固態(tài)發(fā)酵玉米黃粉飼料工藝的研究

江成英，劉曉蘭，王 松

（1.梧州學(xué)院化學(xué)工程與資源再利用學(xué)院，廣西梧州 543000；2.齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161006）

玉米黃粉也稱玉米蛋白粉，是加工玉米淀粉的副產(chǎn)物之一。玉米蛋白粉中的蛋白質(zhì)有兩種狀態(tài)，即可溶性蛋白質(zhì)和不可溶性蛋白質(zhì)，不溶性蛋白質(zhì)容易和其他的大分子有機(jī)物或微量元素結(jié)合，而不易被身體吸收，幾乎均被排出體外（ 趙文揚(yáng)等，2014）。玉米蛋白粉因不溶性蛋白質(zhì)含量較高及氨基酸組成極不平衡，利用價(jià)值及營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)較低，嚴(yán)重制約其在飼料中的應(yīng)用（佟維娜等，2017；晏家友等，2009；王冠禹等，2008）。對(duì)玉米蛋白粉進(jìn)行加工處理，充分發(fā)掘其潛在價(jià)值，既可節(jié)約能源，又能夠促進(jìn)玉米產(chǎn)業(yè)的發(fā)展（陸啟明等，2018；李麗等，2010）。

利用微生物發(fā)酵可提高玉米蛋白粉飼料的利用率（江成英，2018）。微生物發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的蛋白酶類能夠?qū)⒌鞍追壑须y以被吸收利用的植物大分子蛋白質(zhì)降解為分子質(zhì)量較小的多肽、 小肽或游離氨基酸，從而改善玉米蛋白粉的營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)，并產(chǎn)生具有多種生理活性的肽類，增強(qiáng)動(dòng)物免疫力（魏炳棟，2017）。本研究以玉米黃粉為主要原料，以多菌種組合制備的種曲為發(fā)酵劑進(jìn)行發(fā)酵飼料的制備，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用四因素三水平的正交試驗(yàn)，旨在優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵玉米黃粉飼料的工藝條件。

1 材料與方法

1.1 主要材料 種曲：本項(xiàng)目組制備；玉米黃粉：中糧生化能源（龍江）有限公司提供；麩皮：市售。

1.2 主要試劑 碳酸鈉、氫氧化鈉、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、鎢酸鈉、鉬酸鈉、磷酸、鹽酸、硫酸鋰、液溴、葡萄糖、瓊脂、胰蛋白胨、氯化鈉、酵母粉等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 主要儀器 隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠），顯微鏡（寧波永新光學(xué)股份有限公司），手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠），紫外可見分光光度計(jì)（日本島津儀器廠），移液器 （北京青云卓立精密設(shè)備有限公司），數(shù)顯pH 計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司），超凈工作臺(tái)（上海智城分析儀器有限公司），電子天平（北京賽多利斯儀器廠）等。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 可溶性蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 采用福林酚法測(cè)定可溶性蛋白質(zhì)含量（王永華，2010）。

1.4.2 種曲的制備 將枯草芽孢桿菌、熱帶假絲酵母菌、嗜熱乳桿菌、納豆芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌按3:3:1:4:2 比例混合，以5%的接種量接入料水比為 1：1.6、物料比（黃粉：麩皮）為 4：6 滅菌的培養(yǎng)基上，在30 ℃恒溫條件下培養(yǎng)84 h （江成英，2018）。

1.4.3 單因素試驗(yàn) 將玉米黃粉與麩皮以一定比例混合制備發(fā)酵培養(yǎng)基，接種種曲進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，以發(fā)酵過(guò)程中可溶性蛋白質(zhì)含量為指標(biāo)進(jìn)行發(fā)酵條件的確定。本試驗(yàn)在飼料的制備過(guò)程中主要研究了物料比、料水比、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、接種量對(duì)可溶性蛋白質(zhì)含量的影響。

1.4.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)料水比、接種量、發(fā)酵時(shí)間以及發(fā)酵溫度設(shè)計(jì)四因素三水平 L9（34） 的正交優(yōu)化試驗(yàn)，以確定固態(tài)發(fā)酵玉米黃粉飼料的工藝條件。

1.4.5 發(fā)酵驗(yàn)證試驗(yàn) 對(duì)正交試驗(yàn)獲得的最佳發(fā)酵條件進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)可溶性蛋白質(zhì)含量的影響首先發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行單因素優(yōu)化試驗(yàn)，發(fā)酵條件為黃粉：麩皮=7：3，料水比為 1：1.2，種曲的接種量為5%，發(fā)酵溫度為30 ℃。48 h 以后每隔12 h檢測(cè)發(fā)酵底物中的可溶性蛋白質(zhì)含量?？扇苄缘鞍踪|(zhì)含量及蛋白轉(zhuǎn)化率隨發(fā)酵時(shí)間變化的關(guān)系如圖1 所示。

圖1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)可溶性蛋白含量的影響

如圖1 所示，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵底物中的可溶性蛋白質(zhì)含量不斷增加，當(dāng)時(shí)間為96 h時(shí)達(dá)到最大值10.85%。超過(guò)96 h 以后，可溶性蛋白質(zhì)含量有所下降，在120 h 以后可溶性蛋白質(zhì)含量又略有提高。這主要是由于發(fā)酵前期，培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充足菌群大量繁殖，產(chǎn)蛋白酶能力迅速提高，從而使發(fā)酵底物中非水溶性蛋白質(zhì)不斷轉(zhuǎn)化，隨著菌種量的增加，消耗發(fā)酵底物中營(yíng)養(yǎng)速度也不斷增大；到了發(fā)酵后期發(fā)酵底物中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)已不能滿足菌群生長(zhǎng)及產(chǎn)蛋白酶的需求，因此菌群產(chǎn)蛋白酶活力降低，進(jìn)而可溶性蛋白質(zhì)含量下降，超過(guò)120 h 之后一些菌體的自溶使得可溶性蛋白質(zhì)含量略有升高。綜合考慮，確定96 h為最佳的發(fā)酵時(shí)間。

2.1.2 發(fā)酵溫度對(duì)可溶性蛋白質(zhì)含量的影響 在黃粉：麩皮=7：3，料水比為 1：1.2，種曲的接種量為5%，發(fā)酵時(shí)間為96 h 條件下對(duì)發(fā)酵溫度進(jìn)行了優(yōu)化試驗(yàn)，設(shè)置了 28、30、32、34 ℃四個(gè)溫度梯度，每個(gè)梯度設(shè)置三個(gè)平行樣，發(fā)酵結(jié)束后，通過(guò)福林酚法檢測(cè)可溶性蛋白質(zhì)含量并計(jì)算蛋白轉(zhuǎn)化率，從而確定發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的最佳發(fā)酵溫度。結(jié)果如圖2 所示。

圖2 發(fā)酵溫度對(duì)可溶性蛋白含量的影響

由圖2 可知，各溫度梯度對(duì)發(fā)酵底物中可溶性蛋白質(zhì)含量的影響不明顯，主要原因可能是在28～34 ℃都能適用于蛋白酶發(fā)揮催化活力，但在32 ℃時(shí)發(fā)酵底物中可溶性蛋白質(zhì)最高，為11.41%，故確定發(fā)酵溫度為32 ℃。

2.1.3 物料比對(duì)可溶性蛋白質(zhì)含量的影響 在料水比為1：1.2，種曲的接種量為5%，發(fā)酵時(shí)間為96 h，發(fā)酵溫度為32 ℃的條件下，設(shè)置了黃粉：麩皮為 4：6、5：5、6：4、7：3、8：2 五個(gè)梯度來(lái)研究物料比對(duì)發(fā)酵飼料中可溶性蛋白質(zhì)含量的影響。結(jié)果如圖3 所示。

圖3 物料比對(duì)可溶性蛋白含量的影響

從圖3 可以看出，隨著物料中玉米蛋白粉含量的增加，發(fā)酵底物中可溶性蛋白質(zhì)含量逐漸升高，至黃粉：麩皮為7：3 時(shí)達(dá)到最高，為11.43%。而再增加玉米蛋白粉的含量反而使可溶性蛋白質(zhì)含量有所下降。這主要是由于碳氮比降低時(shí)菌種產(chǎn)蛋白酶能力較強(qiáng)，從而使水溶性蛋白質(zhì)水解率增大，但玉米蛋白粉過(guò)多會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵底物透氣性差，使微生物生長(zhǎng)受限而影響蛋白酶的產(chǎn)量，進(jìn)而使可溶性蛋白質(zhì)含量下降。因此，確定最適物料比黃粉：麩皮為 7：3。

2.1.4 接種量對(duì)可溶性蛋白質(zhì)含量的影響 在料水比為 1：1.2，物料比（黃粉：麩皮）為 7：3，發(fā)酵時(shí)間為96 h，發(fā)酵溫度為32 ℃的條件下，對(duì)種曲的接種量進(jìn)行了優(yōu)化，每組三個(gè)平行樣，可溶性蛋白質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果如圖4 所示。

圖4 接種量對(duì)可溶性蛋白含量的影響

由圖4 可知，種曲的接種量增加時(shí)底物中的可溶性蛋白質(zhì)含量隨之增加。當(dāng)種曲接種量為5%時(shí)，底物中的可溶性蛋白質(zhì)含量為11.42%。但當(dāng)接種量超過(guò)5%時(shí)，底物的可溶性蛋白質(zhì)含量增加不大，從生產(chǎn)成本考慮選取接種量5%為發(fā)酵飼料種曲的接種量。

2.1.5 料水比對(duì)可溶性蛋白質(zhì)含量的影響 在物料比（黃粉：麩皮）為 7：3，發(fā)酵時(shí)間為 96 h，發(fā)酵溫度為32 ℃，種曲的接種量為5%的條件下，對(duì)物料的料水比進(jìn)行了優(yōu)化，設(shè)置了 1：1、1：1.2、1：1.4、1：1.6 四個(gè)梯度，每組三個(gè)平行樣，發(fā)酵結(jié)束后檢測(cè)可溶性蛋白質(zhì)含量，結(jié)果如圖5 所示。

圖5 料水比對(duì)可溶性蛋白含量的影響

由圖5 可以看出，隨著物料中加水量的逐漸增多，可溶性蛋白質(zhì)含量隨著增加，料水比為1:1.4 時(shí)，可溶性蛋白質(zhì)含量最高，為13.08%。說(shuō)明在此條件下，培養(yǎng)基中的含水量既可以滿足菌體生長(zhǎng)的需要，又不會(huì)影響物料的發(fā)酵，是一個(gè)較為理想的比例。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析 通過(guò)單因素試驗(yàn)得出，固態(tài)發(fā)酵玉米黃粉飼料的條件為物料比（黃粉：麩皮）7：3，發(fā)酵時(shí)間 96 h，發(fā)酵溫度 32 ℃，種曲的接種量5%，料水比1：1.4。在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了四因素三水平L9（34）的正交試驗(yàn)，對(duì)各因素組合進(jìn)行優(yōu)化。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和試驗(yàn)結(jié)果如表1 所示。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

由表1 分析可以看出，固態(tài)發(fā)酵玉米黃粉飼料的最佳條件為A2B2C3D3，即料水比為1:1.4，接種量為5%，發(fā)酵溫度為33 ℃，發(fā)酵時(shí)間為108 h。

2.3 發(fā)酵驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 將玉米黃粉與麩皮以7:3 的比例混合，按 1.4 的比例（g/mL）加入水，混勻后于121 ℃蒸汽滅菌30 min，冷卻至室溫，接入5%的種曲，置于33 ℃條件下108 h，測(cè)定其中可溶性蛋白質(zhì)含量為13.67%。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)正交試驗(yàn)確定了固態(tài)發(fā)酵玉米黃粉飼料的工藝條件為物料比（黃粉：麩皮）7：3，料水比 1：1.4，發(fā)酵時(shí)間 108 h，發(fā)酵溫度 33 ℃，種曲接種量5%。該條件下發(fā)酵玉米黃粉飼料中可溶性蛋白質(zhì)含量為13.67%。