中藥散劑在抗腫瘤轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)中的研究

魏華民 花寶金

摘要 目的：中藥散劑在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用較少，本研究重在對(duì)比中藥散劑和煎劑在腫瘤學(xué)常規(guī)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中的差異。方法：根據(jù)文獻(xiàn)及藥物特性制備雙參顆粒散劑、煎劑及醇提產(chǎn)物，體外實(shí)驗(yàn)對(duì)比醇提雙參顆粒散劑和傳統(tǒng)水煎劑對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞的影響；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察2種劑型對(duì)C57BL/6荷瘤小鼠肺轉(zhuǎn)移的抑制作用。結(jié)果：和傳統(tǒng)煎劑相比，雙參顆粒醇提產(chǎn)物對(duì)腫瘤細(xì)胞有更明顯的抑制增殖及遷移、促進(jìn)凋亡的作用，其優(yōu)勢(shì)在于抑制早期腫瘤生長(zhǎng)的作用，對(duì)肺轉(zhuǎn)移無(wú)顯著優(yōu)勢(shì)。結(jié)論：中藥散劑和傳統(tǒng)湯劑在腫瘤學(xué)常規(guī)實(shí)驗(yàn)中有較大差別，應(yīng)進(jìn)一步深入研究。

關(guān)鍵詞 中藥散劑；水煎劑；腫瘤

中圖分類號(hào)：R283.6；285.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2017.02.039

中藥散劑是傳統(tǒng)的中藥劑型之一，在臨床治療中有其特定的優(yōu)勢(shì)與不可替代性。但目前中藥相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中多為中藥煎煮灌胃，以散劑進(jìn)行的嚙齒類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究較少。而文獻(xiàn)提示：有些藥物的有效成分不溶于水或難溶于水，散劑作為彌補(bǔ)這一缺陷的重要方式缺乏相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究。本試驗(yàn)以雙參顆粒為例，對(duì)比了散劑與傳統(tǒng)水煎劑對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用差異及對(duì)荷瘤小鼠肺轉(zhuǎn)移的影響，發(fā)現(xiàn)散劑醇提產(chǎn)物與傳統(tǒng)湯劑相比對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖有更明顯的抑制作用，還可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡并抑制其遷移能力，并抑制早期腫瘤生長(zhǎng)，這不僅為散劑在臨床中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持，而且為探索中藥散劑在嚙齒類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中的進(jìn)一步應(yīng)用提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 Lewis腫瘤細(xì)胞購(gòu)自國(guó)家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享平臺(tái)，用高糖DMEM培養(yǎng)液（hyclone）加10%胎牛血清（Gibco）培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 動(dòng)物 SPF級(jí)C57 BL/6小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，雄性，19-21 g，飼養(yǎng)于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院動(dòng)物房，符合中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.3 藥物 1）雙參顆粒散劑飼料制備：西洋參、冬蟲夏草、三七（1：1：6）3種中藥飲片均由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院中藥房提供（產(chǎn)品批號(hào)412041）。3種藥物均經(jīng)紫外線聯(lián)合75%乙醇滅菌，衛(wèi)生質(zhì)量符合2000版《中華人民共和國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)。干燥溫度控制在30℃，干燥后用無(wú)菌粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎并過(guò)100目篩備用。按照小鼠進(jìn)食量4g/d（前期摸索結(jié)果）計(jì)算，將藥粉和小鼠飼料混合（散劑飼料濃度為4.5%）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，平均每只小鼠進(jìn)食藥物為180mg/d。2）雙參顆粒醇提產(chǎn)物制備：根據(jù)文獻(xiàn)，三七醇提2次，乙醇濃度85%，加醇倍量6 mL/g，提取時(shí)間7.5h；西洋參醇提2次，乙醇濃度為70%，加醇倍量8 mL/g，提取時(shí)間4 h；冬蟲夏草醇提2次，乙醇濃度為75%，加醇倍量為8 mL/g，提取時(shí)間為24h，提取溫度為23-25℃。各組提取產(chǎn)物均離心（2200 r/min）得到醇提產(chǎn)物，三者混合并調(diào)至合適細(xì)胞生長(zhǎng)的滲透壓及pH值即為雙參顆粒醇提物。3）傳統(tǒng)水煎劑即用去離子水煎煮3種按比例配置的藥材飲片，煎煮時(shí)間為1h，煎煮2次，將水煎劑濃縮至相應(yīng)體積，藥物濃度為180mg/200uL。

1.1.4 試劑 Cell Counting Kit-8試劑盒（DOJIN-DO，CK04-500）；Annexin V-FITC Apoptosis Detection試劑盒（ Abcam，ab14085）；Bouin's Fluid（江萊生物，DF0010）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 小鼠在動(dòng)物房適應(yīng)性喂養(yǎng)7d后，于實(shí)驗(yàn)前按體重對(duì)小鼠進(jìn)行分組，保證2組體重比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且散劑組采用單籠飼養(yǎng)，以精確計(jì)算小鼠食量。取1X106對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于C57BL/6小鼠背部皮下構(gòu)建小鼠肺癌模型。

1.2.2 給藥方法 傳統(tǒng)水煎劑組（n=20），每只小鼠每天灌胃200 uL雙參顆粒水煎劑；散劑組（n=20），由動(dòng)物自由進(jìn)食，每天稱飼料重量，計(jì)算小鼠實(shí)際進(jìn)食藥量。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 觀察24h、48h、72h細(xì)胞增殖、凋亡和遷移情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，將處死小鼠肺部病灶制成病理切片，置于顯微鏡下拍照觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.o軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，2組之間計(jì)數(shù)資料比較采用兩樣本間t檢驗(yàn)，采用log-rank檢驗(yàn)比較2組生存時(shí)間，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物一般情況 2組動(dòng)物觀察共35d，觀察期間2組體重、動(dòng)物活動(dòng)能力、皮毛光澤及平均進(jìn)食量未見明顯差異。未觀察到動(dòng)物不良反應(yīng)，未出現(xiàn)動(dòng)物異常損失情況。

2.2 體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

2.2.1 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 采用相同藥物濃度（25uguL）的醇提產(chǎn)物及傳統(tǒng)水煎劑進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如下：2組藥物在24h對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)未見明顯差異，在48h及72h時(shí)，醇提組和水煎劑對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率分別從（0.25±0.02），（0.56±0.03）上升至（0.27±0.02）和（0.89±0.02），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。

注：A上3圖分別為24h、48h、72h醇提散劑組細(xì)胞增殖情況；A下3圖分別為24h、48h、72h傳統(tǒng)湯劑組細(xì)胞增殖情況。

2.2.2 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 我們進(jìn)一步研究了2組不同制劑對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響，其中在24h即表現(xiàn)出明顯的差異，如圖2所示，24h中藥干預(yù)和正常組比較，水煎劑組對(duì)腫瘤細(xì)胞的凋亡略顯促進(jìn)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而醇提組腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出較明顯的早期凋亡，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002）。

注：上圖左、右及下圖左側(cè)分別為正常組、傳統(tǒng)煎劑組和醇提散劑組；下圖右側(cè)為2組藥物對(duì)細(xì)胞凋亡率比較。

2.2.3 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 腫瘤細(xì)胞的遷移能力是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要條件，所以評(píng)估腫瘤細(xì)胞遷移是腫瘤常規(guī)實(shí)驗(yàn)中的重要環(huán)節(jié)。我們分析了24、48、72 h3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，觀察2種制劑對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移的影響，圖3為72h時(shí)正常組、水煎劑組及醇提組的圖片。Imagepro plus軟件分析提示：三者的遷移距離分別為：（300.67±21.31），（150.33±15.11）及（584.67±85.85），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001）。

注：A上3圖分別為Oh正常組、傳統(tǒng)煎劑組和醇提散劑組的細(xì)胞劃痕圖片；A下3圖分別為3組72h時(shí)劃痕實(shí)驗(yàn)圖片。

2.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.3.1 抑瘤效果及對(duì)小鼠生存期的影響 觀察至接瘤后35d，2組小鼠實(shí)際進(jìn)食藥物量分別為散劑162 mg/d和水煎劑180 mg/d（P=0.000）。2組抑制腫瘤早期生長(zhǎng)差異顯著（圖4），其中第14天差異最大（P=0.010），之后隨著腫瘤的不斷長(zhǎng)大，2組之間差異逐漸消失。生存期方面，2組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.635）。

注：左圖片2組腫瘤體積比較（長(zhǎng)x寬2），右圖為生存時(shí)間（綠色部分為傳統(tǒng)水煎劑，褐色部分為散劑）。

2.3.2 對(duì)肺轉(zhuǎn)移的影響 接種GFP、Lewis腫瘤細(xì)胞第35天時(shí)取小鼠肺切片，熒光顯微鏡觀察2組肺轉(zhuǎn)移的熒光值及相對(duì)面積，散劑組平均熒光值為（15.35±0.53），熒光面積比例（%Area）為（54.51±2.15）。水煎劑組為（15.48±0.37）和（57.51±0.73）。無(wú)論是熒光值還是熒光面積比較，2組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.8071和P=0.2023）。見圖5。

注：A圖為散劑組，B圖為水煎劑組，C圖為2組熒光值及面積比較。

3 討論

雙參顆粒是中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院花寶金教授研制的用于肺癌術(shù)后抗復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的中藥散劑，在臨床取得較好的效果并申請(qǐng)國(guó)家專利。我們以該藥為例，從動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，中藥散劑具有傳統(tǒng)湯劑不可替代的作用。

中藥散劑屬于中藥傳統(tǒng)劑型之一，古書中有“散者散也，去疾病用之”的說(shuō)法。中藥成分復(fù)雜，有些藥物的有效成分不溶于水或難溶于水，必須直接吞服藥粉，通過(guò)消化道分解吸收。有些藥物不能高溫煎熬，有效成分容易破壞；有些貴重藥物只有通過(guò)吞服才能確保療效又不造成浪費(fèi)。散劑的藥物面積大，與溶媒的接觸面大，具有易分散、奏效快的特點(diǎn)，有效成分易溶出，與湯劑相比，更省藥材而療效不減。散劑在臨床應(yīng)用中具有一定的不可替代性，實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)五苓散散劑比湯劑在利水消腫方面療效顯著，基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)證實(shí)：五苓散湯劑中低極性化學(xué)成分較散劑中嚴(yán)重缺失，可能是其臨床療效差異的主要原因。

雖然目前臨床應(yīng)用散劑相對(duì)廣泛，但基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用散劑較多的集中于獸醫(yī)學(xué)，臨床醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)涉及的中藥散劑較少，不能反映散劑在治療疾病中的真正價(jià)值。我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，雙參顆粒散劑雖然在延長(zhǎng)荷瘤小鼠生存期及肺轉(zhuǎn)移方面未顯示出優(yōu)于傳統(tǒng)煎劑的價(jià)值，但病理切片提示，散劑明顯抑制微觀轉(zhuǎn)移灶的形成，且細(xì)胞實(shí)驗(yàn)提示其具有傳統(tǒng)湯劑不具備的對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用，這可能與高溫對(duì)皂苷成分有一定的破壞作用有關(guān)，也可能與不同條件下藥物析出成分差異有關(guān)。這提示我們，對(duì)于不同的疾病，應(yīng)采用不同的劑型，以保證藥物發(fā)揮最佳的效應(yīng)。當(dāng)然本研究只是采用了散劑的傳統(tǒng)制備方法來(lái)說(shuō)明問(wèn)題，最近散劑劑型已經(jīng)有了新的發(fā)展，如超微粉體技術(shù)就是較傳統(tǒng)散劑更有效的現(xiàn)代綜合技術(shù)，不僅使藥材破壁率大大提高，還能加快固體藥物的溶解、釋放，提高生物利用度，提高臨床療效。此外，中藥粒子設(shè)計(jì)技術(shù)及中藥超微速溶飲片也為散劑的研究提供了新的研究思

路。這些新技術(shù)均應(yīng)在臨床基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中得到廣泛研究，避免只用傳統(tǒng)湯劑進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)而不能充分顯示中醫(yī)中藥的治療效果。

本實(shí)驗(yàn)只初步評(píng)估了散劑較傳統(tǒng)湯劑的優(yōu)勢(shì)作用，但仍存在一下缺點(diǎn)：1）雙參顆粒臨床中用于肺癌術(shù)后患者，可能是本試驗(yàn)在延長(zhǎng)生存期及肺癌轉(zhuǎn)移方面未得出陽(yáng)性結(jié)果的主要原因，針對(duì)肺癌術(shù)后小鼠的實(shí)驗(yàn)可能更能顯示出散劑的優(yōu)勢(shì)。2）本實(shí)驗(yàn)提示，中藥治療腫瘤的優(yōu)勢(shì)在于腫瘤負(fù)荷較輕時(shí)，針對(duì)無(wú)腫瘤負(fù)荷給藥即腫瘤轉(zhuǎn)移前微環(huán)境給藥可能得到更好的效果。3）本實(shí)驗(yàn)未能進(jìn)行中藥質(zhì)譜分析，對(duì)中藥進(jìn)行精確的含量控制可為以后藥物提純及新藥開發(fā)提供更可靠的基礎(chǔ)。

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（2017-01- 11收稿 責(zé)任編輯：王明）