低鈣高鎂人工腦脊液對(duì)大鼠腦片臂旁外側(cè)核神經(jīng)元溫度敏感性的影響#

鄧杰文 胡紅利 楊培培 黃成 趙曦 全俊如 許莉 張錄順 張潔△

（1.成都醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610500；2.成都醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610500；3.成都醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610500）

根據(jù)溫度敏感性是否依賴于突觸傳遞，體溫中樞視前區(qū)（Preoptic area，POA）的溫敏神經(jīng)元分為固有溫敏神經(jīng)元和條件溫敏神經(jīng)元兩類。灌流低鈣高鎂人工腦脊液（Artificial cerebrospinal fluid，ACSF）阻斷POA神經(jīng)元突觸傳遞后，大部分POA熱敏神經(jīng)元保留了溫敏性，其溫敏機(jī)制源于內(nèi)在離子電導(dǎo)的改變，與突觸傳遞沒(méi)有關(guān)系，屬于固有溫敏神經(jīng)元；與之相反，阻斷突觸傳遞后，所有POA冷敏神經(jīng)元失去了冷敏性，其溫度敏感性是突觸傳遞形成，屬于條件溫敏神經(jīng)元[1-2]。

臂旁外側(cè)核（Lateral parabrachial nucleus，LPBN）能夠?qū)⒔?jīng)脊髓傳來(lái)的皮膚溫度信號(hào)直接上傳至POA區(qū)，參與了自主性和行為性體溫調(diào)節(jié)[3-5]。前期研究發(fā)現(xiàn)，大鼠LPBN參與前饋體溫調(diào)節(jié)的三個(gè)亞核（背亞核、中央亞核及外亞核）中均存在對(duì)局部腦溫變化敏感的熱敏神經(jīng)元和冷敏神經(jīng)元[6-8]，但其溫度敏感性是否依賴于突觸傳遞尚不清楚。因此，本研究通過(guò)應(yīng)用腦片膜片鉗技術(shù)，灌流低鈣高鎂ACSF阻斷突觸傳遞，觀察LPBN神經(jīng)元胞外自發(fā)放電活動(dòng)及溫度敏感系數(shù)（m）值的變化，探討LPBN神經(jīng)元溫度敏感性是否是內(nèi)在固有特性，為后續(xù)進(jìn)一步研究LPBN溫敏神經(jīng)元的溫敏形成機(jī)制及其在溫度信息整合中的作用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

健康雄性SD大鼠，體重80~150 g，購(gòu)自成都達(dá)碩生物醫(yī)學(xué)科技有限公司。玻璃電極購(gòu)自Sutter公司。HEPES、Na2GTP、葡萄糖酸鉀、EGTA、MgATP購(gòu)自Sigma公司。ACSF成分（mmol?L-1）：NaCl 124，MgSO41.3，CaCl22.4，KCl 5，KH2PO41.24，NaHCO326，葡萄糖 10（滲透壓 300 mOsm?kgH2O-1，pH 7.4）。低鈣高鎂ACSF成分（mmol?L-1）：NaCl 119，MgSO411.4，CaCl20.2，KCl 5，KH2PO41.24，NaHCO326，葡萄糖 10（滲透壓 300 mOsm?kgH2O-1，pH 7.4）。電極內(nèi)液成分（mmol?L-1）：葡萄糖酸鉀 130，Na2GTP 2，MgATP 2，HEPES 10，CaCl21，EGTA 10（滲透壓 290 mOsm?kgH2O-1，pH 7.2）。

1.2 LPBN大鼠腦薄片的制備

雄性SD大鼠以4%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，迅速斷頭取腦，制備含LPBN的腦干塊[6-8]。用502膠將腦干塊粘貼于振動(dòng)切片機(jī)標(biāo)本盤(pán)內(nèi)進(jìn)行振動(dòng)切片。當(dāng)一月牙形透明區(qū)出現(xiàn)在腦橋頭端背外側(cè)緣，表明已達(dá)LPBN吻端，開(kāi)始切取腦片。通常可切取2至3片含LPBN的腦薄片（300 μm厚）。

1.3 腦片膜片鉗實(shí)驗(yàn)

按參照文獻(xiàn)方法孵育腦片，并選取狀態(tài)良好的LPBN神經(jīng)元進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[6-8]。電極阻抗為4～7 MΩ，調(diào)整三維微推進(jìn)器（MPC 200 Sutter Instruments,USA），使電極尖端與細(xì)胞膜表面接觸，適當(dāng)給予負(fù)壓抽吸，形成細(xì)胞貼附式構(gòu)型，然后轉(zhuǎn)換至電流鉗以記錄LPBN神經(jīng)元的胞外自發(fā)放電，放電信號(hào)經(jīng)放大器（EPC-10，HEKA，Germany）放大后，通過(guò)Patchmaster軟件進(jìn)行信號(hào)采集，低通濾波為2 KHz，采樣頻率為10 KHz。

記錄36℃～37℃范圍內(nèi)LPBN神經(jīng)元基礎(chǔ)放電活動(dòng)后，在32℃～40℃范圍內(nèi)快速改變?cè)∫簻囟龋瑱z測(cè)LPBN神經(jīng)元自發(fā)放電頻率的變化[6-8]。將放電頻率和局部腦溫之間的線性回歸系數(shù)定義為溫度敏感系數(shù)m值（Impulses），根據(jù)m值來(lái)確定LPBN神經(jīng)元溫度敏感性。m值≥0.8 imp·s-1·℃-1定義為熱敏神經(jīng)元，m值絕對(duì)值≤0.2 imp·s-1·℃-1定義為低等斜率的溫度不敏感神經(jīng)元，溫度敏感系數(shù)m值>0.2 imp?s-1·℃-1和m值＜0.8 imp?s-1·℃-1定義為中等斜率的溫度不敏感神經(jīng)元[6-8]。鑒定神經(jīng)元溫敏感性后，灌流低鈣高鎂ACSF10~15 min阻斷突觸傳遞，記錄LPBN神經(jīng)元自發(fā)放電活動(dòng)和m值的變化，最后灌流常規(guī)ACSF洗脫10~15 min。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

Patchmaster記錄的原始數(shù)據(jù)經(jīng)ABF Utility轉(zhuǎn)換后，用Clampfit分析，計(jì)算突觸阻斷后各指標(biāo)相對(duì)于突觸阻斷前的變化率。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示，采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，P<0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 低鈣高鎂ACSF對(duì)LPBN神經(jīng)元自發(fā)放電活動(dòng)的影響

表1顯示35個(gè)LPBN自發(fā)放電神經(jīng)元突觸阻斷后放電活動(dòng)和溫度敏感性的變化。灌流低鈣高鎂ACSF阻斷突觸傳遞后，熱敏神經(jīng)元（n=13）和溫度不敏感神經(jīng)元（n=22）的自發(fā)放電頻率變化均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但中等斜率和低等斜率溫度不敏感神經(jīng)元放電頻率都呈現(xiàn)出多樣性改變，如中等斜率溫度不敏感神經(jīng)元（n=11）的放電頻率7個(gè)加快，3個(gè)減慢，1個(gè)無(wú)變化；低等斜率溫度不敏感神經(jīng)元（n=11）的放電頻率6個(gè)加快，3個(gè)減慢，2個(gè)無(wú)變化，見(jiàn)圖1A。灌流低鈣高鎂ACSF阻斷突觸傳遞后，對(duì)三類神經(jīng)元的放電幅度均無(wú)顯著作用（P＞0.05），見(jiàn)表1，圖1B。

表1 突觸阻斷后不同類型LPBN神經(jīng)元放電活動(dòng)和溫度敏感性的變化（±SD）

表1 突觸阻斷后不同類型LPBN神經(jīng)元放電活動(dòng)和溫度敏感性的變化（±SD）

注：與突觸阻斷前比較，*P<0.05。

類別 例 放電頻率（imp?s-1） 放電幅度（mV） m值（imp?s-1·℃-1）阻斷前 阻斷后 阻斷前 阻斷后 阻斷前 阻斷后熱敏神經(jīng)元 13 11.98±1.41 12.15±1.67 12.44±1.86 12.05±2.14 1.01±0.04 1.02±0.06溫度不敏感神經(jīng) 12 8.27±0.98 9.98±1.57 16.96±2.19 17.12±2.75 0.18±0.03 0.42±0.09*

圖1 每個(gè)LPBN低等斜率、中等斜率溫度不敏感神經(jīng)元和熱敏神經(jīng)元突觸阻斷前后放電頻率（A）和放電幅度（B）的變化百分率

2.2 低鈣高鎂ACSF對(duì)LPBN神經(jīng)元溫度敏感性的影響

灌流低鈣高鎂ACSF阻斷突觸傳遞后，熱敏神經(jīng)元m值無(wú)明顯變化（P＞0.05），見(jiàn)表1、圖2。圖3所示是1例熱敏神經(jīng)元，突觸阻斷前m值為 1.09 imp?s-1·℃-1，突觸阻斷后的m值為0.87 imp?s-1·℃-1，洗脫后的m值為0.94 imp?s-1·℃-1，始終保持熱敏性。突觸阻斷后溫度不敏感神經(jīng)元的m值變化顯著（P<0.05），見(jiàn)表1。其中，64%（7/11）的中等斜率溫度不敏感神經(jīng)元m值變化率在70%以上；82%（9/11）低等斜率溫度不敏感神經(jīng)元的m值變化率在140%以上，見(jiàn)圖2。圖4所示低等斜率溫度不敏感神經(jīng)元，突觸阻斷前的m值為0.05 imp?s-1·℃-1，突觸阻斷后的m值增加到1.14 imp?s-1·℃-1，變成熱敏神經(jīng)元，洗脫后，其m值又恢復(fù)為0.05 imp?s-1·℃-1，失去熱敏性。在22例溫度不敏感神經(jīng)元中，有4例出現(xiàn)相似的變化，突觸阻斷后，溫度敏感系數(shù)增加非常明顯，變成了熱敏神經(jīng)元，洗脫后又恢復(fù)為溫度不敏感神經(jīng)元，這4例溫度不敏感神經(jīng)元的放電頻率明顯增加（P<0.01），突觸阻斷前后的放電頻率分別是11.85±5.72 imp?s-1和17.00±5.35 imp?s-1（n=4）。

圖2 每個(gè)LPBN低等斜率、中等斜率溫度不敏感神經(jīng)元和熱敏神經(jīng)元突觸阻斷前后m值的變化百分率

圖3 突觸阻斷前、后和洗脫后LPBN熱敏神經(jīng)元自發(fā)放電頻率和溫度敏感性的變化

3 討論

LPBN能夠?qū)⒔?jīng)脊髓傳來(lái)的皮膚溫度信號(hào)直接上傳至POA區(qū)，引起前饋體溫調(diào)節(jié)反應(yīng)，以維持體溫穩(wěn)定[3-5]。采用腦片膜片鉗技術(shù)，我們?cè)贚PBN參與前饋體溫調(diào)節(jié)的三個(gè)亞核中都發(fā)現(xiàn)對(duì)局部腦溫變化敏感的熱敏和冷敏神經(jīng)元[6-8]。在極端溫度下，當(dāng)前饋體溫調(diào)節(jié)已不能維持體溫穩(wěn)定，或在運(yùn)動(dòng)、攝入冷流體食物、出血等導(dǎo)致體溫的內(nèi)穩(wěn)態(tài)被破壞時(shí)，分布在POA、LPBN等核團(tuán)的溫度敏感神經(jīng)元可監(jiān)測(cè)局部腦溫變化，以負(fù)反饋體溫調(diào)節(jié)的方式來(lái)維持體溫穩(wěn)定[6]。

LPBN除了接受皮膚前饋溫度信號(hào)外，還能感受局部腦溫的變化。，但溫敏形成機(jī)制尚有待研究。在體溫中樞POA區(qū)，灌流低鈣高鎂ACSF阻斷突觸傳遞后，幾乎所有熱敏神經(jīng)元保留了熱敏性；與之相反，突觸阻斷后，所有冷敏神經(jīng)元失去了冷敏性，表明POA神經(jīng)元熱敏性是其內(nèi)在特性，冷敏性則是突觸傳遞形成[1-2]。本實(shí)驗(yàn)采用相似的方法技術(shù)，分析LPBN神經(jīng)元的溫度敏感性是否依賴于局部突觸網(wǎng)絡(luò)，為后續(xù)進(jìn)一步探討其溫敏形成機(jī)制及其在溫度信息整合中的作用打下基礎(chǔ)。

圖4 突觸阻斷前、后和洗脫后LPBN溫度不敏感神經(jīng)元自發(fā)放電頻率和溫度敏感性的變化

我們?cè)贚PBN離體腦片灌流低鈣高鎂ACSF 10~15 min阻斷突觸活動(dòng)后發(fā)現(xiàn)， LPBN熱敏神經(jīng)元在灌流低鈣高鎂ACSF后，放電頻率和幅度并無(wú)顯著改變，其溫度敏感性在突觸阻斷前、后和洗脫后，也無(wú)明顯的變化。說(shuō)明和POA區(qū)相似，LPBN熱敏神經(jīng)元的溫敏特性是其內(nèi)在特性，而不是突觸傳遞形成，屬于固有溫敏神經(jīng)元，其熱敏形成可能與其內(nèi)在離子電導(dǎo)的溫度依賴性變化有關(guān)[1-2,9]。突觸阻斷后，熱敏神經(jīng)元的放電頻率和溫度敏感性幾乎都沒(méi)有發(fā)生變化。提示，LPBN局部的許多突觸聯(lián)系并未投射到熱敏神經(jīng)元，熱敏神經(jīng)元很有可能更多接受的是LPBN以外的突觸聯(lián)系并在此發(fā)生信息整合，如脊髓傳來(lái)的皮膚溫度信息，孤束核傳來(lái)的內(nèi)臟溫度信息，都有可能會(huì)聚到這些熱敏神經(jīng)元并與局部溫度變化信息發(fā)生整合[3]。因此，LPBN極有可能與POA和脊髓相似，既能接受外周傳來(lái)的溫度信息，也能感受局部溫度變化，并將傳入的和局部的溫度信息整合后上傳到體溫中樞POA區(qū)，進(jìn)一步引起體溫調(diào)節(jié)反應(yīng)。

灌流低鈣高鎂ACSF后，LPBN溫度不敏感神經(jīng)元的放電頻率呈多樣性改變，幅度無(wú)明顯變化，m值在突觸阻斷后大多增加。有4例溫度不敏感神經(jīng)元在突觸阻斷后變成了熱敏神經(jīng)元，洗脫后又恢復(fù)為溫度不敏感神經(jīng)元。說(shuō)明這類溫度不敏感神經(jīng)元本身可能具有熱敏性，但其熱敏性被相鄰溫敏神經(jīng)元的突觸活動(dòng)所抑制。例如，與相鄰熱敏神經(jīng)元形成抑制性突觸或與冷敏神經(jīng)元形成興奮性突觸都可能導(dǎo)致其熱敏性被抑制。根據(jù)這些神經(jīng)元突觸阻斷后放電頻率增加的現(xiàn)象，我們推測(cè)這些溫度不敏感神經(jīng)元極有可能接受了相鄰熱敏神經(jīng)元的抑制性突觸輸入，導(dǎo)致其熱敏性被抑制，呈現(xiàn)出溫度不敏感性。但這尚需通過(guò)觀察溫度變化對(duì)溫度不敏感神經(jīng)元抑制性突觸活動(dòng)的影響來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證。

LPBN功能復(fù)雜，除了參與體溫調(diào)節(jié)，還與代謝[10]、心血管[11]等活動(dòng)的調(diào)節(jié)和痛、癢覺(jué)等信息的傳遞有關(guān)[12]。突觸阻斷后，LPBN溫度不敏感神經(jīng)元的放電頻率呈多樣性改變。說(shuō)明許多LPBN局部突觸聯(lián)系投射到溫度不敏感神經(jīng)元，并形成了復(fù)雜的局部突觸網(wǎng)絡(luò)，這些溫度不敏感神經(jīng)元雖然不能感受局部腦溫的變化，但可能參與了其他與體溫調(diào)節(jié)有關(guān)內(nèi)穩(wěn)態(tài)的調(diào)控，如代謝、心血管活動(dòng)的調(diào)節(jié)，突觸阻斷后的多樣性反應(yīng)，也可能與這些神經(jīng)元參與多種功能調(diào)節(jié)有關(guān)。下一步需進(jìn)一步研究其他內(nèi)穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)反饋信號(hào)如葡萄糖、血壓對(duì)溫度敏感及不敏感的神經(jīng)元活動(dòng)的影響。

綜上所述，LPBN熱敏神經(jīng)元屬于固有溫敏神經(jīng)元，其溫敏特性不是突觸傳遞形成，而是其內(nèi)在特性，可能與其內(nèi)在離子電導(dǎo)的溫度依賴性變化有關(guān)。