺及腸道攝取。隨時(shí)間延長，腫瘤攝取99Tcm-3PRGD2逐漸增加，軟組織本底逐漸降低，1.5 h時(shí)T/NT達(dá)峰值(圖4)，為2.51±0.54。觀察至6.0 h，腫瘤仍清晰可見，T/NT為1.43±0.06。此實(shí)驗(yàn)為以荷胰腺癌(PANC-1細(xì)胞)裸鼠模型為基礎(chǔ)的顯像研究建立了成熟的顯像方法，提供了觀察腫瘤的最佳時(shí)間點(diǎn)。注射后6.0 h仍可見腫瘤對(duì)示蹤劑有較高濃聚，除了腫瘤、肝、雙腎及膀胱，其他臟器亦未見明顯分布，說明99Tcm-3PRGD2在荷瘤鼠體內(nèi)穩(wěn)定性好，持續(xù)時(shí)間長。

(a)中白色箭頭所指位置為腫瘤圖3 荷瘤鼠全身平面顯像Fig.3 Whole body planar imaging of PANC-1-bearing mice

n=4圖4 T/NT隨時(shí)間的變化Fig.4 T/NT variation over time

2.5 初步臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用

紅色箭頭：胰腺原發(fā)灶；藍(lán)色箭頭：肝轉(zhuǎn)移灶圖5 99Tcm-3PRGD2 SPECT 前(a)、后(b)位全身平面顯像Fig.5 99Tcm-3PRGD2 SPECT anterior(a) and posterior(b) planar scans of the whole body

患者均為男性，年齡51～67(62.4±3.4)歲，檢查過程及檢查后隨訪兩周，未見明顯不適。共發(fā)現(xiàn)6個(gè)胰腺病灶，分布于胰頭、頸及體尾部，大小約1.5～5.2 cm，手術(shù)或穿刺病理結(jié)果：導(dǎo)管腺癌4例，腺細(xì)胞癌2例。99Tcm-3PRGD2SPECT 全身顯像顯示胰腺癌及肝左葉見示蹤劑濃聚灶(圖5)，肝、脾、腸道、雙腎及膀胱見較多示蹤劑分布，唾液腺及甲狀腺輕度放射性攝取，其余臟器未見明顯示蹤劑分布。99Tcm-3PRGD2SPECT全身及斷層顯像(圖6)檢出所有的胰腺癌原發(fā)灶，檢出率為100%，腫瘤/肝臟放射性攝取比值(T/L)為1.7～3.5。18F-FDG PET/CT檢出5例患者中的原發(fā)灶，最大標(biāo)準(zhǔn)攝取值(SUVmax)為2.8～9.1，T/L為1.5～4.2。1例胰腺癌患者伴有肝左葉兩處轉(zhuǎn)移(圖6)，病灶大小分別約為2.6 cm和1.1 cm，較大者對(duì)99Tcm-3PRGD2攝取增高，T/L為2.5，較小者對(duì)99Tcm-3PRGD2攝取與肝臟接近；肝轉(zhuǎn)移灶對(duì)18F-FDG攝取不同程度增高，T/L分別為1.5(2.6 cm)和2.3(1.1 cm)，說明它們處于不同病理生理狀態(tài)，較大者腫瘤細(xì)胞的糖代謝相對(duì)較低(對(duì)18F-FDG攝取較低)，血管新生旺盛(對(duì)99Tcm-3PRGD2較高)，較小者對(duì)兩種示蹤劑攝取程度相反，這個(gè)現(xiàn)象及原因需進(jìn)行更深入的研究。99Tcm-3PRGD2SPECT檢出了6例胰腺癌患者的原發(fā)灶和肝內(nèi)轉(zhuǎn)移灶，具有應(yīng)用于胰腺癌診斷的潛能，并且檢查操作簡單，費(fèi)用低于18F-FDG PET/CT。本研究僅為初步研究，臨床轉(zhuǎn)化病例數(shù)少，需進(jìn)行大樣本的臨床研究，以證實(shí)99Tcm-3PRGD2SPECT對(duì)胰腺癌的診斷價(jià)值。

圖6 胰腺癌對(duì) 99Tcm -3PRGD2(a)、18F-FDG(b)的攝取，肝轉(zhuǎn)移灶對(duì)99Tcm-3PRGD2(c)、18F-FDG(d)的攝取，以及CT所示胰腺癌病灶(e)及肝轉(zhuǎn)移灶(f)Fig.6 Intense 99Tcm-3PRGD2(a) and 18F-FDG(b) uptakes in pancreatic cancer, different distribution of 99Tcm-3PRGD2(c) and 18F-FDG(d) in liver metastases, and pancreatic cancer(e) and liver metastases(f) by CT

3 結(jié) 論

(1)99Tcm-3PRGD2是一種能夠與腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞表面的整合素受體特異性結(jié)合的單光子腫瘤顯像劑。它的制備及質(zhì)控方法易于操作，并且其具有很好的安全性和顯像效果，適于推廣應(yīng)用。

(2) 初步的臨床轉(zhuǎn)化研究提示99Tcm-3PRGD2SPECT顯像對(duì)胰腺癌的臨床診斷具有潛在的應(yīng)用前景。