EML4-ALK融合基因異形及其相關(guān)耐藥性的研究進(jìn)展

隋澤森，張建華

(南方醫(yī)科大學(xué)深圳醫(yī)院胸外科，廣東 深圳 518110)

2018年9月國際癌癥研究機(jī)構(gòu)發(fā)布權(quán)威數(shù)據(jù)統(tǒng)計再一次強調(diào)了肺癌是最常見的癌癥類型，占全球癌癥診斷的13%，是致死率最高的癌癥，10年生存率僅為5%[1]。超過80%的肺癌為非小細(xì)胞肺癌，其在組織學(xué)上多為肺腺癌。2011年美國臨床腫瘤學(xué)會指出，腫瘤診療已進(jìn)入分子靶向治療時代[2]，基因分析提高了人們對肺腺癌以及相關(guān)突變基因的認(rèn)識，使分子篩查成為非小細(xì)胞肺腺癌的常規(guī)診療手段。肺腺癌中兩個最常見的基因驅(qū)動靶點是表皮生長因子(epidermal growth factor receptor，EGFR)突變和微管相關(guān)蛋白樣4-間變淋巴瘤激酶(echinoderm microtubule-associated protein-like 4- anaplastic lymphoma kinase，EML4-ALK)重排，這兩者均適用于激酶抑制劑的治療?；诖?，免疫靶向治療應(yīng)運而生，且治療手段也越來越個體化。與常規(guī)化療相比，采用免疫靶向治療的患者有更長的無進(jìn)展生存期和更好的生活質(zhì)量[3]。隨著對EML4-ALK融合基因研究的深入，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了超過17種EML4-ALK融合異形[4-5]。最近的研究集中探討特定融合異形是否會影響肺癌的播散和疾病的預(yù)后以及不同異形是否會影響ALK靶向治療的療效[6]。國內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，不同的ALK融合異形與靶向藥物的療效無明顯相關(guān)性[7-8]，但也有研究認(rèn)為在分子層面，不同異形會通過分子信號通路對靶向藥物的治療產(chǎn)生影響[9-10]。為了更新對EML4-ALK融合異形的認(rèn)識，獲得更好的治療策略，現(xiàn)就目前所發(fā)現(xiàn)的常見的EML4-ALK融合異形的分子生物學(xué)特性及其對相關(guān)靶向藥物的耐藥性進(jìn)行綜述。

1 EML4-ALK融合基因

1.1EML家族 1993年，Suprenant等[11]在海膽卵有絲分裂間期發(fā)現(xiàn)了一種能與微管蛋白結(jié)合的物質(zhì)，并將其命名為棘皮動物微管相關(guān)蛋白(echinoderm microtubule-associated protein，EMAP)，這是第1個被確定的EML家族成員蛋白。自此開始，EML家族同源蛋白被逐個發(fā)現(xiàn)，其大多助力于有絲分裂時的微管調(diào)節(jié)，但這些機(jī)制尚未完全明晰。人類一共表達(dá)6種EML家族成員(EML1～6)，根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)分為2個亞科[12]。EML1～4這4種微管相關(guān)蛋白均由1個N端螺旋卷曲堿基區(qū)(N區(qū))、1個疏水的棘皮動物相關(guān)蛋白(hydrophobic motif in EML proteins，HELP)域和1個C端色氨酸-天冬氨酸重復(fù)序列(tryptophan-aspartic acid，WD)構(gòu)成[13]，四者的區(qū)別取決于一個富含色氨酸和蘇氨酸的不規(guī)則基鏈。另一個亞科是由EML5和EML6組成，兩者沒有N區(qū)，取而代之的是3個重復(fù)的HELP域和WD重復(fù)區(qū)結(jié)合的區(qū)域，最初命名為Ropp120[14]。Richards等[15]在探究EML1結(jié)構(gòu)時發(fā)現(xiàn)，EML1的C端是一段含非典型螺旋(atypical β-propeller，TAPE)域的EML蛋白，由13個重復(fù)的WD片段構(gòu)成了一個高度有序的結(jié)構(gòu)，這直接導(dǎo)致兩個有HELP域的螺旋節(jié)段緊密結(jié)合起來，組成了EML1疏水結(jié)構(gòu)的核心部分；后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，EML2～4的螺旋卷曲域是三聚體寡聚化的必要條件，所以這個卷區(qū)域被命名為三聚域[16]。通過三聚域和基礎(chǔ)域，EML蛋白可與微管連接在一起，但目前的研究尚未明確這種連接是通過直接結(jié)合還是通過寡聚化結(jié)合。另外，TAPE域也可通過自身的凹面與可溶性微管蛋白異二聚體結(jié)合，當(dāng)然也尚不明確這種結(jié)合的具體作用。本文所探討的EML4如圖1所示，其與EMAP有57%的同源性，是目前表達(dá)EMAP特性最好的同源蛋白[17]。

1.2ALK與EML4-ALK ALK隸屬于胰島素受體超家族，由Morris等[18]發(fā)現(xiàn)。ALK激活致癌信號通路主要依靠酪氨酸激酶(tyrosine kinase，TK)域，而ALK與EML4融合有賴于雙方斷裂部位均靠近TK域的近膜域，見圖2，其激活方式主要包括點突變、基因異常擴(kuò)增以及基因融合。在基因融合激活中，ALK的后續(xù)表達(dá)與活動均由其融合伙伴所決定。Soda等[19]發(fā)現(xiàn)，EML4-ALK融合蛋白在體內(nèi)外均有轉(zhuǎn)化特性，接受非小細(xì)胞肺癌基因檢測的患者中，融合蛋白所致肺癌占比6.7%。目前ALK突變的研究共識與EGFR突變研究共識相互獨立[20]。EML-ALK融合蛋白在肺腺癌中的表達(dá)僅占2%～9%，其也存在于乳腺癌和結(jié)直腸癌中[4]。EML4-ALK的本質(zhì)是一種臂內(nèi)倒位造成的易位融合，由EML4和定植在第2號染色體短臂上的ALK基因構(gòu)成[21]。到目前為止，已經(jīng)確定了至少17種EML4-ALK融合異形，其中一些融合異形還存在亞型。所有融合異形均包括了ALK的整個激酶相關(guān)域，并被外顯子編碼為20～29號，不同在于融合EML4基因的位點不同。所有的融合突變體都包括了通過寡聚和自我磷酸化使ALK產(chǎn)生活性的EML4的三聚域[4,16]。結(jié)構(gòu)的差異在于不同的融合突變體擁有的連接域和TAPE域所呈現(xiàn)的狀態(tài)，或無TAPE域或TAPE域的長度不同?？傊?，這些不同導(dǎo)致了EML4-ALK異形表現(xiàn)出不同的生物和分子特性，不同的特性又影響了不同的藥物反應(yīng)。

EML4：微管相關(guān)蛋白樣4；TD域：三聚域；HELP：棘皮動物相關(guān)蛋白區(qū)；TAPE域：非典型螺旋域

圖1 EML4的結(jié)構(gòu)圖

ALK：間變淋巴瘤激酶；JM域：近膜域；TK域：酪氨酸激酶域

2 常見的EML4-ALK融合異形

EML4-ALK陽性患者通常具有明顯的臨床特質(zhì)，包括發(fā)病年齡較小，輕度甚至不吸煙，組織學(xué)上大部分屬于腺癌[22]。對于晚期患者，細(xì)胞毒性化療是常見的治療選擇，但這種方法表現(xiàn)出高藥物毒性和低藥物療效。隨著對肺癌分子層面認(rèn)識的加深，目前幾乎所有非小細(xì)胞肺癌患者都會進(jìn)行基因檢測以制定更加個性化的治療方案，如靶向藥物治療，但進(jìn)行靶向藥物治療時發(fā)現(xiàn)，同樣都是EML4-ALK陽性患者，但是對于同種靶向藥物的應(yīng)答結(jié)果不同。目前發(fā)現(xiàn)了17種EML4-ALK融合異形，常見的有1、2、3a/b、4、5a，其中最常見的是1、2和3a/b，占總?cè)诤袭愋蔚?0%[6,23]。

如表1所示，EML4-ALK融合異形1占目前所有融合異形的33%，融合點位在外顯子E13；A20上，融合后含有部分TAPE域，多存在于細(xì)胞質(zhì)中[23]。體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，EML4-ALK融合異形1表達(dá)于H3122、STE-1以及DFC1032細(xì)胞，其是能進(jìn)行內(nèi)源性培養(yǎng)的僅有的兩個融合異形之一[24]。EML4-ALK融合異形2的占比為10%，融合點位在外顯子E20；A20上，也僅含有部分TAPE域，存在于細(xì)胞質(zhì)中，目前認(rèn)為異形2是對克唑替尼最敏感的EML4-ALK融合異形[4,7]；EML4-ALK融合異形3a/b的占比為29%，但也有研究指出異形3a/b的突變率達(dá)到44.4%[6]，其融合位點是外顯子E6a；A20。EML4-ALK融合異形3a/b的C端沒有TAPE域，不僅存在于細(xì)胞質(zhì)中，還存在于細(xì)胞核和微管上，其是另一個可通過內(nèi)源性培養(yǎng)得到的融合異形，表達(dá)于H2228細(xì)胞[25]；EML4-ALK融合異形4因臨床病例較少，目前研究較匱乏，Takeuchi等[24]在外顯子E14；ins11del49A20上發(fā)現(xiàn)并命名，預(yù)估占比3%。作為含有部分TAPE域的融合異形，其結(jié)合位點在異形1和2之間。EML4-ALK融合異形5占比僅為2%，是目前最短的異形，不僅缺乏TAPE域，甚至缺乏EML4的一部分基本域，但其依然能依靠EML4的三聚域激活A(yù)LK，表現(xiàn)出致癌活性，異形5融合點位為外顯子E2；A20，存在于細(xì)胞質(zhì)中[26]。

3 EML4-ALK融合異形相關(guān)耐藥性研究

目前臨床用于非小細(xì)胞肺癌治療的激酶抑制劑包括針對EGFR突變的厄洛替尼和EML4-ALK易位激活的克唑替尼、色瑞替尼以及艾樂替尼[27]，同時還有8個第2代或第3代ALK抑制劑正在臨床研究中[28-29]。EML4-ALK陽性患者對ALK抑制劑的應(yīng)答率為61%～74%，雖然對很多患者產(chǎn)生了積極影響，但也有部分患者的治療反應(yīng)很差甚至無反應(yīng)[30-31]。對于ALK陽性的肺癌患者在治療1年內(nèi)，最初對抑制劑敏感的患者會因二次突變或者其他分子通路的激活而導(dǎo)致復(fù)發(fā)。目前研究集中在為何同為ALK陽性患者，卻對靶向藥物的反應(yīng)不同以及為何同一患者會對靶向藥物產(chǎn)生反應(yīng)衰減，挖掘出藥物抵抗背后的分子機(jī)制有助于尋找更佳的治療方式、改善預(yù)后。目前研究人員根據(jù)不同異形的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和敏感性做出了EML4-ALK異形的分型與患者應(yīng)答之間存在相關(guān)性的假設(shè)。

2010年發(fā)表了第1個確定EML4-ALK融合異形的臨床研究，但由于患者群體規(guī)模較小，僅1例患者表達(dá)了異型2，該患者對克唑替尼的敏感性為57%，對傳統(tǒng)化療藥物的敏感性僅為10%[30]。之后幾年陸續(xù)有其他融合異型被發(fā)現(xiàn)。關(guān)于不同EML4-ALK融合異形對ALK抑制劑的敏感性，不同學(xué)者得出了不同的結(jié)論。Lei等[32]和Cha等[33]認(rèn)為，ALK融合異型對ALK抑制劑的反應(yīng)并無明顯差別。而Yoshida等[34]認(rèn)為，攜帶EML4-ALK融合異形1的患者相較于攜帶其他異形的患者對克唑替尼的反應(yīng)更加敏感。在一項回顧性研究中，基于之前關(guān)于EML4-ALK異形穩(wěn)定性的數(shù)據(jù)將受試者分為兩組，一組患者攜帶異形1、2或其他異形，另一組患者攜帶3a/b或5a。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺少TAPE域的比較短的異形(如3a/b或5a)相較于比較長含有TAPE域的異形(如1或2)，對酪氨酸激酶抑制劑處理的敏感性降低[35]，而EML4-ALK異形1、2患者的2年無進(jìn)展生存期較3a/b、5a患者更長。以上為缺少TAPE域的變體導(dǎo)致患者出現(xiàn)酪氨酸激酶抑制劑耐藥提供了關(guān)鍵證據(jù)[36]。這有助于臨床工作者根據(jù)ALK突變類型對患者進(jìn)行分類，以便更加準(zhǔn)確地制定策略進(jìn)而預(yù)測治療反應(yīng)。

表1 常見的EML4-ALK融合異形

EML4：微管相關(guān)蛋白樣4；ALK：間變淋巴瘤激酶；TAPE域：非典型螺旋域

克唑替尼作為一線治療方案，經(jīng)常會在用藥1年內(nèi)出現(xiàn)治療耐藥，這不僅是因為ALK激酶域的二次突變，在某些情況下還因為ALK融合基因的擴(kuò)增[22]。許多致癌基因依賴于額外的伴侶蛋白如熱激蛋白(heat shock protein，HSP)90以保持穩(wěn)定，有研究報道EML4-ALK也是如此[9]。有研究人員培育出有克唑替尼抗性的H3122細(xì)胞，此細(xì)胞對17-ADD敏感，而17-ADD是一種拮抗Hsp90的抑制劑[23]。但同ALK抑制劑一樣，不是所有患者都對Hsp90抑制劑敏感。Richards等[15]的研究表明，Hsp90第2代抑制劑ganetespib對結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的EML4-ALK如異形1表現(xiàn)出明顯的癌退化效應(yīng)；而對完全缺少TAPE域且更穩(wěn)定的異形3a/b對其具有耐藥性。這一點可以幫助區(qū)分EML4-ALK患者，有助于找到可能更能受益于Hsp90抑制劑治療的患者群體。

4 結(jié) 語

表達(dá)EML4-ALK的非小細(xì)胞肺癌患者表現(xiàn)出了對靶向藥物敏感性及持續(xù)作用時間不同的情況?；趯ML4-ALK分子形態(tài)的研究，學(xué)者把研究焦點轉(zhuǎn)移到EML4-ALK異形與反應(yīng)應(yīng)答的相關(guān)性上。在體外研究中，研究人員利用有限的患者標(biāo)本及其所培養(yǎng)出的細(xì)胞株確定了不同異形間存在不同的穩(wěn)定性以及不同的異形對TKI和Hsp90抑制劑的敏感性不同。EML4-ALK異形在結(jié)構(gòu)方面的不同在于有無TAPE域及完整性，TAPE域部分存在的異形相較于完全缺乏TAPE域的異形對抑制劑有更高的敏感性。目前僅僅是通過回顧性研究分析特定異形表達(dá)的差異，且均是針對ALK第一代激酶抑制劑——克唑替尼敏感性的比較。推測EML4-ALK異形差異會成為篩選及評估下一代ALK抑制劑——艾樂替尼或色瑞替尼的條件之一。

目前關(guān)于EML4-ALK異形研究的瓶頸也十分突出。首先由于ALK陽性病例較少，即便是多中心大型臨床研究所獲得的數(shù)據(jù)也僅能初步明確異形的表達(dá)和后續(xù)反應(yīng)，并不能記錄長期應(yīng)答。此外，現(xiàn)在符合實驗標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞株也十分有限，由于其是從腺癌患者中獲得的，不可避免地表現(xiàn)出遺傳背景的差異。因此，制備同基因型的肺腺癌細(xì)胞株對于表達(dá)EML4-ALK異形是十分必要的，通過對基因型相同的肺腺癌細(xì)胞株進(jìn)行EML4-ALK異形的研究對比較具有相同遺傳背景的細(xì)胞激活途徑非常有利。此外，擴(kuò)展現(xiàn)有病源細(xì)胞數(shù)據(jù)庫的同時，根據(jù)現(xiàn)有研究將每種異形分門別類，然后再利用異形特性探索新的治療方法，有助于改善EML4-ALK肺癌患者的預(yù)后。

EML4-ALK融合蛋白不僅具有其親代蛋白的特性，從EML4上遺傳了微管結(jié)合性和三聚域，從ALK遺傳了激酶活性，而且自身的特性也是獨一無二的，如由于TAPE域斷裂而產(chǎn)生對Hsp90的依賴。這一新的生化特性在驅(qū)動致癌信號的同時，也給研究人員提供了制定新的治療策略的機(jī)會。因此，進(jìn)一步研究不同EML4-ALK異形的差異，可能會直接影響患者對ALK激酶抑制劑的反應(yīng)，有助于發(fā)現(xiàn)新的非小細(xì)胞肺癌治療策略。