纖維分解酶對(duì)大麥秸稈體外發(fā)酵和消化的影響

王先桂，許華杰，曾 丹

（1.茅臺(tái)學(xué)院，貴州仁懷 564501；2.貴州珍酒釀酒有限公司，貴州遵義 563000）

反芻動(dòng)物瘤胃中纖維素分解微生物負(fù)責(zé)消化植物纖維，這些微生物對(duì)纖維降解至關(guān)重要。Gado等（2009）研究表明，外源性纖維分解酶的添加可以促進(jìn)微生物生長(zhǎng)和微生物蛋白的合成。Morgavi等（2004）報(bào)道，木霉中纖維分解酶促進(jìn)絲孢桿菌S85對(duì)玉米青貯和紫花苜蓿干草的粘附和降解，但未促進(jìn)純纖維素的降解。將纖維分解酶應(yīng)用于青貯飼料時(shí)，它促進(jìn)了需氧微生物的活性，并對(duì)瘤胃微生物氮摻入產(chǎn)生不利影響（Wang等，2002）。這些結(jié)果表明，纖維分解酶在使用前的預(yù)處理（水解）可能在調(diào)節(jié)纖維分解酶的功效方面發(fā)揮作用。反芻動(dòng)物纖維分解酶產(chǎn)品比較廣泛，但它們對(duì)養(yǎng)分利用的影響并不一致。因此，本研究旨在檢驗(yàn)體外培養(yǎng)條件下外源纖維素酶對(duì)瘤胃纖維素分解菌生長(zhǎng)的影響，并評(píng)估纖維酶預(yù)處理對(duì)其整體效果的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)1 以大麥秸稈和苜蓿干草為試驗(yàn)原料，采用產(chǎn)琥鉑酸絲狀桿菌和黃色瘤胃球菌對(duì)其進(jìn)行體外消化試驗(yàn)。將20捆大麥秸稈和紫花苜蓿干草（每個(gè)5 kg）粉碎后過(guò)2.0 mm篩網(wǎng)，然后用1.5 mm的篩網(wǎng)收集1.5～2.0 mm的顆粒。試驗(yàn)用的酶主要以木聚糖酶和β-葡聚糖酶為主，濃度分別為0、30和300 μg/mL，之后參考Wang等（2003）的方法對(duì)樣品進(jìn)行處理，并評(píng)估原料中性洗滌纖維降解情況。

1.2 試驗(yàn)2 大麥秸稈樣品的處理方法同試驗(yàn)1，試驗(yàn)共分為6個(gè)處理，對(duì)照組不經(jīng)纖維素酶處理，T1組經(jīng)過(guò)纖維素酶處理（150 mg/mL，7.5 mg），T2組纖維素酶處理，體外孵化前預(yù)先水解24 h，T3組T2組預(yù)處理后用水去除可溶性水解產(chǎn)物，T4組、T3組處理后再經(jīng)過(guò)高壓蒸汽處理，T5組在T3組的基礎(chǔ)上加入與T2組同水平的還原糖。除T2和T3組外，其余12種底物均在批量培養(yǎng)前處理。選擇2頭帶有瘤胃插管的公牛作瘤胃液體供體。在飼喂后2 h收集瘤胃液，通過(guò)4層紗布過(guò)濾。瘤胃液與緩沖液按1∶2的比例混合，將（15NH4）2SO4（0.75 g/L）作為微生物氮標(biāo)記物加入緩沖瘤胃液中。孵育和測(cè)定干物質(zhì)降解和揮發(fā)性脂肪酸含量的方法參考Wang等（2002）的研究。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS軟件多因素方差分析模型，在試驗(yàn)1中采用多項(xiàng)式檢驗(yàn)酶濃度對(duì)指標(biāo)的線性效應(yīng)，組間差異用Tukey法進(jìn)行多重比較，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源酶及不同微生物孵育對(duì)苜蓿草和大麥秸稈中性洗滌纖維降解的影響 由表1顯示，隨著酶濃度的增加，中性洗滌纖維的降解率表現(xiàn)為顯著線性升高（P＜0.05）。微生物種類對(duì)大麥秸稈中性洗滌纖維降解率的影響無(wú)顯著差異（P＞0.05），但黃色瘤胃球菌對(duì)苜蓿草的消化能力顯著高于產(chǎn)琥鉑酸絲狀桿菌（P＜0.05）。產(chǎn)琥鉑酸絲狀桿菌和酶濃度在300 μg/mL時(shí)對(duì)中性洗滌纖維的降解率具有顯著協(xié)同效應(yīng)（P＜0.05）。300 μg/mL酶濃度時(shí)，黃色瘤胃球菌對(duì)苜蓿草的消化表現(xiàn)最高（P＜0.05）。

表1 木聚糖酶、β-葡聚糖酶及微生物孵育對(duì)苜蓿草和大麥秸稈中性洗滌纖維降解的影響

2.2 纖維酶的預(yù)處理對(duì)大麥秸稈體外發(fā)酵氣體產(chǎn)生和干物質(zhì)降解的影響 由表2可知，與對(duì)照組相比，應(yīng)用外源纖維素酶處理天然大麥秸稈可顯著提高4 h氣體產(chǎn)量及4、12和48 h干物質(zhì)降解（P＜0.05），而外源纖維素酶應(yīng)用于氨化大麥秸稈顯著提高了4和12 h氣體產(chǎn)量和干物質(zhì)降解（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，纖維素酶預(yù)先水解后顯著提高了天然和氨化大麥秸稈4和12 h氣體產(chǎn)生及4、12和48 h干物質(zhì)降解（P＜0.05）。與T3組相比，T5組顯著提高了4和12 h大麥秸稈氣體產(chǎn)生（P＜0.05），同時(shí)提高了各孵育時(shí)間干物質(zhì)降解（P＜0.05）。無(wú)論大麥秸稈類型是什么，T3、T4和T5組在各孵育時(shí)間的干物質(zhì)降解均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。

表2 纖維素酶的預(yù)處理對(duì)大麥秸稈（天然或氨化）體外發(fā)酵氣體產(chǎn)生和干物質(zhì)降解的影響

2.3 纖維酶的預(yù)處理對(duì)大麥秸稈體外標(biāo)記物殘留量的影響 由表3可知，T1組較對(duì)照組顯著提高天然秸稈中15N殘留量（P＜0.05），而T3和T4組較對(duì)照組顯著降低了15N殘留量（P＜0.05）。T2、T3和T5組氨化大麥秸稈在孵育4 h后15N殘留量顯著提高（P＜0.05），而T1和T5組在孵育12 h后15N殘留量顯著提高（P＜0.05），所有處理組較對(duì)照組在孵育48 h后15N殘留量均顯著提高（P ＜ 0.05）。

2.4 纖維酶的預(yù)處理對(duì)大麥秸稈體外發(fā)酵揮發(fā)性脂肪酸含量的影響 由表4可知，與對(duì)照組相比，T3、T4和T5組天然大麥秸稈在孵育12和48 h后乙酸濃度顯著降低（P＜0.05），而孵育48 h后的丙酸及4和12 h后的丁酸含量顯著升高（P＜0.05）。氨化秸稈在孵育12和48 h后，處理組乙酸濃度顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），但丙酸濃度顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

表3 外源纖維素酶的不同預(yù)處理方法對(duì)大麥秸稈（天然或氨化）15N殘留量的影響

表4 纖維素酶的預(yù)處理對(duì)大麥秸稈（天然或氨化）體外發(fā)酵揮發(fā)性脂肪酸含量的影響

3 討論

有研究表明，黃色瘤胃球菌菌株具有降解植物細(xì)胞壁非纖維素多糖成分的能力，因?yàn)樗鼈儺a(chǎn)生多種多糖酶，包括木聚糖酶和果膠酶（Erfle和Teather，1991）。這種能力可以解釋本研究結(jié)果中黃色瘤胃球菌較產(chǎn)琥鉑酸絲狀桿菌能降解更多的苜蓿草，此外作者認(rèn)為，這兩種細(xì)菌降解中性洗滌纖維的能力取決于底物類型和外源纖維素酶水平。本研究表明，高壓蒸汽滅活的外源纖維素酶對(duì)大麥秸稈的干物質(zhì)降解無(wú)顯著影響。外源纖維素酶對(duì)纖維素分解菌消化能力影響程度的差異可能是由于底物物理和化學(xué)特性、菌株固有酶譜和外源纖維素酶產(chǎn)物的酶譜有關(guān)（Morgavi等，2004）。

與紫花苜蓿干草相比，大麥秸稈含有較多的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。Bhat等（1990）研究發(fā)現(xiàn)，黃色瘤胃球菌和產(chǎn)琥鉑酸絲狀桿菌在大麥秸稈上具有不同的粘附位點(diǎn)。本研究中使用外源纖維酶使產(chǎn)琥鉑酸絲狀桿菌較黃色瘤胃球菌增強(qiáng)了對(duì)大麥秸稈的降解能量，這表明外源纖維素酶譜與產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌基因酶譜在大麥秸稈消化過(guò)程中具有更強(qiáng)的互補(bǔ)性。Jalilvand等（2008）通過(guò)混合瘤胃細(xì)菌研究發(fā)現(xiàn)，與苜蓿干草和青貯玉米相比，外源纖維素酶更能促進(jìn)小麥秸稈等高纖維粗飼料的消化。但Gallardo等（2010）研究發(fā)現(xiàn)，外源纖維素酶對(duì)苜蓿干草消化的影響大于水稻秸稈。這些研究之間的差異可能是由于外源纖維素酶產(chǎn)物中酶種類和活性不同。

外源纖維素酶預(yù)處理（T2組）在孵育4 h后較T1組降低了15N殘留量，這表明外源纖維素酶在瘤胃發(fā)酵前水解降低了初始細(xì)菌定殖。Wang等（2004）發(fā)現(xiàn)，經(jīng)外源纖維素酶處理的大麥秸稈中酚類化合物較為集中。與對(duì)照組和T1組相比，外源纖維素酶水解后去除可溶性產(chǎn)物和纖維素酶底物的T3組15N殘留量較低，這也說(shuō)明外源纖維酶使大麥秸稈表面提高，進(jìn)而減慢了細(xì)菌附著速度。本研究發(fā)現(xiàn)，盡管外源纖維素酶處理對(duì)大麥秸稈發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性脂肪酸無(wú)顯著影響，但經(jīng)過(guò)水解預(yù)處理的外源纖維素酶組乙酸和丙酸比值較對(duì)照組降低，造成這一結(jié)果的原因還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

外源纖維分解酶可改善瘤胃細(xì)菌對(duì)纖維的消化能力，但其有效性取決于底物、細(xì)菌種類和孵育時(shí)間。在瘤胃孵育前將纖維素酶進(jìn)行預(yù)水解可以通過(guò)增加還原性糖的有效性來(lái)促進(jìn)微生物生長(zhǎng)。