生物熱化學(xué)和熱動(dòng)力學(xué)研究進(jìn)展

謝文，周蓮嬌，徐娟，郭清蓮，蔣風(fēng)雷，劉義,＊

1武漢大學(xué)中南醫(yī)院檢驗(yàn)科，武漢 430071

2武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院，武漢 430072

1 引言

生命相關(guān)過(guò)程伴隨著極其復(fù)雜的化學(xué)和物理過(guò)程，包含著物質(zhì)變化和能量轉(zhuǎn)換。隨著傳統(tǒng)熱力學(xué)框架的完善，熱化學(xué)測(cè)量技術(shù)的快速發(fā)展以及學(xué)科交叉滲透發(fā)展，熱化學(xué)技術(shù)和方法在生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用越來(lái)越顯示出其迫切性和優(yōu)越性。

與化學(xué)過(guò)程相比，生物工藝過(guò)程忽視了生物過(guò)程中的熱力學(xué)規(guī)則，忽略了復(fù)雜生物分子和細(xì)胞代謝的熱力學(xué)中的一些特定規(guī)律1。而隨著生物工藝的發(fā)展，人們可以更實(shí)時(shí)、定量地描述生物分子的構(gòu)-效關(guān)系，可采用模擬和建模方法降低實(shí)驗(yàn)成本2，熱力學(xué)推導(dǎo)的模型3-7在這方面做出了非常顯著的貢獻(xiàn)。然而，傳統(tǒng)的熱力學(xué)處理方法對(duì)具有極其復(fù)雜結(jié)構(gòu)和電荷分布的生物分子的行為描述不夠精確，同時(shí)全細(xì)胞生物催化過(guò)程的熱力學(xué)處理，也對(duì)傳統(tǒng)熱力學(xué)提出了很高的要求。細(xì)胞新陳代謝過(guò)程通常發(fā)生在遠(yuǎn)離平衡態(tài)的狀態(tài)下，并且還具有高度不可逆性和自組織性，而復(fù)雜的反應(yīng)環(huán)境、強(qiáng)烈的相互作用以及活細(xì)胞或細(xì)胞器內(nèi)大量小分子的存在，都使這一過(guò)程更加復(fù)雜。

我們可以將生命體系看作復(fù)雜而開(kāi)放的熱力學(xué)系統(tǒng)，所有生物生長(zhǎng)代謝過(guò)程都伴隨著物質(zhì)和能量交換。生物體在新陳代謝過(guò)程中部分能量以熱的形式散發(fā)出來(lái)，即產(chǎn)生代謝熱，這是生物熱化學(xué)發(fā)展的基礎(chǔ)。生物代謝產(chǎn)熱過(guò)程一般有強(qiáng)度低、周期長(zhǎng)、速率慢的特點(diǎn)，利用高精度、自動(dòng)化和連續(xù)式的微量熱儀，可對(duì)其進(jìn)行連續(xù)跟蹤監(jiān)測(cè)，獲取相關(guān)過(guò)程熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)信息。量熱計(jì)是用于熱量測(cè)定的儀器。量熱計(jì)在量熱計(jì)腔與量熱計(jì)恒溫塊之間設(shè)置大量的熱電偶。測(cè)量池中的樣品由于某反應(yīng)的進(jìn)行而產(chǎn)生熱效應(yīng)，使得其本身的溫度發(fā)生改變。此時(shí)樣品和恒溫塊之間存在一定的溫差(ΔT)，高靈敏度的熱電偶將量熱計(jì)腔與恒溫塊之間的溫度差轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，經(jīng)放大后輸出。量熱計(jì)連續(xù)地、無(wú)損地檢測(cè)化學(xué)或生物過(guò)程所產(chǎn)生的熱量，并繪制熱功率P隨時(shí)間t變化的精確曲線(xiàn)，即為熱譜圖。熱譜圖包含了反應(yīng)過(guò)程的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)信息。

量熱計(jì)可分為間接量熱計(jì)和直接量熱計(jì)。間接量熱計(jì)通過(guò)體系中O2的消耗量及CO2的產(chǎn)量或者某種已知熱容物質(zhì)的溫度變化來(lái)推算待測(cè)體系的熱效應(yīng)。間接量熱計(jì)的對(duì)象是開(kāi)放系統(tǒng)，因此適用于需要?dú)怏w交換的生物個(gè)體生長(zhǎng)代謝的能量代謝測(cè)定。直接量熱計(jì)通過(guò)測(cè)定體系熱流變化從而實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)過(guò)程的熱效應(yīng)。靈敏度很高的直接量熱計(jì)適用于研究生物生理過(guò)程的代謝熱、生物大分子的熱動(dòng)力學(xué)性質(zhì)、生物大分子與小分子或者生物大分子之間相互作用的熱效應(yīng)。

高度靈敏的微量熱法如差示掃描量熱法(DSC)、恒溫滴定量熱法(ITC)和熱活性微量熱法(TAM)等，可用于研究簡(jiǎn)單分子相互作用和理解構(gòu)效關(guān)系，也用于理解和預(yù)測(cè)生物系統(tǒng)的復(fù)雜非線(xiàn)性行為。量熱法以各種運(yùn)動(dòng)形式產(chǎn)生的熱效應(yīng)為研究對(duì)象8，揭示能量變化規(guī)律和定量能量轉(zhuǎn)化。量熱方法中，由熱信號(hào)提供生物過(guò)程的動(dòng)力學(xué)及化學(xué)計(jì)量學(xué)相關(guān)的實(shí)時(shí)信息，可有效獲取化學(xué)反應(yīng)和生命相關(guān)過(guò)程的焓變(ΔH)、熵變(ΔS)、吉布斯自由能變化(ΔG)、平衡常數(shù)(K)和結(jié)合計(jì)量數(shù)(n)等系列熱力學(xué)參數(shù)，這些參數(shù)可以體現(xiàn)單個(gè)物質(zhì)的熱力學(xué)特性，也能反映化學(xué)反應(yīng)中相關(guān)分子的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及其作用機(jī)制9。

量熱學(xué)在生命科學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用十分廣泛，可以用來(lái)描述生態(tài)系統(tǒng)、生物進(jìn)化等宏觀(guān)過(guò)程，也可以觀(guān)測(cè)個(gè)體和細(xì)胞生長(zhǎng)、線(xiàn)粒體代謝狀況，還可以研究酶促反應(yīng)、小分子與生物大分子相互作用等分子水平的生命科學(xué)微觀(guān)問(wèn)題。

2 量熱法在生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用

全球變暖引發(fā)了一系列生態(tài)問(wèn)題，全球碳循環(huán)中最大的通量之一，是土壤有機(jī)質(zhì)降解從土壤表面排放二氧化碳。土壤微生物代謝活性是評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量的普適指標(biāo)10，土壤中生物的生長(zhǎng)代謝、物質(zhì)的理化過(guò)程往往伴隨著熱量釋放。熱量釋放通常是一種非選擇性信號(hào)，應(yīng)用等溫微量熱技術(shù)，非特異性地監(jiān)測(cè)和記錄土壤微生物代謝特征，極大地推動(dòng)了復(fù)雜土壤體系微生物代謝研究。

為了更系統(tǒng)地監(jiān)測(cè)土壤微生物動(dòng)態(tài)，為早期預(yù)警提供實(shí)驗(yàn)方法和數(shù)據(jù)，Hansen等11通過(guò)量熱儀模擬極端熱浪，研究了溫度對(duì)不同土壤類(lèi)型的有機(jī)質(zhì)分解速率的影響，如圖 1顯示了兩種土壤樣品的平均熱速率、酶催化氧化速率和直接氧化速率隨溫度的變化。有機(jī)質(zhì)直接氧化和酶催化氧化兩類(lèi)反應(yīng)在正常環(huán)境溫度下同時(shí)存在，一起組成土壤有機(jī)質(zhì)礦化過(guò)程，而其對(duì)土壤有機(jī)質(zhì)礦化速率的相對(duì)貢獻(xiàn)隨溫度、土壤類(lèi)型等因素的變化而變化。

圖1 兩種土壤樣品平均熱速率(紅線(xiàn))、直接氧化速率(藍(lán)線(xiàn))和酶催化氧化速率(綠線(xiàn))隨溫度變化趨勢(shì)11Fig. 1 An easily recognizable change of the averaged heat rates (red lines), direct oxidation rates (blue lines) and enzyme catalyzed oxidation rates (green lines) increasing trend with temperature in two samples 11.

Barros等12用熱呼吸法，測(cè)定了經(jīng)4 °C下儲(chǔ)存后的土壤樣品對(duì)土壤中微生物代謝的變化，得到了微生物代謝的產(chǎn)熱速率和二氧化碳產(chǎn)生速率。結(jié)果表明土壤有機(jī)質(zhì)越不穩(wěn)定，土壤中的微生物代謝多樣性越高，說(shuō)明微生物代謝降解碳水化合物的能力強(qiáng)，且對(duì)貯藏條件更敏感。這為實(shí)驗(yàn)中土壤樣品的合理保存提供指導(dǎo)。Barros等13用熱分析方法，結(jié)合核磁共振法，研究了六種不同碳含量樣品的熱性質(zhì)、其土壤有機(jī)質(zhì)的結(jié)構(gòu)和組成。證明可以利用差示掃描量熱法(DSC)和熱重法(TG)快速準(zhǔn)確檢測(cè)土壤總碳含量，推測(cè)土壤總能量含量。

Xu等14通過(guò)土壤熱力學(xué)參數(shù)，研究不同微生物對(duì)不同碳基質(zhì)的代謝能力差異，證明了細(xì)菌和真菌是土壤有機(jī)質(zhì)最重要的分解者，且用微量熱法可以量化土壤微生物對(duì)碳的利用效率。Karina與其合作者15,16評(píng)價(jià)改良土壤中的酶活性，研究熱效應(yīng)與纖維素酶、蛋白酶和尿素酶活性的關(guān)系，結(jié)果顯示牛糞、城市污水污泥、蚯蚓糞來(lái)源的酶活性依次降低。證明了微量熱法是分析土壤中微生物和酶活性的有力工具，可以幫助更好地了解土壤微生物代謝的動(dòng)態(tài)。

Anne等17利用微量熱法，監(jiān)測(cè)了來(lái)自酵母廢水處理廠(chǎng)的硫酸鹽還原菌(SRB)的厭氧消化過(guò)程，并測(cè)量SRB的生長(zhǎng)速率。Nabil等18測(cè)定以乙醇為溶劑的低壓(LP)萃取和以二氧化碳和乙醇為共溶劑的亞臨界流體(SF)萃取所得的廢咖啡提取物的抗氧化活性差異，表明LP提取物具有比SF提取物更高的抗氧化能力。兩種提取物抗氧化活性結(jié)果都表明廢咖啡顯示出作為抗氧化劑的巨大潛力，研究結(jié)果可為生態(tài)系統(tǒng)管理維護(hù)提供依據(jù)，證明量熱法具有作為通用抗氧化劑和促氧化劑活性分析的能力。

3 量熱法在組織和器官研究中的應(yīng)用

量熱法在組織和器官研究中的應(yīng)用，主要指對(duì)離體動(dòng)植物組織和器官的量熱學(xué)研究。Kamrul等19應(yīng)用恒溫微量熱法，檢測(cè)到分別經(jīng)抗壞血酸溶液、脈沖光和紫外-可見(jiàn)光處理后，鮮切蘋(píng)果的產(chǎn)熱量急劇下降。微量熱數(shù)據(jù)與其他技術(shù)所得結(jié)果(乙烯產(chǎn)生量、酸堿度、顏色、質(zhì)地、味道)的結(jié)合，可以幫助比較食品工業(yè)中不同處理對(duì)新鮮水果的影響。Kamrul等20基于抗氧化劑和漿果提取物與過(guò)氧化氫反應(yīng)過(guò)程中的產(chǎn)熱，在恒溫條件下(25 °C)測(cè)定其清除自由基的活性。量熱法能直接、同時(shí)提供抗氧化劑或天然提取物清除自由基反應(yīng)的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，即過(guò)氧化氫反應(yīng)的焓(ΔH)和速率常數(shù)(k)等。Haman等21提出了一種基于A(yíng)IBN(2,2’-偶氮雙(2-甲基丙腈))與親脂性抗氧化劑反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)熱的測(cè)定氧化應(yīng)激的方法。在沒(méi)有抗氧化劑時(shí)，AIBN產(chǎn)生放熱峰；在抗氧化劑的存在下，這種峰值會(huì)延遲。根據(jù)延遲的程度，對(duì)樣品自由基清除活性可以進(jìn)行簡(jiǎn)單而直接的估計(jì)。采用等溫量熱法，通過(guò)與AIBN的反應(yīng)，測(cè)定合成抗氧化劑和天然親油性抗氧化劑(五種特級(jí)初榨橄欖油樣品)的自由基清除活性。各抗氧劑的量熱結(jié)果與DPPH測(cè)定結(jié)果呈正相關(guān)，特級(jí)初榨橄欖油的量熱結(jié)果與總酚含量呈正相關(guān)。

Ksenia等22采用等溫微量熱法，對(duì)葡萄經(jīng)釀酒酵母接種后的發(fā)酵能力進(jìn)行了分析，葡萄栽培期間使用草甘膦除草，降低了葡萄的酵母生長(zhǎng)速度，而尿素施肥可增強(qiáng)酵母生長(zhǎng)能力。Rakhmatullina等23研究了一氧化氮(NO)對(duì)小麥幼苗耗氧量、產(chǎn)熱及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響。用微量熱計(jì)，通過(guò)電子順磁共振(EPR)、呼吸法(氣體計(jì)量法)、產(chǎn)熱法測(cè)定NO。結(jié)果表明NO的生成伴隨著小麥幼苗呼吸頻率下降約30%，持續(xù)了5-6 h。說(shuō)明植物組織的過(guò)量NO會(huì)導(dǎo)致能量交換的減速、超微結(jié)構(gòu)的紊亂和細(xì)胞死亡。

4 量熱法在細(xì)胞水平上的研究

對(duì)動(dòng)物細(xì)胞和微生物細(xì)胞的量熱學(xué)研究，可以說(shuō)是量熱學(xué)在生命科學(xué)研究的主要領(lǐng)域。微量熱法在微生物研究工作中的應(yīng)用主要包括細(xì)菌分類(lèi)鑒定、細(xì)菌生長(zhǎng)代謝及其規(guī)律、藥物對(duì)微生物生長(zhǎng)的抑制作用、結(jié)合動(dòng)力學(xué)原理，研究微生物生長(zhǎng)代謝熱動(dòng)力學(xué)特征等24。大量實(shí)驗(yàn)證明，微量熱在無(wú)干擾地監(jiān)測(cè)微生物的正?；顒?dòng)和固有代謝過(guò)程、定量描述微生物生長(zhǎng)代謝過(guò)程、藥物和毒物對(duì)微生物生長(zhǎng)代謝影響等方面的作用顯著。

根據(jù)細(xì)菌生長(zhǎng)熱譜曲線(xiàn)以及得到的熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)，郜丹等25以微生物生長(zhǎng)速率大于零及熱功率差值大于三倍基線(xiàn)噪音為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，以7種常見(jiàn)微生物為對(duì)象，測(cè)定了各菌株單獨(dú)和混合培養(yǎng)的生長(zhǎng)熱譜曲線(xiàn)和檢出時(shí)間。較常規(guī)方法，生物熱動(dòng)力學(xué)有實(shí)時(shí)、快速、靈敏度高、適用性好的優(yōu)點(diǎn)。Winkelmann等26應(yīng)用量熱計(jì)對(duì)不溶于水的碳源(正十四烷和正十六烷)對(duì)乳白色葡萄球菌的生長(zhǎng)影響進(jìn)行了研究，建立了微生物生長(zhǎng)過(guò)程熱動(dòng)力學(xué)方程。實(shí)踐證明，量熱法適用于研究多相體系中的微生物代謝過(guò)程。Russel等27設(shè)計(jì)了一種新型的LED照明的恒溫微量熱法，將微藻的熱力學(xué)行為記錄為功率-時(shí)間曲線(xiàn)，得出微藻的總熱效應(yīng)、最大輸出功率和每個(gè)藻細(xì)胞產(chǎn)熱等指標(biāo)，來(lái)更好地了解藻類(lèi)的二氧化碳固定性能和生長(zhǎng)過(guò)程中的熱力學(xué)行為。

噬菌體大量存在于自然環(huán)境中，可分為烈性噬菌體和溫和噬菌體。溫和噬菌體侵染細(xì)菌后，噬菌體的基因組能夠整合入宿主染色體，整合后的細(xì)菌稱(chēng)為溶源性細(xì)菌。溶源性細(xì)菌在正常環(huán)境中可穩(wěn)定生長(zhǎng)繁殖，并且對(duì)同類(lèi)噬菌體及其近緣噬菌體的侵染具有免疫性。但任何可以引起基因突變的物理、化學(xué)因素，都可能誘導(dǎo)沉默的原噬菌體激活繁殖28。利用細(xì)菌與未感染細(xì)菌之間的代謝熱差異，Xu等29發(fā)現(xiàn)在恒溫微量熱實(shí)驗(yàn)中，溶源細(xì)菌與非溶源細(xì)菌混合體系對(duì)化學(xué)試劑的誘導(dǎo)效應(yīng)高度敏感，可用于化學(xué)試劑對(duì)原噬菌體誘導(dǎo)活性的快速檢測(cè)。該方法工作負(fù)載低、需要誘導(dǎo)藥物極少，且可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)預(yù)防激活效果、適用于自動(dòng)化和高通量測(cè)量。以該快速檢測(cè)方法為基礎(chǔ)，Xu等30研究了CdTe量子點(diǎn)的原噬菌體誘導(dǎo)活性，圖2的量熱結(jié)果發(fā)現(xiàn)分別經(jīng)巰基丙酸(MPA)和谷胱甘肽(GSH)表面修飾的 MPA-CdTe和 GSH-CdTe量子點(diǎn)均能激活原噬菌體，而且MPA-CdTe量子點(diǎn)的誘導(dǎo)活性強(qiáng)于 GSH-CdTe量子點(diǎn)。結(jié)合細(xì)菌內(nèi)活性氧含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性及脂質(zhì)過(guò)氧化水平檢測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)CdTe量子點(diǎn)引起的氧化應(yīng)激是導(dǎo)致原噬菌體誘導(dǎo)的重要原因。在研究宿主細(xì)胞與噬菌體相互作用上，微量熱學(xué)方法可以更快速地得到更多豐富的熱動(dòng)力學(xué)信息。劉國(guó)生等31-33采用微量熱學(xué)方法對(duì)噬菌體侵染大腸桿菌進(jìn)行了研究，通過(guò)對(duì)熱譜曲線(xiàn)數(shù)據(jù)分析，可以得到噬菌體-大腸桿菌系統(tǒng)變化的熱動(dòng)力學(xué)方程、細(xì)胞生長(zhǎng)抑制熱動(dòng)力學(xué)方程、宿主細(xì)胞裂解熱動(dòng)力學(xué)方程等。這些熱力學(xué)信息用于研究噬菌體與宿主之間的相互作用，結(jié)果表明微量熱技術(shù)對(duì)這樣的復(fù)雜系統(tǒng)進(jìn)行研究有著獨(dú)特的優(yōu)越性。在T4噬菌體增殖過(guò)程微量熱研究中，得到了停流法在 37 °C測(cè)定的不同感染復(fù)數(shù)下E. coliB的熱功率曲線(xiàn)(如圖3)。將熱譜曲線(xiàn)的三個(gè)主要峰標(biāo)記為峰 I、峰 II和峰III。在感染復(fù)數(shù)(Multiplicity of Infection，MOI)為2.8 × 10?4時(shí)，熱譜曲線(xiàn)2幾乎與對(duì)照組曲線(xiàn)1重合，說(shuō)明加入的噬菌體樣品因?yàn)槎啻蜗♂屌c加樣隨機(jī)誤差，樣品中的T4噬菌體幾乎為0；曲線(xiàn)3上的峰 I為典型的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)峰，可以看成大腸桿菌的有氧呼吸產(chǎn)熱峰，同時(shí)峰II為肩峰，可看成厭氧生長(zhǎng)產(chǎn)熱峰，峰III為緩慢產(chǎn)熱峰；曲線(xiàn)4、5的峰II也是緩慢產(chǎn)熱峰；MOI為2.8和28的曲線(xiàn)6、7在一個(gè)產(chǎn)熱峰后基線(xiàn)幾乎回到零點(diǎn)，說(shuō)明E.coliB幾乎被完全裂解。通過(guò)對(duì)熱譜曲線(xiàn)數(shù)據(jù)分析可以得到豐富的熱力學(xué)信息，反映 T4噬菌體與宿主細(xì)胞相互作用的關(guān)系。細(xì)胞靜息培養(yǎng)是指在最低限度培養(yǎng)基中研究細(xì)胞生理活性的一種方法，此時(shí)細(xì)胞不能進(jìn)行生長(zhǎng)和繁殖，可避免細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生的大量熱量干擾，劉國(guó)生等32用停流法研究了靜息培養(yǎng)下 T4噬菌體感染大腸桿菌細(xì)胞過(guò)程中兩者的相互作用，計(jì)算得到單個(gè)細(xì)胞的發(fā)熱功率和發(fā)熱量，說(shuō)明感染狀態(tài)下細(xì)菌細(xì)胞代謝速率加快，但繁殖速率明顯下降。

圖2 不同濃度量子點(diǎn)對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)代謝產(chǎn)熱的影響30 Fig. 2 Dependency of the metabolic heat production rate of E. coli on the dosage of MPA-CdTe and GSH-CdTe QDs 30.

圖3 T4噬菌體與大腸桿菌生長(zhǎng)的功率-時(shí)間曲線(xiàn)31Fig. 3 Power-time curve recorded from the growth of E. coli B and T4 phages in LBG medium 31.

目前主要通過(guò)視覺(jué)檢查(VI)來(lái)評(píng)估注射藥物溶液的無(wú)菌性，Brueckner等34提出用熱流分析代替視覺(jué)生長(zhǎng)檢測(cè)。他們?cè)u(píng)估了恒溫微量熱測(cè)定法(IMC)作為無(wú)菌控制的VI的替代品的可能性，發(fā)現(xiàn)IMC可以檢測(cè)到所有接種樣品中的微生物生長(zhǎng)，并且在92%的樣品中檢測(cè)到微生物生長(zhǎng)的速度明顯快于VI。IMC的可靠性和靈敏度對(duì)提高無(wú)菌控制有很大的潛力。

以微生物和人工培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞為模型，研究藥物分子的藥理和毒性作用，也是目前比較活躍的研究領(lǐng)域。結(jié)合微量熱方法，定量研究藥物對(duì)細(xì)胞模型生長(zhǎng)代謝過(guò)程影響，可為發(fā)現(xiàn)和篩選有效抗癌藥物、探究藥物作用機(jī)理和探索最佳用藥配比，提供可靠的數(shù)據(jù)和指導(dǎo)。用含銀傷口敷料治療，已成為在愈合過(guò)程中消除機(jī)會(huì)性傷口病原體生長(zhǎng)的普遍策略。考慮到銀的成本及其可能產(chǎn)生的副作用，人們?cè)诖_保銀在傷口環(huán)境中達(dá)到最低殺菌濃度(MBC)的同時(shí)，希望傷口敷料中含有盡量少的銀活性成分。Gaisford等35報(bào)導(dǎo)了一種采用熱活性微量熱法(TAM)測(cè)定傷口敷料中銀功效的定量方法，測(cè)得銀對(duì)銅綠假單胞菌的MBC為1 ×10?4mol·L?1。采用該方法，Jawal等36測(cè)定了含銀敷料對(duì)銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌兩種常見(jiàn)傷口病原體的療效。實(shí)驗(yàn)在營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基和模擬傷口液中進(jìn)行。模擬傷口液且厭氧條件下銀的最低抑菌濃度和最低殺菌濃度較高。結(jié)果表明了藥品在生物相關(guān)介質(zhì)中試驗(yàn)和進(jìn)行體外分析的重要性，也說(shuō)明該方法在生物體和生長(zhǎng)介質(zhì)改變時(shí)也能很好的應(yīng)用。

恒溫微量熱法已被廣泛應(yīng)用于評(píng)價(jià)抗生素對(duì)細(xì)菌和真菌生物膜嵌壁細(xì)胞的殺菌活性37,38。細(xì)菌生物膜對(duì)傳統(tǒng)的抗菌治療有很高的抵抗力，最近烈性噬菌體被重新評(píng)估為在生物膜中也能殺死抗生素抗性細(xì)菌的有效藥劑。Tkhilaishvili等39使用等溫微量量熱法評(píng)估T3噬菌體與浮游和生物膜大腸桿菌TG1的相互作用。將T3與大腸桿菌TG1一起孵育，在較低的噬菌體濃度(103PFU·mL?1)下，對(duì)浮游和生物膜中的產(chǎn)熱都有很強(qiáng)的抑制作用。

5 量熱法在亞細(xì)胞水平上的應(yīng)用

亞細(xì)胞水平上的微量熱研究，主要集中在線(xiàn)粒體和細(xì)胞膜/模擬細(xì)胞膜上。為了改進(jìn)生物分子相互作用研究，有必要建立熱力學(xué)模型部分替代昂貴且精細(xì)的實(shí)驗(yàn)。

微量熱法在生物膜的研究中具有很大的潛力，由飽和脂質(zhì)和不飽和脂質(zhì)組成的二元脂質(zhì)混合物，是細(xì)胞膜的重要模型。Wu等40研究了飽和和不飽和磷脂二元混合物分子水平的相變圖。利用氘化二鋁酰磷脂酰膽堿(DPPC-d(62))和氫化二元醇磷脂酸(DOPA)，差示掃描量熱法分別分析兩種脂質(zhì)組分的熱致相變過(guò)程，實(shí)驗(yàn)中觀(guān)察到單一吸熱峰。結(jié)合傅立葉變換紅外光譜，表明兩種脂質(zhì)在熱致相變后的尾部區(qū)域有非同步構(gòu)象重排。給出了由飽和脂肪和不飽和脂肪組成的二元脂質(zhì)混合物中單組分脂質(zhì)的熱致相變速率，該方法可以擴(kuò)展到揭示各種其他脂質(zhì)混合物(如脂質(zhì)筏)或表面活性劑混合物中相轉(zhuǎn)變過(guò)程的分子機(jī)制。Wu等41用微量熱法和圓二色譜法，研究了溶菌酶分子在雙親水性嵌段共聚物，甲氧基聚乙二醇5K嵌段聚天冬氨酸鈉鹽 10(MPEG5K-B-PLD10)存在下的展開(kāi)和再折疊行為。結(jié)果表明，天然溶菌酶在加熱和冷卻時(shí)呈現(xiàn)可逆的展開(kāi)和再折疊，而處于新折疊狀態(tài)(與聚合物帶相反電荷的 PLD段復(fù)合)的溶菌酶因?yàn)槭ゲ糠秩?jí)結(jié)構(gòu)且二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，熱穩(wěn)定性降低，在加熱時(shí)可以展開(kāi)，但是在隨后冷卻時(shí)不能再折疊。由于生物膜難以在密閉安瓿中生長(zhǎng)和維持，其應(yīng)用往往局限于監(jiān)測(cè)已建立的生物膜的活性。

圖4 流動(dòng)量熱計(jì)的示意圖42Fig. 4 Schematic representation of the flow calorimeter 42.

Jawal等42使用流動(dòng)系統(tǒng)從外部連續(xù)供應(yīng)營(yíng)養(yǎng)素的方法，允許生物膜在安瓿內(nèi)形成，從而實(shí)現(xiàn)直接實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)能量變化。實(shí)驗(yàn)觀(guān)測(cè)到金黃色葡萄球菌處于生物膜內(nèi)時(shí)，對(duì)抗菌劑的抗性增強(qiáng)，同時(shí)證明該流動(dòng)系統(tǒng)可用于在醫(yī)用級(jí)塑料上建立和監(jiān)測(cè)生物膜的形成和生長(zhǎng)。設(shè)計(jì)的流動(dòng)量熱計(jì)的簡(jiǎn)單系統(tǒng)(如圖 4)主要包括外部生物反應(yīng)器、TAM 量熱儀和廢水箱。生物反應(yīng)器通過(guò)夾套水浴保持在37 °C，其中的介質(zhì)通過(guò)硅膠管進(jìn)入TAM系統(tǒng)。在TAM中，待測(cè)介質(zhì)先經(jīng)過(guò)熱交換線(xiàn)圈以保持與量熱計(jì)內(nèi)溫度一致，接著進(jìn)入與安瓿瓶入口連接的不銹鋼管，不銹鋼管在充滿(mǎn)傳熱介質(zhì)的安瓿瓶中盤(pán)繞后與安瓿瓶出口相連。蠕動(dòng)泵安裝在流出管中，維持介質(zhì)循環(huán)速度為4 mL·h?1。Sanatan等43用等溫滴定量熱法研究了油酸對(duì)腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心臟線(xiàn)粒體損傷的保護(hù)作用。與腎上腺素體外孵育后，線(xiàn)粒體膜的脂質(zhì)過(guò)氧化和蛋白質(zhì)羰基化水平升高，谷胱甘肽含量降低，線(xiàn)粒體形態(tài)、膜電位和完整性改變。當(dāng)線(xiàn)粒體在體外與腎上腺素和油酸共孵育時(shí)，所有這些變化得到明顯改善，結(jié)合早期研究說(shuō)明油酸可以是一種有效的心臟保護(hù)抗氧化劑。Dong等44研究了牛血清白蛋白(BSA)包覆的超小銀納米團(tuán)簇(NCS)對(duì)離體大鼠肝線(xiàn)粒體的生物學(xué)效應(yīng)。闡明Ag-BSA-NCS通過(guò)兩種不同方式的協(xié)同作用誘導(dǎo)線(xiàn)粒體功能障礙：(1)通過(guò)與線(xiàn)粒體膜磷脂雙層相互作用，誘導(dǎo)線(xiàn)粒體膜通透性轉(zhuǎn)變(MPT)；(2)通過(guò)產(chǎn)生活性氧(ROS)，造成線(xiàn)粒體呼吸損傷。首次提出并闡述了超小尺寸納米顆粒(約2 nm)在亞細(xì)胞水平的生物學(xué)效應(yīng)。

Zhao等45采用微量熱法，分析了Gd3+對(duì)體外線(xiàn)粒體的影響。Yang等46研究了聚羥基富勒烯C60(OH)44對(duì)分離線(xiàn)粒體的影響。Lai等47研究了不同粒徑的GSH-CdTe量子點(diǎn)對(duì)線(xiàn)粒體的毒性作用，同時(shí)證明量子點(diǎn)與蛋白質(zhì)的結(jié)合親和力高于磷脂。Shore等48將熱力學(xué)分析與分子模型和結(jié)構(gòu)測(cè)定相結(jié)合，研究了一種基于尿素的親環(huán)素小分子對(duì)線(xiàn)粒體的保護(hù)作用。袁蓮等49-54使用熱活性檢測(cè)儀(TAM)和等溫滴定量熱儀(ITC)，研究了經(jīng)一系列藥物(呼吸抑制劑、有機(jī)砷、Ca2+、In3+、Ag+、Gd3+等)作用后，離體線(xiàn)粒體的實(shí)時(shí)產(chǎn)熱功率、總產(chǎn)熱量、新陳代謝速率常數(shù)等熱力學(xué)參數(shù)，同時(shí)獲得線(xiàn)粒體代謝加快或減慢、活性增加或減小等信息。

6 分子水平的量熱學(xué)研究

生物大分子包括核酸、蛋白質(zhì)、生物多糖和脂質(zhì)，是構(gòu)成生命的基礎(chǔ)。生物大分子的空間構(gòu)象、熱力學(xué)穩(wěn)定性等，與其生物活性和生物學(xué)功能直接相關(guān)。量熱法很好的用于生物大分子結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的熱分析研究。Frank等55以比較的方法來(lái)確定紅球菌和混合細(xì)菌培養(yǎng)物使用表面活性劑作為唯一碳源和能源的能力。這些表面活性劑包括鼠李糖醇、槐糖脂和海藻糖四酯及Tween 80。量熱法、熱力學(xué)計(jì)算、質(zhì)譜、高效液相色譜以及生物量測(cè)定的結(jié)果說(shuō)明，純培養(yǎng)物的紅球菌只能夠利用表面活性劑Tween 80；混合細(xì)菌培養(yǎng)物能夠使用所有選定的表面活性劑作為唯一的碳和能源，但只有鼠李糖脂被完全降解，其他表面活性劑僅發(fā)生了初級(jí)降解。其中每摩爾碳的焓變作為評(píng)估降解程度的重要參數(shù)，說(shuō)明量熱法是識(shí)別復(fù)雜分子降解途徑中特征的有力工具。Goldber等56報(bào)道了四種纖維素同素異形體(非晶態(tài)纖維素、纖維素I、纖維素II和纖維素III)在25 °C下水解為結(jié)晶無(wú)水α-D-葡萄糖的熱動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，以及四種同素異形體從2 K到300 K的熱容量。Marko等57報(bào)道了纖維素水解的熱力學(xué)數(shù)據(jù)以及平衡葡萄糖濃度，測(cè)定了葡萄糖水溶液的活度系數(shù)與溫度的函數(shù)。隨著溫度的升高，反應(yīng)ΔG變得更負(fù)，這表明在更高溫度下生產(chǎn)纖維素生物燃料會(huì)有更高的轉(zhuǎn)化率。同時(shí)，全球變暖會(huì)加速纖維素被土壤微生物降解為二氧化碳和水的過(guò)程，通過(guò)正反饋加速全球變暖。Liu等58采用過(guò)氧化氫預(yù)處理及胃蛋白酶水解的方法，提取蛇頭皮中的胃蛋白酶可溶性膠原蛋白，并經(jīng)氨基酸分析、紫外光譜和差示掃描量熱法證實(shí)了膠原蛋白較高的純度和熱穩(wěn)定性。

Marco等59報(bào)道了一種能表征固定化酶活性和穩(wěn)定性的量熱法。以固定在尼龍-6納米纖維膜上的轉(zhuǎn)化酶為研究對(duì)象，采用分光光度法和恒溫滴定量熱法，測(cè)定了固定化和游離轉(zhuǎn)化酶活性和穩(wěn)定性；采用差示掃描量熱法，測(cè)定了膜上轉(zhuǎn)化酶結(jié)構(gòu)的熱穩(wěn)定性和表面濃度，證明ITC可用于測(cè)定固定在膜上的酶的活性和穩(wěn)定性。Neha等60通過(guò)量熱，測(cè)定了在不同溫度下NaH2PO4、NH4H2PO4和K3PO4水溶液中各種糖及其衍生物的熱變化。Gennady等61對(duì)纖維素、淀粉和葡萄糖形成左旋葡萄糖的平衡進(jìn)行了熱力學(xué)分析。用絕熱量熱法，測(cè)定了在5-370 K左旋葡聚糖的熱容量。用差示掃描量熱法，測(cè)定了該化合物的固相轉(zhuǎn)變和熔融的溫度和焓。從得到的結(jié)果計(jì)算出在0-384 K左旋葡聚糖晶體的熱力學(xué)性質(zhì)。Wu等62采用加熱-冷卻-再加熱方案，研究了溶菌酶在負(fù)電荷聚電解質(zhì)-聚苯乙烯磺酸鈉(PSS)存在下的展開(kāi)和再折疊行為。納瓦差示掃描量熱(nano DSC)和CD光譜法結(jié)果表明，溶菌酶與PSS的絡(luò)合作用能顯著改變?nèi)芫傅恼郫B和復(fù)性行為。這種加熱-冷卻-再加熱的過(guò)程，可以提供有關(guān)聚電解質(zhì)復(fù)合蛋白的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的線(xiàn)索，該方法也可用于研究目標(biāo)蛋白在其他含蛋白質(zhì)混合物中的展開(kāi)和重折疊細(xì)節(jié)。

微量熱法同時(shí)適合用于生物大分子與其他小分子相互作用的熱力學(xué)研究。Catherine等63研究了鋁、鎳和鎘三種典型金屬離子與DNA的作用及其核酸毒性，等溫滴定法結(jié)果表明Al3+、Cd2+、Ni2+可強(qiáng)烈結(jié)合DNA的磷酸基團(tuán)，生理?xiàng)l件下Cd2+、Ni2+具有遺傳毒性。而隨pH升高，金屬鋁的主要離子種類(lèi)由Al3+變?yōu)閇Al(OH)4]?，不再能與DNA強(qiáng)烈結(jié)合。實(shí)驗(yàn)結(jié)果強(qiáng)調(diào)了細(xì)胞內(nèi)的pH范圍變化的作用。

Burova等64采用比濁法、高靈敏度差示掃描量熱法和等溫滴定量熱法，研究了可生物降解陰離子聚磷腈(PCPP)與蛋清溶菌酶模型球蛋白的相互作用，得到了相應(yīng)的結(jié)合常數(shù)、協(xié)同性參數(shù)和結(jié)合焓。Escoba等65用差示掃描量熱法，研究了新的潛在抗癌藥物與二巰基磷膽堿(DMPC)脂質(zhì)體的相互作用。Boros等66用差示掃描量熱法、圓二色譜和核磁共振光譜以及分子動(dòng)力學(xué)模擬，研究了絲氨酸蛋白酶抑制劑的穩(wěn)定性、分子結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)。Krauss等67采用等溫滴定量熱法，測(cè)量了小鼠抗c-myc抗體與其表位肽的相互作用，得到典型的焓-熵補(bǔ)償數(shù)據(jù)。

冷凍條件會(huì)影響?hù)~(yú)類(lèi)肌肉蛋白質(zhì)功能，引起蛋白質(zhì)的變性和聚集。然而，洪堡魷魚(yú)(Dosidicus gigas)肌肉蛋白的功能在冷凍后仍保持穩(wěn)定，這可能是由于存在作為低溫保護(hù)劑的低分子量化合物(LMMC)。álvarez-Armenta等68利用傅立葉變換紅外光譜法，測(cè)定LMMC的主要成分為游離氨基酸(精氨酸、肌氨酸和?；撬岬?、碳水化合物(單糖葡萄糖、巖藻糖、阿拉伯糖等)、氯化銨等，同時(shí)通過(guò)差示掃描量熱法，驗(yàn)證了LMMC可賦予蛋白質(zhì)低溫穩(wěn)定性。

Wu等69在研究多肽Gly-Asn-Gly-Ser-Gly-Tyr-Val-Ser-Arg對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)的抑制機(jī)制時(shí)，采用等溫滴定量熱法測(cè)定肽與ACE結(jié)合反應(yīng)的熱力學(xué)特征，結(jié)果暗示多肽在反應(yīng)過(guò)程中分解并起到了底物型抑制劑的作用。

Yang等70應(yīng)用各種光譜測(cè)量技術(shù)和等溫滴定量熱法(ITC)，研究了富勒烯與牛血清白蛋白(BSA)和γ-球蛋白之間的相互作用。ITC結(jié)果表明，富勒烯與BSA之間的相互作用是放熱過(guò)程(ΔH＜0)，與γ-球蛋白的相互作用是吸熱過(guò)程(ΔH＞ 0)。結(jié)合多種分析技術(shù)結(jié)果，提出了蛋白質(zhì)在納米顆粒上的絡(luò)合涉及兩個(gè)同時(shí)發(fā)生的過(guò)程，即非共價(jià)鍵形成(ΔH＜ 0, ΔS＜ 0)和溶劑重組(ΔH＞ 0, ΔS＞0)。Zhang等71通過(guò)ITC和其他光譜技術(shù)，研究了抗壞血酸(ASA)與人血清白蛋白(HSA)的相互作用，并通過(guò)ITC判斷小分子與蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。

7 結(jié)語(yǔ)

從內(nèi)在生物過(guò)程(生長(zhǎng)發(fā)育、厭氧消化、兩相生物催化、蛋白質(zhì)相互作用、核酸穩(wěn)定性)、過(guò)程分析(芯片量熱法和生物傳感器)，到下游加工(生物分離)和環(huán)境過(guò)程(廢水回收以及土壤微生物檢測(cè))等，生物量熱的應(yīng)用范圍十分廣泛，而且正在迅速地增加。隨著微量熱儀在測(cè)溫精度、控溫穩(wěn)定性、自動(dòng)化和多功能化發(fā)展等方面的巨大發(fā)展和進(jìn)步，微量熱技術(shù)在未來(lái)的生命科學(xué)領(lǐng)域必將扮演更重要的角色。同時(shí)，由于生物量熱法自身缺乏特異性，無(wú)法直接獲得分子層面信息等局限，相信在未來(lái)會(huì)有越來(lái)越多的量熱法與多種分析技術(shù)結(jié)合的、多領(lǐng)域應(yīng)用(尤其生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)中應(yīng)用)的研究成果。