江成英,劉曉蘭,王 松
(1.梧州學院化學工程與資源再利用學院,廣西梧州 543000;2.齊齊哈爾大學食品與生物工程學院,黑龍江齊齊哈爾 161006)
玉米黃粉也稱玉米蛋白粉,是加工玉米淀粉的副產(chǎn)物之一。玉米蛋白粉中的蛋白質(zhì)有兩種狀態(tài),即可溶性蛋白質(zhì)和不可溶性蛋白質(zhì),不溶性蛋白質(zhì)容易和其他的大分子有機物或微量元素結(jié)合,而不易被身體吸收,幾乎均被排出體外( 趙文揚等,2014)。玉米蛋白粉因不溶性蛋白質(zhì)含量較高及氨基酸組成極不平衡,利用價值及營養(yǎng)品質(zhì)較低,嚴重制約其在飼料中的應用(佟維娜等,2017;晏家友等,2009;王冠禹等,2008)。對玉米蛋白粉進行加工處理,充分發(fā)掘其潛在價值,既可節(jié)約能源,又能夠促進玉米產(chǎn)業(yè)的發(fā)展(陸啟明等,2018;李麗等,2010)。
利用微生物發(fā)酵可提高玉米蛋白粉飼料的利用率(江成英,2018)。微生物發(fā)酵過程中產(chǎn)生的蛋白酶類能夠?qū)⒌鞍追壑须y以被吸收利用的植物大分子蛋白質(zhì)降解為分子質(zhì)量較小的多肽、 小肽或游離氨基酸,從而改善玉米蛋白粉的營養(yǎng)結(jié)構(gòu),并產(chǎn)生具有多種生理活性的肽類,增強動物免疫力(魏炳棟,2017)。本研究以玉米黃粉為主要原料,以多菌種組合制備的種曲為發(fā)酵劑進行發(fā)酵飼料的制備,在單因素試驗的基礎(chǔ)上,采用四因素三水平的正交試驗,旨在優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵玉米黃粉飼料的工藝條件。
1.1 主要材料 種曲:本項目組制備;玉米黃粉:中糧生化能源(龍江)有限公司提供;麩皮:市售。
1.2 主要試劑 碳酸鈉、氫氧化鈉、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、鎢酸鈉、鉬酸鈉、磷酸、鹽酸、硫酸鋰、液溴、葡萄糖、瓊脂、胰蛋白胨、氯化鈉、酵母粉等試劑均為國產(chǎn)分析純。
1.3 主要儀器 隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)療器械廠),顯微鏡(寧波永新光學股份有限公司),手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠),紫外可見分光光度計(日本島津儀器廠),移液器 (北京青云卓立精密設(shè)備有限公司),數(shù)顯pH 計(上海精密科學儀器有限公司),超凈工作臺(上海智城分析儀器有限公司),電子天平(北京賽多利斯儀器廠)等。
1.4 試驗方法
1.4.1 可溶性蛋白質(zhì)含量的測定 采用福林酚法測定可溶性蛋白質(zhì)含量(王永華,2010)。
1.4.2 種曲的制備 將枯草芽孢桿菌、熱帶假絲酵母菌、嗜熱乳桿菌、納豆芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌按3:3:1:4:2 比例混合,以5%的接種量接入料水比為 1:1.6、物料比(黃粉:麩皮)為 4:6 滅菌的培養(yǎng)基上,在30 ℃恒溫條件下培養(yǎng)84 h (江成英,2018)。
1.4.3 單因素試驗 將玉米黃粉與麩皮以一定比例混合制備發(fā)酵培養(yǎng)基,接種種曲進行固態(tài)發(fā)酵,以發(fā)酵過程中可溶性蛋白質(zhì)含量為指標進行發(fā)酵條件的確定。本試驗在飼料的制備過程中主要研究了物料比、料水比、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、接種量對可溶性蛋白質(zhì)含量的影響。
1.4.4 正交試驗設(shè)計 在單因素試驗的基礎(chǔ)上,對料水比、接種量、發(fā)酵時間以及發(fā)酵溫度設(shè)計四因素三水平 L9(34) 的正交優(yōu)化試驗,以確定固態(tài)發(fā)酵玉米黃粉飼料的工藝條件。
1.4.5 發(fā)酵驗證試驗 對正交試驗獲得的最佳發(fā)酵條件進行發(fā)酵驗證。
2.1 單因素試驗
2.1.1 發(fā)酵時間對可溶性蛋白質(zhì)含量的影響首先發(fā)酵時間進行單因素優(yōu)化試驗,發(fā)酵條件為黃粉:麩皮=7:3,料水比為 1:1.2,種曲的接種量為5%,發(fā)酵溫度為30 ℃。48 h 以后每隔12 h檢測發(fā)酵底物中的可溶性蛋白質(zhì)含量??扇苄缘鞍踪|(zhì)含量及蛋白轉(zhuǎn)化率隨發(fā)酵時間變化的關(guān)系如圖1 所示。
圖1 發(fā)酵時間對可溶性蛋白含量的影響
如圖1 所示,隨著發(fā)酵時間的延長,發(fā)酵底物中的可溶性蛋白質(zhì)含量不斷增加,當時間為96 h時達到最大值10.85%。超過96 h 以后,可溶性蛋白質(zhì)含量有所下降,在120 h 以后可溶性蛋白質(zhì)含量又略有提高。這主要是由于發(fā)酵前期,培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)充足菌群大量繁殖,產(chǎn)蛋白酶能力迅速提高,從而使發(fā)酵底物中非水溶性蛋白質(zhì)不斷轉(zhuǎn)化,隨著菌種量的增加,消耗發(fā)酵底物中營養(yǎng)速度也不斷增大;到了發(fā)酵后期發(fā)酵底物中的營養(yǎng)物質(zhì)已不能滿足菌群生長及產(chǎn)蛋白酶的需求,因此菌群產(chǎn)蛋白酶活力降低,進而可溶性蛋白質(zhì)含量下降,超過120 h 之后一些菌體的自溶使得可溶性蛋白質(zhì)含量略有升高。綜合考慮,確定96 h為最佳的發(fā)酵時間。
2.1.2 發(fā)酵溫度對可溶性蛋白質(zhì)含量的影響 在黃粉:麩皮=7:3,料水比為 1:1.2,種曲的接種量為5%,發(fā)酵時間為96 h 條件下對發(fā)酵溫度進行了優(yōu)化試驗,設(shè)置了 28、30、32、34 ℃四個溫度梯度,每個梯度設(shè)置三個平行樣,發(fā)酵結(jié)束后,通過福林酚法檢測可溶性蛋白質(zhì)含量并計算蛋白轉(zhuǎn)化率,從而確定發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的最佳發(fā)酵溫度。結(jié)果如圖2 所示。
圖2 發(fā)酵溫度對可溶性蛋白含量的影響
由圖2 可知,各溫度梯度對發(fā)酵底物中可溶性蛋白質(zhì)含量的影響不明顯,主要原因可能是在28~34 ℃都能適用于蛋白酶發(fā)揮催化活力,但在32 ℃時發(fā)酵底物中可溶性蛋白質(zhì)最高,為11.41%,故確定發(fā)酵溫度為32 ℃。
2.1.3 物料比對可溶性蛋白質(zhì)含量的影響 在料水比為1:1.2,種曲的接種量為5%,發(fā)酵時間為96 h,發(fā)酵溫度為32 ℃的條件下,設(shè)置了黃粉:麩皮為 4:6、5:5、6:4、7:3、8:2 五個梯度來研究物料比對發(fā)酵飼料中可溶性蛋白質(zhì)含量的影響。結(jié)果如圖3 所示。
圖3 物料比對可溶性蛋白含量的影響
從圖3 可以看出,隨著物料中玉米蛋白粉含量的增加,發(fā)酵底物中可溶性蛋白質(zhì)含量逐漸升高,至黃粉:麩皮為7:3 時達到最高,為11.43%。而再增加玉米蛋白粉的含量反而使可溶性蛋白質(zhì)含量有所下降。這主要是由于碳氮比降低時菌種產(chǎn)蛋白酶能力較強,從而使水溶性蛋白質(zhì)水解率增大,但玉米蛋白粉過多會導致發(fā)酵底物透氣性差,使微生物生長受限而影響蛋白酶的產(chǎn)量,進而使可溶性蛋白質(zhì)含量下降。因此,確定最適物料比黃粉:麩皮為 7:3。
2.1.4 接種量對可溶性蛋白質(zhì)含量的影響 在料水比為 1:1.2,物料比(黃粉:麩皮)為 7:3,發(fā)酵時間為96 h,發(fā)酵溫度為32 ℃的條件下,對種曲的接種量進行了優(yōu)化,每組三個平行樣,可溶性蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果如圖4 所示。
圖4 接種量對可溶性蛋白含量的影響
由圖4 可知,種曲的接種量增加時底物中的可溶性蛋白質(zhì)含量隨之增加。當種曲接種量為5%時,底物中的可溶性蛋白質(zhì)含量為11.42%。但當接種量超過5%時,底物的可溶性蛋白質(zhì)含量增加不大,從生產(chǎn)成本考慮選取接種量5%為發(fā)酵飼料種曲的接種量。
2.1.5 料水比對可溶性蛋白質(zhì)含量的影響 在物料比(黃粉:麩皮)為 7:3,發(fā)酵時間為 96 h,發(fā)酵溫度為32 ℃,種曲的接種量為5%的條件下,對物料的料水比進行了優(yōu)化,設(shè)置了 1:1、1:1.2、1:1.4、1:1.6 四個梯度,每組三個平行樣,發(fā)酵結(jié)束后檢測可溶性蛋白質(zhì)含量,結(jié)果如圖5 所示。
圖5 料水比對可溶性蛋白含量的影響
由圖5 可以看出,隨著物料中加水量的逐漸增多,可溶性蛋白質(zhì)含量隨著增加,料水比為1:1.4 時,可溶性蛋白質(zhì)含量最高,為13.08%。說明在此條件下,培養(yǎng)基中的含水量既可以滿足菌體生長的需要,又不會影響物料的發(fā)酵,是一個較為理想的比例。
2.2 正交試驗結(jié)果分析 通過單因素試驗得出,固態(tài)發(fā)酵玉米黃粉飼料的條件為物料比(黃粉:麩皮)7:3,發(fā)酵時間 96 h,發(fā)酵溫度 32 ℃,種曲的接種量5%,料水比1:1.4。在此基礎(chǔ)上設(shè)計了四因素三水平L9(34)的正交試驗,對各因素組合進行優(yōu)化。正交試驗設(shè)計和試驗結(jié)果如表1 所示。
表1 正交試驗設(shè)計與結(jié)果
由表1 分析可以看出,固態(tài)發(fā)酵玉米黃粉飼料的最佳條件為A2B2C3D3,即料水比為1:1.4,接種量為5%,發(fā)酵溫度為33 ℃,發(fā)酵時間為108 h。
2.3 發(fā)酵驗證試驗結(jié)果 將玉米黃粉與麩皮以7:3 的比例混合,按 1.4 的比例(g/mL)加入水,混勻后于121 ℃蒸汽滅菌30 min,冷卻至室溫,接入5%的種曲,置于33 ℃條件下108 h,測定其中可溶性蛋白質(zhì)含量為13.67%。
本研究通過正交試驗確定了固態(tài)發(fā)酵玉米黃粉飼料的工藝條件為物料比(黃粉:麩皮)7:3,料水比 1:1.4,發(fā)酵時間 108 h,發(fā)酵溫度 33 ℃,種曲接種量5%。該條件下發(fā)酵玉米黃粉飼料中可溶性蛋白質(zhì)含量為13.67%。