環(huán)狀RNA 在肝癌進展中的作用及其潛在價值*

姚 敏，楊 婕，姚登福

(1 南通大學醫(yī)學院免疫學系，南通 226001；2 南通大學生命科學學院；3 南通大學附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學研究中心)

肝細胞性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)仍是長江口地區(qū)的主要惡性腫瘤之一[1]。肝癌根治性治療方法包括手術切除和射頻消融等，但大多數(shù)患者診斷時已屬于中、晚期，失去了良好的治療機會[2-3]，小分子核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)的基礎與臨床研究中，顯示非編碼RNA(noncoding RNA,ncRNA)與慢性肝病惡性轉化、肝癌早診、早治及患者預后等密切相關。龐大的ncRNA 家族包括22 bp 的微小RNA(microRNA,miRNA)、20～25 bp 的小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA 或RNAi)、約150 bp 的小核RNA(small nuclear RNA,snRNA)、≥200 bp 的長鏈非編碼RNA(long ncRNA,lncRNA)和環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)等[4]。circRNA 作為ncRNA家族的重要成員，因其環(huán)狀結構高度穩(wěn)定、肝癌組織豐度高及組織相對特異等，參與慢性肝病惡性轉化，其表達改變有望成為肝癌早診與預后評估的新標志或有效治療的新靶點[5]。本文述評了circRNA 在肝癌進展中的潛在價值。

1 CircRNA 生物合成及特點

與線性RNA 不同，circRNAs 為連續(xù)閉環(huán)結構，缺少1 個聚腺苷酸化(polyA)尾部和5′帽，由前信使RNA(mRNAs)反向剪接或外顯子跳躍產(chǎn)生，且直接反向剪接比外顯子跳躍更頻繁[6]。按其組成分為4類：外顯子環(huán)狀RNA(exonic circRNA,E-circRNAs)、外顯子/內含子環(huán)狀RNA(exon-intron circRNAs,EIciRNAs)、環(huán)狀內含子RNA(circular intronic RNAs,ciRNAs)和tRNA 內含子環(huán)狀RNA(tRNA intronic circular RNAs,tricRNAs)。公認環(huán)狀RNA 生物合成，RNA 結合蛋白(RNA binding protein,RBP)介導的、內含子對驅動的和套索驅動，在調節(jié)相鄰剪接位點促進環(huán)狀生物合方面具有重要作用[7-8]。

存在于肝組織或細胞中的circRNA 為非多聚腺苷酸化的、單鏈的、共價閉合的環(huán)狀RNA，因缺少5′或3′末端不易被核酸外切酶作用，比線性RNA 或其它核酸更穩(wěn)定；肝癌組織circRNA 表達豐度高，比線性mRNA 高數(shù)倍以上；circRNA 序列保守，有一定的組織特異性[9]；從生物信息學挖掘的RNA 測序數(shù)據(jù)分析，在哺乳動物基因組中，超過20%的細胞能產(chǎn)生circRNA，且呈多樣性，在細胞分化和調節(jié)信號通路中扮演關鍵角色[10]。

2 CircRNA 功能與機制

CircRNA 在表觀遺傳、轉錄和轉錄后調控水平上發(fā)揮作用，外顯子源性circRNA 大多位于胞漿中發(fā)揮作用，ciRNA 及EI-ciRNA 大多在胞核中發(fā)揮作用，主要方式有：(1)ciRNA 定位在細胞核內，與RNA 聚合酶Ⅱ(polymerase Ⅱ,Pol Ⅱ)結合促進其親本基因表達；(2)EI-ciRNA 定位于胞核與U1 核內小核糖核蛋白質(U1 small nuclear ribonucleo proteins,U1 snRNP)結合形成復合物，再與Pol Ⅱ轉錄復合物結合于親本基因啟動子上，促其親本基因轉錄；(3)外顯子源性circRNA 多數(shù)存在于胞漿的miRNA 海綿(miRNA sponge)發(fā)揮作用；(4)circRNA 直接或間接與RNA 結合蛋白形成RNA-蛋白復合物(RNA-protein complex,RPC)，與基因線性轉錄物相互作用；(5)部分circRNA 含核糖體進入位點(internal ribosome entry site,IRES)可譯成蛋白質，可見circRNA 既是DNA與編碼蛋白間信使，也具阻止其他RNA 鏈翻譯形成蛋白質的功能[11-12]。

競爭性內源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)的miRNA 海綿作用，即ceRNA 特征RNA 分子的生物學功能，通過數(shù)量和種類不等miRNA 反應元件(microRNA response element,MRE)競爭性結合miRNA，降低miRNA 對其靶標的抑制作用。肝circRNA 因表達豐度高半衰期長，是一類強大的ceRNA 分子。經(jīng)典RNA 測序法能分離具有特征性分子“尾巴”的分子。circRNA 有多個miRNA 結合位點，發(fā)揮海綿樣吸收miRNA 作用。circRNA 通過miRNA反應元件競爭性地與miRNA 結合，在轉錄后水平上減少結合mRNA 的miRNA 數(shù)量并調控miRNA 下游靶基因表達。對circRNA 海綿在HCC 發(fā)病中的作用機制認識，將有助于篩選HCC 診斷標志物和研發(fā)治療的有效靶點[13-14]。

3 CircRNA 在肝癌進展中的作用

采用circRNA 微陣列、熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式反應(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR)等技術，研究肝癌患者癌組織和外周血顯示肝癌circRNA 過表達，在肝癌進展中主要有促進[15-19]和抑制[20-24]作用。最近研究發(fā)現(xiàn)部分circRNA 的海綿作用見表1。肝癌circRNA 通過分子海綿作用，經(jīng)微小RNA 靶向目標基因發(fā)揮抑制、促進肝癌細胞增殖或肝癌生長如circRNA_000839 通過與miR-200b 和RhoA 相互作用影響肝癌的進展。

表1 幾種肝癌相關circRNA 與miRNA 分子海綿作用

根據(jù)生物信息學構建的circRNA-miRNA 相互作用網(wǎng)絡分析，circRNA 作用方式有：(1)circRNA 直接靶向目標基因，如hsa_circ_0001649 是在SHPRH(SNF2 histone linker PHD RING helicase)基因座第26 個外顯子和第29 個外顯子間產(chǎn)生，SHPRH 定位于人類染色體6q24 上，是SWI/SNF(SWItch/Sucrose Non-Fermentable)復合物家族的成員(抑癌基因)，它可直接靶向SHPRH 基因發(fā)揮抑癌作用[20]；(2)circRNA 經(jīng)單一miRNA 靶向基因，如癌組織CircC3P1 是由C3P1(complement component 3 precursor pseudogene)基因第27 至第29 個外顯子間產(chǎn)生的，可通過對miR-4641 海綿作用促進PCK1 表達，而發(fā)揮抑癌作用[25]；(3)circRNA 可同時作用于多個miRNA，再靶向目標基因，如癌組織cSMARCA5(hsa_circ_0001 445)表達下調，充當miR-17-3p 和miR-181b-5p 分子海綿促進抑癌基因TIMP3 表達，抑制肝癌細胞增生和轉移[26]；circZFR 則與miR-511-5p、miR-130b-5p、miR-642a-5p、miR-532-3p 及miR-329-5p 相關聯(lián)合發(fā)揮促進肝癌進展的分子海綿作用[27-28]。

4 CircRNA 作為肝癌標志物

甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)是肝癌篩查常用血清學檢查，因靈敏度低早期肝癌易漏診，迫切需要新標志物以提高早期肝癌檢出率。細胞和組織中廣泛存在、以共價閉合外顯子環(huán)形化結構形成的circRNA，在生理和病理過程中發(fā)揮重要的調控作用。從5 例HCC 的10 個樣本測序建立的腫瘤相關數(shù)據(jù)庫(CCRDB)中，共11 501 個circRNA[29]，經(jīng)篩選has_circ_0002130，has_circ_0084615，has_circ_00014 45，has_circ_0001727 和has_circ_0001361 及相應基因或染色體位點，可能是診斷的潛在生物標志物。幾種circRNA 對肝癌診斷的臨床價值見表2[29-35]，盡管不同研究樣本間存在異質性，采用隨機效應模型的Meta 分析circRNA，顯示對肝癌診斷的靈敏度為0.82，特異性為0.72，綜合受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve,ROC)的曲線下面積(area under curve,AUC)為0.84，提示circRNA是有助于HCC 診斷與鑒別的分子標志物[36-37]。

表2 幾種circRNA 異常表達對肝癌診斷的臨床價值評估

AUC 在診斷的靈敏度和特異性方面，circRNA優(yōu)于AFP。circRNA 和血AFP 聯(lián)檢，具有互補診斷價值，如AFP 結合Hsa_circ_0003998，診斷靈敏度可達94.7%[31]。以circRNA 微陣列技術分析組織中hsa_circ_0000130 的表達，顯示肝癌組織明顯高于自身對照的癌周組織，低表達肝癌患者的累計生存率為72.0%，顯著高于高表達者的42.9%；經(jīng)單因素/多因素回歸分析顯示CDRlas 是肝癌微血管侵襲(microvascular invasion,MVI)獨立危險因素[38]，預測MVI的AUC 為0.68。穩(wěn)定的circRNA 具有相對組織特異性，與肝癌的惡性程度及預后密切相關。

5 肝炎病毒相關的circRNA 表達

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)相關肝癌，仍是長江口地區(qū)肝癌發(fā)生的主要病原學因素，因HBV 共價閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)維持病毒持續(xù)感染。除臨床HBV 標志物外，血HBV-RNA 可用于抗病毒治療和預測患者干擾素的易感性，它的剪接變異體和cccDNA 表觀修飾與HBV 相關肝硬化、HCC 進展有關[39]?；诎┙M織微芯片的研究，HBV 相關HCC組織circRNA表達比癌周組織高2.0 倍(P＜0.05)上調circRNA 24種，顯著下調23 種；再以qRT-PCR 篩選出6 種為候補circRNA(hsa_circRNA_102814,100381,103489,101764,100327 和103361)，經(jīng)癌組織驗證hsa_circRNA_100381 和hsa_circRNA_103489 顯著上調，hsa_circRNA_101764下調最為顯著，尤其與miR-181 家族共表達，提示在HCC 進展中起重要作用[40]。

在疾病發(fā)展過程中內源性circRNA 起著至關重要的作用，circRNA 具有分子海綿功能，吸附或隔離特定的微小RNA 去抑制靶基因mRNA。采用基因芯片技術分析了HBV 相關肝癌及對應非癌肝組織circRNA 圖譜，根據(jù)海量數(shù)據(jù)鑒定出上調222 567 556個和下調125 439 219 個，顯示circRNA 共5 396 個分支，數(shù)以萬計的circRNA 參與肝癌進展[41]。因circRNA 穩(wěn)定性高于線性RNA，在體外可設計circRNA微型海綿模型系統(tǒng)，如丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)在生命周期中需細胞中miR-122。利用體外合成circRNA 的海綿作用，能有效吸附miRNA-122 達到抑制HCV 復制的目的，提示設計定位于胞質和胞核且穩(wěn)定的circRNA，可有效抑制肝炎病毒復制，值得深入研究[42]。

6 CircRNA 過表達與肝癌預后

化療耐藥是HCC 預后不佳的因素。肝癌組織circRNA 的研究文獻較多，呈過表達和低表達狀態(tài)。主要與腫瘤大小、淋巴結轉移、遠處轉移和TNM 分期等臨床病理學特征有關。以circRNA 芯片技術篩選肝癌組織中差異表達的circRNA，位于第13 號染色體的周期蛋白依賴性激酶8 是circRNA101237 的靶基因。癌組織或患者血circRNA101237 均顯著高于癌旁或對照組血。單變量和多變量分析顯示血清circRNA101237 水平是肝癌患者生存預后的獨立預測指標，高表達患者總生存率降低。體外研究[43]發(fā)現(xiàn)順鉑以劑量和時間依賴方式誘導肝癌細胞circRNA101237 表達，而順鉑耐藥患者和耐藥huh7 細胞中該circRNA 過表達。肝癌奧沙利鉑(oxa)耐藥中circRNA 的作用，肝癌組織circfbxo11 顯著上調，過表達與患者預后不良有關。circfbxo11 能促進HCC增殖、進展和oxa 抵抗，其機制可能為定位于細胞質中circfbxo11 分子沉重海綿miR-605 靶向foxo3 蛋白。foxo3 針對ABCb1 啟動子區(qū)加速表達。circfxo11/miR-605/foxo3/ABCb1 軸在肝癌多藥耐藥中作用[44]。

7 CircRNA 與肝癌靶向治療

肝癌相關circRNA 數(shù)量龐大，通過過表達或低表達促進或抑制肝癌細胞增殖或腫瘤生長。癌細胞和癌組織circ-homer1 過表達，與患者瘤體大小、淋巴結轉移、高臨床分期和預后差密切相關；其分子機制為circ-homer1 經(jīng)miR-1322/cxcl6 軸，促進肝癌細胞生長和侵襲性；反之，沉默可干預circ-homer1 活化，增強miR-1322 作用于cxcl6，而抑制肝癌細胞增殖、遷移和侵襲、細胞凋亡增加[45]。肝癌患者的血漿外泌體和肝組織來源circ-0051443，通過競爭結合miR-331-3p 上調BAK1 表達，促進癌細胞凋亡和細胞周期阻滯，抑制癌細胞的生物學行為；體內研究證實circ-0051443 對BAK1 的調控作用，發(fā)揮對裸鼠肝癌移植瘤生長的抑制作用[46]。另一研究[47]也顯示癌組織或細胞中has_circ_0008450 過表達，通過調節(jié)miR-214-3p/ezh2 軸，發(fā)揮抑制肝癌進展作用。敲除肝癌HepG2 和Huh-7 細胞中circMAN2b2 的表達，經(jīng)海綿癌胚型miR-217 作用，調節(jié)絲裂原活化蛋白激酶1 活性而發(fā)揮抑癌作用[48]，期待在眾多circRNA中發(fā)現(xiàn)肝癌有效治療的分子靶目標。

8 展 望

肝癌發(fā)病率持續(xù)上升仍是基礎醫(yī)學和臨床醫(yī)學的重大挑戰(zhàn)，腫瘤相關circRNA 是近年ncRNA 的研究的熱點之一。具有獨特性和多種病理生理功能的circRNA，日益受到重視[5,49]。目前對circRNA 的研究主要集中在作為有效分子海綿的功能上，因circRNAs 非常穩(wěn)定，高度保守，其表達改變與肝癌分期、腫瘤大小、分化程度、轉移等進展有關。已證明has_circ_0004018 和has_circ_0005075 等為肝癌診斷和靶向干預的潛在標志物。隨著高通量RNA 測序技術的發(fā)展，越來越多肝癌相關、結構多樣的circRNA被發(fā)現(xiàn)，對復雜分子調控機制闡明、期待circRNA 成果即時轉化、基于circRNA 的肝癌診斷與治療等具有開發(fā)應用前景。