不同榆樹無(wú)性系對(duì)低溫脅迫的生理響應(yīng)及抗寒性評(píng)價(jià)

王力源，麻蕓嬌，李文杰，劉興菊,梁海永

(1河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，河北 保定 071000；2河北省林木種質(zhì)資源創(chuàng)新與保護(hù)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071000)

對(duì)于高等植物來(lái)說(shuō)，環(huán)境溫度是影響植物存活和生長(zhǎng)發(fā)育的重要因素之一，低溫脅迫通常明顯大于其他環(huán)境因素脅迫[1-3]。1930 年，Dexter 首次將電導(dǎo)法用來(lái)研究植物的抗寒性，此后該方法不斷改進(jìn)發(fā)展，電導(dǎo)法已經(jīng)成為研究抗寒性強(qiáng)弱的主要方法[4]，此外前人還對(duì)各種植物抗寒性研究提出許多方法。相關(guān)研究表明，可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、游離脯氨酸含量、抗逆酶含量和電導(dǎo)率等與植物的抗寒性有密切相關(guān)。馬曉蕊等研究表明，植物組織中可溶性糖含量越高，植物組織細(xì)胞液的滲透壓越高，植物抗寒性越強(qiáng)[5]。田介云等研究表明，仁用杏在低溫過(guò)程中的抗寒性強(qiáng)弱與植物組織中可溶性蛋白含量密切相關(guān)[6]。韓立群等認(rèn)為植物在受到低溫脅迫的時(shí)候，游離脯氨酸含量發(fā)生明顯變化，因此表明低溫脅迫會(huì)對(duì)植物組織中游離脯氨酸含量產(chǎn)生影響[7]。悅沖認(rèn)為植物的抗寒性與游離脯氨酸含量密切相關(guān)[8]。歐歡對(duì)不同扁桃品種的枝條進(jìn)行低溫脅迫，發(fā)現(xiàn)抗逆酶活性的升高與降低，可以反映扁桃的抗寒性強(qiáng)弱[9]。

榆樹(UlmuspumilaL.)為榆屬植物的總稱，約有 40 余種，主要分布于歐洲、亞洲和美洲，我國(guó)有24 種，南北均可生長(zhǎng)。榆樹為陽(yáng)生樹種，喜光，抗寒，耐旱，耐瘠薄，對(duì)氣候、土壤等適應(yīng)性較強(qiáng)，榆樹曾是我國(guó)北方五大闊葉造林樹種之一，也是河北主要的鄉(xiāng)土樹種之一，由于其根系發(fā)達(dá)，枝葉繁茂，且具有良好的抗寒抗旱、耐鹽堿、抗病和抗風(fēng)性，壽命長(zhǎng)，在水分匱乏的沙地和沙丘上能生長(zhǎng)，使得榆樹成為我國(guó)北方廣大平原、干旱草原、濱海鹽堿地、沙荒地營(yíng)造用材林和防護(hù)林的重要樹種[10-11]。我國(guó)北方氣候冬季寒冷干燥，早春易出現(xiàn)大風(fēng)天氣，多數(shù)林木不易成活，因此收集并選育抗寒性強(qiáng)、生長(zhǎng)迅速的榆樹新品種，是解決北方樹木凍害的關(guān)鍵。近些年來(lái)，作為北方寒冷地區(qū)造林的理想樹種，關(guān)于榆樹的研究越來(lái)越受到廣泛的重視。

為此，以來(lái)自 3 個(gè)榆樹種的 9 個(gè)無(wú)性系為研究材料，通過(guò)對(duì)比不同低溫處理下，各榆樹枝條的生理響應(yīng)，運(yùn)用隸屬函數(shù)法進(jìn)行抗寒性綜合評(píng)定，比較不同榆樹無(wú)性系的抗寒性強(qiáng)弱，探討榆樹在寒冷環(huán)境下，產(chǎn)生的生理變化，旨在為榆樹育種雜交親本選擇提供依據(jù)，對(duì)選育有較強(qiáng)抗寒性的榆樹無(wú)性系提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理

于2018年12月-2019年2月，在張家口涿鹿的苗圃基地選取砧木相同的白榆(D1520、D1507、D1526)；黑榆(D2、H1506、D28)；春榆(Y1、B19、Y3)等3個(gè)樹種共9個(gè)無(wú)性系，每個(gè)無(wú)性系選取3株長(zhǎng)勢(shì)相同的3 a生嫁接苗資源進(jìn)行試驗(yàn)，對(duì)其不同榆樹無(wú)性系的1 a生枝條進(jìn)行研究，盡量保證枝條的各方面一致性，以保證試驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)材料采集 采集樹冠南側(cè)，直徑 0.8 cm～1.0 cm的枝條，每株枝條數(shù)量相同。材料采集回來(lái)以后，把枝條剪成 20 cm左右，同一無(wú)性系枝條混合均勻，并將材料進(jìn)行清洗，去除表面塵土等污染物，再用干凈紗布輕輕吸干枝條上的水分，然后在枝條兩端涂抹凡士林，防止水分流失，每個(gè)無(wú)性系平均分成5份，每份分得3個(gè)枝條，用濕紗將分好的枝條布包起來(lái)，分別置于 4 ℃、 -10 ℃、 -20 ℃、 -30 ℃、 -40 ℃的冰箱中，進(jìn)行的低溫脅迫處理。處理 24 h 后，取出在 4 ℃ 放置 24 h 進(jìn)行解凍。

1.2.2 抗寒性生理指標(biāo)方法 采用李合生的試驗(yàn)方法測(cè)定榆樹枝條的各種生理指標(biāo)[12]。

細(xì)胞膜透性試驗(yàn)處理，細(xì)胞膜透性采用電導(dǎo)法測(cè)定：將不同溫度梯度下 3 個(gè)枝條剪切成2～3 cm小段，稱取質(zhì)量(3次重復(fù))，按照0.1 g枝段加水20 g加入蒸餾水，真空處理40 min，靜止20 min，用電導(dǎo)率儀測(cè)量初始電導(dǎo)及空白水電導(dǎo)測(cè)定，之后放入水浴鍋100 ℃煮沸20 min，取出靜止12 h，進(jìn)行終止電導(dǎo)及處理后空白水測(cè)定，計(jì)算枝條相對(duì)電導(dǎo)率[13]。

酶液制備：將不同溫度梯度下 3 個(gè)枝條的韌皮部剪碎混合均勻，準(zhǔn)確稱取 0.3 g (3次重復(fù))，置于預(yù)冷的研缽中，先加 2 mL 50 mmol/L pH =7.8磷酸緩沖液，少許石英砂，快速而充分的研磨成勻漿狀態(tài)，再用 6 mL磷酸緩沖液清洗干凈，搖勻。在 10 000 rpm冷凍( 4 ℃ )離心 20 min，離心結(jié)束后，上清液為可溶性蛋白、POD、 SOD 、CAT和 MDA粗提酶液，倒出來(lái)放入提前標(biāo)記好的離心管中讀取上清液體積并記錄，于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

自然越冬指標(biāo)：硫代巴比妥酸(TBA)法測(cè)定丙二醛含量；可溶性蛋白的測(cè)定使用考馬斯亮藍(lán) G-250 染色法；對(duì)游離脯氨酸進(jìn)行磺基水楊酸提取，茚三酮顯色法測(cè)定；蒽酮顯色法測(cè)定可溶性糖含量。

低溫脅迫指標(biāo)：細(xì)胞膜透性采用電導(dǎo)法測(cè)定[13]；抗逆酶活性測(cè)定：氮藍(lán)四唑法(SOD)、紫外吸收法(CAT)，愈創(chuàng)木酚法(POD)。

1.2.3 半致死溫度計(jì)算及生理指標(biāo)分析 采用孫宜等的方法將相對(duì)電導(dǎo)率擬合 Logistic 曲線方程[14]：

y=k/ (1+ae-bt)

(1)

式(1)中y為相對(duì)電導(dǎo)率；t為溫度梯度；k為極限相對(duì)電導(dǎo)率，為100%；a和b為待定系數(shù)。對(duì)式(1)求二階導(dǎo)數(shù)，并令其為零，得式(2)：

t=lna/b

(2)

式(2)為相對(duì)電導(dǎo)率隨溫度下降而增加最快時(shí)的溫度，即LT50(或組織崩潰點(diǎn))依據(jù)式(1)和(2)計(jì)算低溫半致死溫度LT50。

利用Excel 2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和相關(guān)性分析；運(yùn)用 SPSS 20 軟件進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)(P=0.05)以及主成分分析。運(yùn)用隸屬函數(shù)法，對(duì)各指標(biāo)求得的隸屬值進(jìn)行累加、取平均數(shù)。按照從大到小的順序?qū)Ω鱾€(gè)樹種的反隸屬函數(shù)平均值進(jìn)行排序，可對(duì)各榆樹無(wú)性系進(jìn)行抗寒性綜合評(píng)價(jià)。

3 結(jié)果與分析

3.1 低溫脅迫下各榆樹無(wú)性系生理指標(biāo)

3.1.1 不同榆樹枝條相對(duì)電導(dǎo)率的變化情況 在低溫脅迫下，9個(gè)無(wú)性系枝條的相對(duì)電導(dǎo)如圖1。

圖1 低溫脅迫下各榆樹無(wú)性系相對(duì)電導(dǎo)率變化趨勢(shì)Figure 1 The changes in relative conductivity of Ulmus clonesunder low temperature stress

圖1可知，隨著脅迫溫度的降低，9 個(gè)無(wú)性系枝條的相對(duì)電導(dǎo)率逐漸增大(圖1)， 但各無(wú)性系相對(duì)電導(dǎo)率的變幅不同?？傮w上看，9 個(gè)無(wú)性系的相對(duì)電導(dǎo)率均呈“緩慢升高—迅速升高—平穩(wěn)升高”的“ S ” 型曲線，其中從常溫到 -30 ℃ 相對(duì)電導(dǎo)率變化幅度不大，-30～-40 ℃ 相對(duì)電導(dǎo)率快速增加，變幅較大 。枝條細(xì)胞膜受害越嚴(yán)重是相對(duì)電導(dǎo)率變化幅度越大的主要原因，表明該榆樹無(wú)性系對(duì)低溫更敏感，可以初步推測(cè)：D1520的抗寒性最強(qiáng)，D1507 、 D1526 、 D2 、 H1506 、Y1、B19 的抗寒性次之， Y3、 D28的抗寒性較弱。榆樹各無(wú)性系的拐點(diǎn)在 -30～-40 ℃ 之間。

通過(guò)人工低溫處理下的相對(duì)電導(dǎo)率變化曲線結(jié)合Logistic方程，可以擬合出D1520、D1507、D1526、D2、H1506、Y1、B19、Y3、D28的拐點(diǎn)溫度來(lái)表示半致死溫度見表 1。

表1 榆樹各無(wú)性系的半致死溫度Table 1 The semi-lethal temperature of each Ulmus clone

依據(jù)表 1中數(shù)據(jù)可見: 9 個(gè)無(wú)性系 Logistic 方程的相關(guān)系數(shù)為 0.958～0.996，均達(dá)到顯著(P<0.05) 或極顯著(P<0.01) 水平。同時(shí)可得出D1520的半致死溫度為 -40.83 ℃，D28的半致死溫度為 -33.67 ℃；因半致死溫度越高，抗寒性越弱，半致死溫度越低，說(shuō)明其忍耐低溫的能力越強(qiáng)，因此我們根據(jù)表1中數(shù)據(jù)可以得到榆樹不同無(wú)性系抗寒性強(qiáng)弱依次為：D1520 、 D1507 、 D1526 、 D2 、 H1506 、 Y1 、 B19、 Y3、 D28。由此可知無(wú)性系D1520、D1507的抗寒性較強(qiáng)，Y3、D28 抗寒性較差,進(jìn)而初步確定抗寒性白榆>黑榆>春榆。

3.1.2 低溫脅迫對(duì)不同榆樹抗逆酶酶活性的影響 在低溫脅迫下，參試的 9 種榆樹POD 活性測(cè)定結(jié)果見圖2。

圖2 低溫脅迫下各榆樹無(wú)性系POD活性的變化Figure 2 The changes in POD activity of various Ulmusclones under low temperature stress

圖2可知，在整個(gè)低溫處理過(guò)程中，D1520 、D1507系列的POD活性處于較高水平，而Y3的POD活性較低。 D1520 、D1507 、D2、 H1506 、 D28等榆樹無(wú)性系從常溫到 -10 ℃ 時(shí)，POD活性開始升高，從 -10～-40 ℃ 時(shí)出現(xiàn)下降趨勢(shì)；Y1系列從常溫到 -10 ℃ 時(shí)，POD活性變化比較平緩，在從 -10～-20 ℃ 時(shí)出現(xiàn)開始升高，之后出現(xiàn)下降趨勢(shì)；B19 和 Y3 系列從低溫脅迫開始POD 活性就一直明顯的下降；D1526 系列從低溫脅迫則從開始POD 活性就一直在上升。

在低溫脅迫下，參試的9種榆樹SOD活性測(cè)定結(jié)果見圖3。

圖3 低溫脅迫下各榆樹無(wú)性系SOD活性的變化Figure 3 The changes in SOD activity of various Ulmusclones under low temperature stress

由圖3可知，在整個(gè)脅迫處理過(guò)程中，D1520的SOD活性在-20℃達(dá)到高值，是所有無(wú)性系中最高的；而Y1的SOD活性的高值出現(xiàn)在-10 ℃，比所有無(wú)性系均低；Y3在 -30～-40 ℃ 時(shí)，酶活性基本沒變。D1507、 D1526 、 D2 、H1506 、Y1 、 Y3、D28系列從常溫到 -10 ℃ 時(shí)，SOD活性開始升高，從-10～-40 ℃ 時(shí)，SOD活性一直在明顯下降。D1520 和B19系列從常溫到 -20 ℃ 時(shí)，SOD 活性呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，從-20～-40 ℃ 時(shí)，SOD 活性則開始下降。

在低溫脅迫下，參試的9種榆樹CAT活性測(cè)定結(jié)果見圖4。

圖4 低溫脅迫下各榆樹無(wú)性系CAT活性的變化Figure 4 The changes in CAT activity of various Ulmusclones under low temperature stress

由圖4可知，在整個(gè)低溫處理過(guò)程中，D1526、D1507以及D1520的CAT活性處于較高水平，而D28、Y1的CAT活性較低，榆樹各無(wú)性系從常溫到-10℃時(shí)，CAT活性開始小幅度上升；從-10～-20℃時(shí)，除D1507出現(xiàn)上升情況外，其余各無(wú)性系均呈現(xiàn)小幅度降低；除H1506外，從-20～-30℃大多無(wú)性系均緩慢下降，溫度繼續(xù)降至-40℃時(shí)，CAT活性明顯下降。

3.2 越冬期間各榆樹無(wú)性系部分生理指標(biāo)

3.2.1 越冬期間各榆樹無(wú)性系可溶性糖和可溶性蛋白含量變化 不同月份中，參試的9種榆樹無(wú)性系可溶性糖含量測(cè)定結(jié)果見圖5，可溶性蛋白含量測(cè)定結(jié)果見圖6。

圖5 不同月份各榆樹無(wú)性系的可溶性糖含量Figure 5 The soluble sugar content of each Ulmusclone in different months

圖6 不同月份各榆樹無(wú)性系的可溶性蛋白含量Figure 6 The soluble protein content of each Ulmusclone in different months

由圖5可知，可以看出各榆樹無(wú)性系的可溶性糖含量在冬季均在升高，其中D1520、D1526上漲較快，二月份漲幅分別為71.37%、74。20%；Y1、D28均上漲較慢，漲幅分別為15.91%、17.41%；而Y3甚至出現(xiàn)下降現(xiàn)象，下降了19.45%。

由圖6可知，可以看出，除D1526和D28出現(xiàn)下降外，各榆樹無(wú)性系的可溶性蛋白含量在冬季均在升高，其中D1507上漲較快，上漲了39.67%；Y1均上漲較慢為6.53%，而D28甚至出現(xiàn)下降現(xiàn)象，降幅為11.24%。

3.2.2 越冬期間各榆樹無(wú)性系游離脯氨酸與MDA含量變化 在越冬期間的不同月份中，參試的9種榆樹游離脯氨酸含量測(cè)定結(jié)果見圖7。

圖7 不同月份各榆樹無(wú)性系的游離脯氨酸含量Figure 7 The free proline content of Ulmus clonesin different months

由圖7可知，可以看出各榆樹無(wú)性系的游離脯氨酸含量在冬季均在升高，其中Y3、Y1上漲較快，在2月份漲幅分別為85.44%、64.61% ；D1520與D1507均上漲較慢，在2月份漲幅分別為38.95%、36.03%。

MDA活性測(cè)定結(jié)果見圖 8。

圖8 不同月份各榆樹無(wú)性系的丙二醛含量Figure 8 The MDA content of each Ulmus clonein different months

由圖8可知，由圖8可知，在各種榆樹無(wú)性系，除D2、Y1、先上升后下降，其余無(wú)性系均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，但是D1520、D1507和D1526趨勢(shì)不明顯；而Y3及D28上漲趨勢(shì)較大。在整個(gè)冬月中，Y3的MDA活性均處于較高水平，而D1526、D1507的MDA活性較低。

4 利用隸屬函數(shù)法進(jìn)行抗寒性綜合評(píng)定

植物抗寒性是一個(gè)復(fù)雜的生理生化過(guò)程，受多種因素的影響，單一指標(biāo)很難反應(yīng)抗寒本質(zhì)，采用模糊數(shù)學(xué)中的隸屬函數(shù)的方法，以9個(gè)榆樹無(wú)性系枝條1月份的低溫脅迫下對(duì)照組相對(duì)電導(dǎo)率、SOD、POD、CAT以及可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、游離脯氨酸含量、MDA的平均隸屬函數(shù)值，得隸屬函數(shù)加權(quán)平均值作為植物種抗寒性的綜合評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，消除了個(gè)別指標(biāo)帶來(lái)的片面性，目前這一方法已廣泛應(yīng)用[15]。不同榆樹各指標(biāo)隸屬函數(shù)值和綜合評(píng)定結(jié)果見表2。

綜合評(píng)定值越大，說(shuō)明其抗寒性越強(qiáng)，在表2中可以發(fā)現(xiàn)D1520 這個(gè)無(wú)性系抗寒性最強(qiáng)，D28抗寒性最弱，9種榆樹無(wú)性系抗寒性由強(qiáng)到弱依次為：D1520、 D1507、 D1526、D2、H1506、 Y1、 B19、 Y3、 D28。

表2 不同榆樹各指標(biāo)隸屬函數(shù)值和綜合評(píng)定結(jié)果Table 2 The membership function values and comprehensive evaluation results of different indicators of different Ulmus

5 結(jié)論與討論

可溶性糖和可溶性蛋白是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物，有研究表明，在低溫條件下，植物可通過(guò)滲透調(diào)節(jié)作用減輕傷害，同時(shí)與生物膜系統(tǒng)有關(guān)的相對(duì)電導(dǎo)率、MDA 含量會(huì)呈現(xiàn)增加趨勢(shì)[16-17]。本試驗(yàn)研究可知，對(duì)于越冬階段，參試的榆樹無(wú)性系韌皮部中可溶性糖含量，抗寒性強(qiáng)的無(wú)性系可溶性糖含量明顯高于抗寒性差的無(wú)性系，這與韓俊威[18]研究結(jié)果相一致；榆樹無(wú)性系的可溶性蛋白含量呈增加趨勢(shì)，抗寒性強(qiáng)的品種增加幅度大，抗寒性差的品種增加幅度小，與在核桃[19]和山楊[20]上的研究結(jié)果相一致，存在略微差異可能是在試驗(yàn)過(guò)程中的不嚴(yán)謹(jǐn)導(dǎo)致的。結(jié)果表明在越冬期間，可溶性糖和可溶性蛋白發(fā)揮著滲透調(diào)節(jié)作用。在相同月份下，參試的不同榆樹無(wú)性系枝條韌皮部可溶性糖和可溶性蛋白含量與相對(duì)電導(dǎo)率均呈顯著正相關(guān)(R2=0.967，R2=0.952 )，游離脯氨酸含量及 MDA 含量與榆樹無(wú)性系的相對(duì)電導(dǎo)率呈負(fù)相關(guān)(R2=0.984，R2=0.632)，這與前人在紫薇上的研究結(jié)果一致[21]。

不同低溫脅迫下的電導(dǎo)率和抗逆酶活性受溫度影響較大，SOD 能夠清除活性氧，使其生成氧氣與過(guò)氧化氫，再通過(guò) CAT 與 POD 分解過(guò)氧化氫，從而保護(hù)細(xì)胞免受活性氧的傷害[22-24]。大量研究發(fā)現(xiàn)，植物體在受到脅迫后，其體內(nèi)抗逆酶活性有升有降，且呈現(xiàn)出抗性強(qiáng)無(wú)性系活性高于抗性弱無(wú)性系的現(xiàn)象[25]。本試驗(yàn)中，榆樹無(wú)性系的SOD 、POD 和 CAT 活性的相關(guān)性較好，說(shuō)明三者存在密切的互作關(guān)系；并且，抗寒性強(qiáng)的品種其 SOD、POD、CAT 活性較高，抗寒性弱的品種其 SOD、POD、CAT 活性較低，這與前人在仁用杏[27]和蘋果[28]上的研究結(jié)果一致?？鼓婷富钚栽谝欢沙惺軠囟确秶鷥?nèi)，其活性呈現(xiàn)出小幅度上升趨勢(shì)，但是達(dá)到一定低溫時(shí)，其活性也會(huì)降低。

植物的可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、游離脯氨酸含量、SOD 酶活性、POD 酶活性、CAT 酶活性、丙二醛質(zhì)量摩爾濃度等指標(biāo)均與植物的抗寒性強(qiáng)弱息息相關(guān)，但單獨(dú)依據(jù)一個(gè)指標(biāo)不能直接判斷不同無(wú)性系的抗寒性強(qiáng)弱。因此，在評(píng)定植物抗寒性時(shí)應(yīng)考慮多方面指標(biāo)，并不能靠單一指標(biāo)來(lái)判斷[28-30]，隸屬函數(shù)法就是普遍采用的抗性綜合評(píng)價(jià)方法[29]。在越冬期間不同榆樹無(wú)性系間生理變化存在顯著性差異，說(shuō)明不同無(wú)性系抗寒性不同，根據(jù)越冬抗寒指標(biāo)相關(guān)性并采用模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)的方法，綜合評(píng)價(jià) 9個(gè)無(wú)性系的冬季越冬抗寒性的大小，得出綜合抗寒性由強(qiáng)到弱依次為：D1520、 D1507、 D1526、 D2、 H1506、 Y1、 B19、 Y3、 D28，這與榆樹無(wú)性系枝段的半致死溫度排名相一致。本試驗(yàn)是在離體條件下測(cè)定某一月份枝段的相對(duì)電導(dǎo)率，獲得的 LT50值與采樣時(shí)天氣及是否經(jīng)過(guò)低溫鍛煉有關(guān)，雖然 LT50值不一定能確切反映榆樹各無(wú)性系的抗寒性，但是可以快速評(píng)價(jià)取樣時(shí)各無(wú)性系的抗寒性差異。

綜上所述，依據(jù)9個(gè)榆樹無(wú)性系的抗寒性的排序結(jié)果可以在不同嚴(yán)寒氣候區(qū)域優(yōu)先選擇種植抗性較強(qiáng)的無(wú)性系。其中，無(wú)性系D1520具有較強(qiáng)的抗寒性，可以嘗試在北方比較寒冷的高山和荒漠地區(qū)推廣種植。另外，還可以將抗性較強(qiáng)的無(wú)性系作為雜交育種的親本，有利于雜交后代增加抗性的積累，并極有可能培育出抗性更高的新無(wú)性系。